響應面法優化灰兜巴多肽脫色工藝

李 錦,許 偉,邵 榮,顏秀花,韋 萍

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 210009;2.鹽城工學院化學與生物工程學院,江蘇鹽城 224051)

響應面法優化灰兜巴多肽脫色工藝

李 錦1,2,許 偉2,邵 榮2,顏秀花2,韋 萍1,*

(1.南京工業大學生物與制藥工程學院,江蘇南京 210009;2.鹽城工學院化學與生物工程學院,江蘇鹽城 224051)

本文以灰兜巴蛋白的酶解液為原料,首次采用粉末活性炭對多肽液進行脫色處理,去除灰兜巴多肽液中的色素,以利于生物活性多肽的分離純化。在單因素實驗的基礎上,用響應曲面法優化灰兜巴酶解液的脫色工藝。實驗結果表明脫色劑為粉末活性炭時脫色效果最佳,其工藝參數為:pH3.3、活性炭用量1.6%、溫度44℃、時間53min。在此條件下,灰兜巴蛋白酶解液的脫色率為73.12%,肽回收率為82.49%,與理論值相接近。該脫色工藝簡單可靠,脫色效果好,且最大限度的保留了灰兜巴蛋白酶解液中的多肽含量,為開發灰兜巴多肽提供理論基礎。

灰兜巴多肽,粉末活性炭,脫色,響應曲面法

灰兜巴是一種在海拔1500米以上的峨眉山深處老茶樹林中以紅蜘蛛吐的絲筑成的巢穴。它建成的巢穴外形像一個灰色的布袋,因此又稱之為閉口袋[1-2]。伍艷[3]等人發現灰兜巴中含有蛋白質等生物活性物質。但是隨著生物技術和營養學的發展,發現分子量介于蛋白質和氨基酸之間的多肽具有很強的生物活性,具有優良的營養價值、生理特性,更利于人體的消化吸收[4]。生物活性多肽是由多個氨基酸通過肽鍵鏈接而成的[5]。灰兜巴多肽是灰兜巴蛋白經過酶解、滅活、提純、濃縮等工藝得到的小分子多肽混合物。前期研究發現,灰兜巴多肽液,即灰兜巴蛋白酶解液,原色為棕黃色或褐色,里面可能含有多肽、色素、糖類等物質,如果作為藥物或者食品添加劑,其色澤不易被人們接受且色素顏色可能會帶來不利的影響,也不利于后續的分離純化。目前,能對多肽液進行有效脫色的脫色劑有:復合吸附劑[6]、大孔樹脂[7]、強堿性陰離子樹脂[8]、粉末活性炭[9]、顆粒狀活性[10]等。其中粉末活性炭價格便宜,吸附速度快且具有良好的吸附性能,化學性能穩定,可以耐強酸、強堿、高溫等,比表面積大,可以達到1000～1500m2/g,屬于多孔性的疏水性吸附劑,其特有的多孔結構對吸附色素具有一定的飽和度[11],常用于脫色、除臭、除味等方面[12]。關晴[13]等人在黃豆醬多肽原液脫色及抗氧化活性研究中,用粉末活性炭對其進行脫色,其脫色率為59.85%,多肽的存留率為66.35%。本文采用四種不同的脫色劑對灰兜巴蛋白的酶解液進行脫色處理,以脫色率和多肽的回收率作為考察指標,選擇適合灰兜巴酶解液的脫色劑,考察該脫色劑對灰兜巴多肽液的脫色影響,并運用響應面法對脫色工藝進行優化,為灰兜巴多肽的分離純化、生物活性的鑒定奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

灰兜巴 成都張坤成中藥材行;灰兜巴蛋白酶解液 實驗室自制(灰兜巴粗蛋白經復合蛋白酶酶解所得到的溶液);復合蛋白酶(活力≥120U/mg) 上海源葉生物科技有限公司;五水硫酸銅(AR)上海中試化工總公司;粉末活性炭、顆粒活性炭 上海源葉生物科技有限公司;硅藻土 吉林省臨江市大華硅藻土產品有限公司;濃硫酸、氫氧化鈉(AR)、雙氧水(30%) 江蘇彤晟化學試劑有限公司;去離子水 實驗室自制。

