鱘龍魚硫酸軟骨素提取工藝優化研究

周婉君,郝淑賢,吳燕燕,魏 涯,林婉玲,王錦旭,岑劍偉

(中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300)

鱘龍魚硫酸軟骨素提取工藝優化研究

周婉君,郝淑賢,吳燕燕,魏 涯,林婉玲,王錦旭,岑劍偉*

(中國水產科學研究院南海水產研究所,農業部水產品加工重點實驗室,國家水產品加工技術研發中心,廣東廣州 510300)

利用響應曲面法優化提取西伯利亞鱘龍魚軟骨組織提取硫酸軟骨素的工藝條件。研究了堿濃度、沉淀時間、乙醇體積對硫酸軟骨素提取率的影響,在單因素實驗基礎上采用Box-Behnken中心組合實驗,以堿質量濃度、沉淀時間、乙醇體積為影響因素,以提取率為響應值建立二元多次方程,通過響應面分析法得到優化組合。結果表明,最佳工藝條件為:NaOH 0.5mol/L、乙醇體積1倍、沉淀時間20min,提取得硫酸軟骨素產率為57.21%,預測值產率為59.31%。

鱘龍魚,硫酸軟骨素,提取,響應曲面法

鱘龍魚(Acipenser)是淡水類中壽命長、個體大、生長快等養殖優點的魚類,有很高的科學研究價值和經濟價值。近年來,我國鱘龍魚的養殖業發展迅猛并取得了顯著成效[1]。鱘龍魚骨架為軟骨組織,鱘魚軟骨與鯊魚軟骨具有相似功用,內含有豐富的抗癌因子——硫酸軟骨素(Chondroitin sulfate)。硫酸軟骨素是來自動物鼻軟骨、喉軟管及肌腱等軟骨組織,是從動物軟骨組織中提取分離得到的一種重要的酸性粘多糖——糖胺聚糖[2]。根據文獻研究發現硫酸軟骨素能緩解關節炎[3]、抗氧化、免疫調節、降血脂、抗凝血和促進骨質形成[4],有較好的保水性和黏性、抗腫瘤、抑制病毒活性,因此在醫藥、保健食品及化妝品行業有廣泛應用[5]。從鱘魚、鯊魚中提取硫酸軟骨素優化工藝雖然已有多種,但是以西伯利亞成年鱘龍魚進行研究還是極少見。本研究利用西伯利亞成年鱘龍魚軟骨為原料,為了產品的安全性,通過工藝技術研究的改進低堿法優化提取硫酸軟骨素,應用響應面分析法(Response Surface Methodolgy)并結合單因素實驗對提取工藝進行了優化,確定最佳的提取工藝條件,為鱘龍魚加工副產物高值化利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西伯利亞鱘龍魚骨:由杭州千島湖鱘龍科技開發有限公司,-18℃凍存;十二水磷酸氫二鈉、二水磷酸二氫鈉、氫氧化鈉,戊烷磺酸鈉,乙酸,甲醇,異丙醇,均為分析純購自廣州化學試劑廠,乙腈(高級純)購自上海安譜科學儀器有限公司,胰蛋白酶購自廣州市齊云生物技術有限公司。

Alpha-4冷凍干燥機 德國Christ公司;3K30冷凍離心機 德國Sigma公司;高速萬能攪碎機 上海頂帥有限公司;SCIEN超聲波清洗機 寧波新芝生物科技股份有限公司;安捷倫1100液相色譜儀 美國安捷倫公司;GB204電子天平 長沙湘平科技發展有限公司;MILLI-Q超純水機 美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 軟骨預處理 將鱘魚軟骨組織置于90℃水浴處理20min,用刀刮除表面的肌肉及脂肪等雜質,清洗干凈,將軟骨切碎,用50℃烘箱干燥后粉碎機打碎,密封-18℃保存。

1.2.2 粗提取 參考尚軍等[6]的方法進行超聲波水解。稱取5g軟骨粉,50mL磷酸鹽緩沖液,0.015g胰蛋白酶,超聲波水解溫度50℃,功率100%,時間120min),10000r/min離心15min后取上清液,加入1.0倍體積乙醇和至NaOH 0.4mol/L,攪拌沉淀30min,10000r/min離心20min,取沉淀物用烘箱50℃烘箱干燥約2h。

1.2.3 復溶 用適量水將上述制得的樣品完全溶解,用40%的乙酸溶液中和,調pH至中性,冷凍離心機10000r/min離心20min取上清液,-18℃冷凍干燥機干燥24h后,取出研碎混勻,得到硫酸軟骨素粗品。

1.3 硫酸軟骨素含量及含量的測定

參考液相色譜法[7],用乙腈-10mmol/L戊烷磺酸鈉溶液(10∶90),作為流動相;流速為1mL/min;檢測波長為205nm;色譜柱為C18柱,250mm×4.6mm,粒度5μm;進樣量20μL。

1.4 硫酸軟骨素產率計算

根據硫酸軟骨素含量測定結果,計算硫酸軟骨素含量,計算公式如下:

硫酸軟骨素產率(%)=硫酸軟骨素粗品質量/軟骨質量(干重)×100

1.5 響應面法優化設計

根據預實驗結果,選取對硫酸軟骨素提取有顯著影響的三個因素進行優化,即堿液濃度(X1)、沉淀時間(X2)和乙醇體積(X3)進行響應面實驗,選用三因子Box-Behnken[8]數據統計分析軟件對實驗數據進行回歸分析,如表1所示。

表1 實驗因素水平表Table1 Factors and levels in response surface design

2 結果與分析

2.1 響應面分析法優化實驗結果

選用三因子根據Box-Behnken設計的原理,結合單因素實驗結果,確定各影響因素的編號水平。分別為X1堿液濃度(mol/L)、X2沉淀時間(min)、X3乙醇體積(倍)三個響應變量,產率為響應值,響應面設計方案及實驗結果見表2[9]。

表2 Box-Behnken實驗結果Table 2 Design and results of the response surface

2.2 回歸模型方差分析

根據表2的實驗設計及實驗結果,采用Design-Expert軟件對實驗數據進行分析,得到方差分析結果見表3[10]。

表3 回歸模型方差分析結果Table 3 Variance and error analysis of the response surface

從表3分析結果可知,回歸模型Pr>F值為0.0084<0.01,說明回歸模型與響應值的相關極顯著,模型的相關系數為0.9018>0.9,說明回歸模型能夠較好地預測相應的響應變量。而失擬項不顯著為0.2182>0.05,該模型在理論上反映了響應值的誤差較小,擬合度好。

各因素經回歸擬合后,可以得到硫酸軟骨素含量Y對編碼自變量(堿濃度、沉淀時間、乙醇體積)的二次