津騰T-50溶劑過濾器 天津市津騰實驗設備有限公司;RE-2000B 旋轉蒸發器 上海雅榮生化設備儀器有限公司;752紫外可見分光光度計 上海佑科儀器有限公司;AUY220電子天平 日本島津公司;TGLL-18K高速冷凍離心機 太倉市華美生化儀器廠;冷凍干燥機 北京博醫康實驗設備有限公司;恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 工藝流程 灰兜巴蛋白在時間3.50h,溫度40℃,pH6.7,加酶量5300U/g,底物濃度為6%的條件下用復合蛋白酶進行酶解反應→酶解液經0.45μm的微濾膜微濾除菌預處理→脫色→過濾→離心(10000r/min,4℃,10 min)→檢測上清液

1.2.2 脫色率 灰兜巴多肽液的顏色為棕黃色或褐色,在波長200～800nm下進行全波長掃描,確定其最大吸收峰的波長,然后在此波長下測定多肽液脫色前后的吸光度值,脫色率按下式計算[9]:

式中:A1為脫色前溶液的吸光度值;A2為脫色后溶液的吸光度值。

1.2.3 多肽回收率

1.2.3.1 標準曲線的繪制 標準曲線參考文獻[14]中的方法并略作修改,以牛血清標準蛋白濃度為橫坐標,540nm的OD值為縱坐標,制作標準曲線。

1.2.3.2 回收率的測定 將脫色前后的多肽液,與雙縮脲反應,在540nm處測定OD值,代入標準曲線,計算多肽含量,多肽回收率按下式計算[9]:

式中:B1為脫色前溶液中多肽的含量;B2為脫色后溶液多肽的含量。

1.2.4 脫色劑的選擇 考察粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土和雙氧水這四種脫色劑對灰兜巴酶解液的脫色效果,在相同的條件下對灰兜巴酶解液進行脫色處理,以脫色率和多肽回收率作為參考指標,選擇出用于灰兜巴酶解液的最優脫色劑。每種脫色劑分別做3次平行實驗,取平均值。

1.2.5 單因素實驗 取一定量的灰兜巴酶解液,分別研究不同的pH、活性炭用量、溫度和時間對脫色率和多肽回收率的影響。脫色的初始條件為pH7.0、活性炭用量4%、溫度50℃和時間60min。各單因素水平為:pH1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0;活性炭用量1%、1.5%、2%、2.5%、3%、4%;溫度30、35、40、45、50、60、70℃;時間30、40、50、60、70min。

1.2.6 響應面法優化實驗設計 參照文獻[15-17]的方法,根據單因素實驗的結果,采用Box-Behnken實驗設計對灰兜巴蛋白酶解液的脫色進行4因素3水平的研究,見表1,每個處理平行測定3次,取平均值,以得到最優的脫色條件。

表1 響應面因素設計水平表Table 1 Factors and level value of response surface methodology

1.2.7 數據統計分析 采用Design Expert 8.0對響應面數據進行分析處理。

2 結果與討論

2.1 全波長掃描圖

由圖1可知,灰兜巴多肽液在波長200～800nm下進行全波長掃描,在波長367nm處有最大吸收峰,因此選367nm作為測定波長。

圖1 灰兜巴多肽液的吸收光譜曲線Fig.1 Absorption spectra curve of Huidouba polypeptide

2.2 脫色劑的選擇

在用脫色劑對灰兜巴酶解液進行脫色時,偶有難聞的刺激性氣味產生,這可能是因為酶解液中游離的氨基酸與脫色劑發生脫羧的反應,釋放出胺類物質,而含有S元素的氨基酸如蛋氨酸和半胱氨酸還會釋放出H2S[18]。由圖2可知,采用粉末活性炭、顆粒活性炭、硅藻土和雙氧水這四種脫色劑處理灰兜巴酶解液,在pH、溫度和時間相同的脫色條件下,以粉末活性炭為脫色劑時脫色率是最高的,顆粒活性炭為脫色劑時的多肽回收率是最高的,綜合脫色率和肽回收率兩方面因素的考慮,本文選用粉末活性炭作為灰兜巴酶解液的脫色劑。

圖2 不同脫色劑對脫色率和肽回收率的影響Fig.2 Effect of different bleaching agents on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.3 單因素實驗結果

2.3.1 pH對脫色效果的影響 由圖3可知,脫色率隨著pH的增大而增大(pH3除外),在酸性條件下,活性炭吸附色素的效果差。肽回收率隨著pH的增大而逐步降低(pH2除外),并且在堿性條件下,多肽的回收率很低。在pH為2時,產生很多的沉淀,可能在此pH下,是部分肽的等電點,這與關晴等人[13]在對黃豆醬多肽原液脫色及抗氧化活性研究中,在pH為4時,大部分肽達到等電點沉淀相類似。綜合脫色率和肽回收率兩方面因素的考慮,pH定為3,這與周利亙[19]等人在對大豆多肽脫色工藝優化研究中,粉末活性炭最佳脫色pH3相同。

圖3 pH對脫色率和肽回收率的影響Fig.3 Effect of pH on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.3.2 活性炭用量對脫色效果的影響 由圖4可知,活性炭用量對灰兜巴酶解的脫色效果影響顯著。當活性炭用量在1%～4%的范圍內,隨著活性炭用量的增加,脫色率增加,但肽回收率卻逐步減小,可能是因為隨著粉末活性炭用量的增加,比表面積增大,活性炭對肽的吸附能力增強,導致肽回收率呈減小趨勢。綜合脫色率和肽回收率兩方面因素的考慮,粉末活性炭用量定為1.5%,這與魏連會[9]等人在響應面法優化醬油中多肽的脫色工藝中,粉末活性炭最佳脫色活性炭用量1.5%相同。

圖4 活性炭用量對脫色率和肽回收率的影響Fig.4 Effect of activated carbon concentration on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.3.3 溫度對脫色效果的影響 由圖5可知,隨著脫色溫度的升高,灰兜巴酶解液的脫色率呈現升高的趨勢,但肽回收率卻呈現降低的趨勢,這可能是活性炭脫色是一個吸熱的過程,當溫度升高時液體黏度降低,加快了溶液中色素分子和多肽的擴散速度,使得色素分子和多肽更容易進入到粉末活性炭的孔徑,從而增加了灰兜巴酶解液與活性炭接觸機會,更利于活性炭的吸附,增強脫色效果,同時也增強了對多肽的吸附[20-22]。綜合脫色率和肽回收率兩方面因素的考慮,脫色的溫度定為45℃,這與黃敏[23]在對玉米醒酒肽產品研制及其功效研究中,粉末活性炭最佳脫色溫度45℃相同。

圖5 溫度對脫色率和肽回收率的影響Fig.5 Effect of temperature on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.3.4 時間對脫色效果的影響 由圖6可知,隨著脫色時間的延長,灰兜巴酶解液的脫色率先呈現升高的趨勢后趨于平緩,但肽回收率卻呈現降低的趨勢,這可能是因為在活性炭吸附過程中,色素與活性炭需要一定的接觸時間來提高脫色率[13],因此隨著時間的延長,活性炭對多肽和色素的吸附量會增加,剛開始色素與肽競爭吸附,活性炭對色素吸附較強,當達到50min時色素吸附接近飽和,脫色率幾乎不再變化,但對多肽的吸附量增加,從而導致肽回收率突然降低。綜合脫色率和肽回收率兩方面因素的考慮,脫色的時間定為50min,這與戴麗君[24]在正交實驗優化大豆多肽脫色工藝中,粉末活性炭最佳脫色時間50min相同。

圖6 時間對脫色率和肽回收率的影響Fig.6 Effect of time on the decolorization rate and recovery rate of peptide

2.4 響應面優化灰兜巴酶解液的脫色工藝條件

2.4.1 響應面優化實驗的結果 以pH、活性炭用量、溫度和時間為因素進行響應面優化灰兜巴多肽液的脫色工藝條件,分析見表2和表3。

由表3可知,該模型Y1和Y2差異極其顯著(p值<0.0001),Y1和Y2決定系數R2值為0.9945和0.9983,表明灰兜巴蛋白酶解液的脫色率和多肽回收率的實驗值和擬合值之間具有很好的擬合度。模型的失擬項p值>0.10,表明Y1和Y2二次模型是合適的。

表2 響應面實驗結果Table 2 Results of response surface experiment

通過對模型系數的顯著性分析可以得知:

Y1的X2、X3、X4、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42對灰兜巴蛋白酶解液的脫色率影響是顯著的,其中因素X2、X4、X2X4、X22、X32、X42對脫色率的影響是極其顯著的。一次項中各因素對灰兜巴蛋白酶解液的脫色率的影響顯著性大小順序是活性炭用量(X2)和時間(X4)>溫度(X3)>pH(X1)。

經過擬合后可以建立關于pH、活性炭用量、溫度以及時間的二次多項式回歸模型為:

Y1(%)=72.27+0.13X1+4.35X2+0.40X3+2.00X4+0.38X1X2-0.93X1X3+0.063X1X4+0.70X2X3-1.44X2X4+0.85X3X4-0.67X12-3.14X22-0.923X2-1.94X42

Y2的X1、X2、X3、X4、X1X3、X2X3、X3X4、X12、X22、X32、X42對灰兜巴蛋白酶解液的肽回收率影響是顯著的,其中因素X1、X2、X3、X4、X1X3、X3X4、X12、X22、X32對肽回收率的影響是極其顯著的。

經過擬合后可以建立關于pH、活性炭用量、溫度以及時間的二次多項式回歸模型為:

Y2(%)=82.34+7.44X1-4.47X2-3.99X3-1.27X4-0.40X1X2-2.11X1X3+0.38X1X4+0.85X2X3-0.24X2X4-1.79X3X4-16.06X12-3.27X22-7.26X32-0.67X42

2.4.2 雙因素間交互作用影響 由表3可知,Y1模型中pH與溫度(圖7a)、活性炭用量與溫度(圖7b)、活性炭用量與時間(圖7c)、溫度與時間(圖7d)的兩因素間的交互作用對灰兜巴蛋白酶解液的脫色率影響顯著,見圖7。

表3 回歸模型的方差Table 3 Variance analysis of regression model

圖7 脫色率響應曲面圖Fig.7 The response surface plot of time and pH on the enzymolysis reaction

注:**,差異極顯著(p<0.0001);*,差異顯著(p<0.05),Y1-脫色率,Y2-肽回收率。

如圖7所示,pH與溫度的交互影響如圖7a,其交互作用比較顯著,在活性炭用量和時間處于最佳值,當溫度不變的情況下,脫色率隨著pH的增大而增大,但是增幅不是很明顯。當pH處于不變的情況下,脫色率隨著溫度的升高而增大,但是增大不明顯;活性炭用量與溫度的交互影響如圖7b,其交互作用顯著,在pH和時間處于最佳值,當溫度不變的情況下,脫色率隨著活性炭用量的增加而提升,整體呈現先大幅度提升后趨于平緩。當活性炭用量處于不變的情況下,脫色率隨著溫度的增加而略微增大;活性炭用量與時間的交互影響如圖7c,其交互作用極其顯著,在pH和溫度處于最佳值,當活性炭用量不變的情況下,脫色率隨著時間的延長而增加。當時間不變的話,脫色率隨著活性炭用量的增加而增加,并呈現先大幅度增大后趨于平緩。溫度與時間的交互影響如圖7d,其交互作用相當顯著,在pH和活性肽用量處于最佳值,當溫度在不變的情況下,脫色率隨著時間的延長而增加。當時間處于不變的情況下,脫色率隨著溫度的升高而稍有增加。

由表3可知,Y2模型中pH與溫度(圖8a)、活性炭用量與溫度(圖8b)、溫度與時間(圖8c)的兩因素間的交互作用對灰兜巴蛋白酶解液的肽回收率影響顯著,見圖8。

圖8 肽回收率響應曲面圖Fig.8 The response surface plot of time and pH on the enzymolysis reaction

如圖8所示,pH與溫度的交互影響如圖8a,其交互作用極其顯著,在活性炭用量和時間處于最佳值,當溫度不變的情況下,肽回收率隨著pH的增大,呈現先大幅度提升后降低的趨勢。當pH處于不變的情況下,肽回收率隨著溫度的升高而增大,但是增大不明顯;活性炭用量與溫度的交互影響如圖8b,其交互作用顯著,在pH和時間處于最佳值,當溫度不變的情況下,肽回收率隨著活性炭用量的增加而降低。當活性炭用量處于不變的情況下,肽回收率隨著溫度的增加而略微增大;溫度與時間的交互影響如圖8c,其交互作用極其顯著,在pH和活性炭用量處于最佳值,當溫度不變的情況下,肽回收率隨著時間的延長而略微降低。當時間不變的話,肽回收率隨著溫度的增加而減少,且溫度越高降低的趨勢越快。

2.4.3 灰兜巴蛋白酶解液脫色條件的確定及優化工藝條件驗證 經Box-Behnken設計實驗可以得到灰兜巴蛋白酶解液脫色的工藝條件為:pH3.25、活性炭用量1.61%、溫度44.07℃、時間52.74 min。在此最優脫色條件下脫色率為73.27%,肽回收率為82.33%。

為了方便實際操作,將灰兜巴蛋白酶解液脫色的工藝條件設為:pH3.3、活性炭用量1.6%、溫度44℃、時間53min。在此最優反應條件下進行驗證實驗,得到灰兜巴蛋白酶解液的脫色率為73.12%,肽回收率為82.49%,相對誤差為0.20%和0.19%,實驗證明該模型是適合有效的。

3 結論

以灰兜巴蛋白酶解液為原料,采用響應面法對灰兜巴蛋白酶解液的脫色工藝條件進行了優化,在單因素實驗的基礎上,采用Box-Behnken方法設計建立數學模型,并進行了分析。結果表明,在本研究中,灰兜巴蛋白酶解液脫色效果最佳脫色劑為粉末活性炭。在影響灰兜巴酶解液脫色效果的四個因素中活性炭用量、時間和溫度對脫色率和肽回收率影響均顯著,其中pH與溫度、活性炭用量與溫度、活性炭用量與時間、溫度與時間之間的交互作用是顯著的;在對肽回收率的影響中,四個因素對其影響都是極其顯著的,其中pH與溫度、活性炭用量與溫度、溫度與時間之間的交互作用是顯著的。灰兜巴蛋白酶解液的最優脫色條件為:pH3.3、活性炭用量1.6%、溫度44℃、時間53min。在此條件下,理論脫色率是73.27%,肽回收率是82.33%,通過驗證實際灰兜巴蛋白酶解液的脫色率為73.12%,肽回收率為82.49%,相對誤差為0.20%和0.19%,證明該模型是適合有效的。本論文在用粉末活性炭脫色的同時,最大限度的保留了灰兜巴蛋白酶解液中的多肽含量,此法是灰兜巴蛋白酶解液脫色處理的一種簡便有效的方法,為開發灰兜巴多肽提供理論基礎。

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Optimization of the condition of decoloring process ofHuidouba polypeptide by response surface methodology

LI Jin1,2,XU Wei2,SHAO Rong2,YAN Xiu-hua2,WEI Ping1,*

(1.College of Biotechnology and Pharmaceutical Engineering,Nanjing Tech University,Nanjing 210009,China;2.School of Chemical and Biological Engineering,Yancheng Institute of Technology,Yancheng 224051,China)

Huidouba polypeptide from Huidouba protease hydrolyzate had been decolored by activated carbon powder. It was helpful to separate and purify the bioactive peptides by removing the pigment from Huidouba polypeptide hydrolyzate. Based on the results of single factor experiments,the decoloring process was optimized by response surface methodology. Activated carbon powder was the best as a bleaching agent and the optimal conditions were as follows:pH3.3,The amount of activated carbon 1.6%,temperature 44℃,time 53min. Under the optimal conditions,the decoloring rate was 73.12%,and the peptide retention rate was 82.49% which were close to theoretical value. The decoloring process was cost-effective,simple,reliable,and maximized the retention of Huidouba protease hydrolyzate with high peptide retention rate. The results would provide a theoretical foundation for the development of Huidouba polypeptide.

Huidouba polypeptide;powdered activated carbon;decolorization;response surface methodology

2014-10-08

李錦(1988-)，男，碩士研究生，主要從事生物資源綜合利用研究。

*通訊作者:韋萍(1961-)，女，博士，教授，研究方向：生化工程。

國家自然科學基金(31101912)；江蘇省自然科學基金(BK2011420)；江蘇省“青藍工程”項目；江蘇省博后基金項目(1401101C)；江蘇省大學生實踐創新訓練省指導項目(2014046)。

TS201.2

B

1002-0306(2015)13-0199-07

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.033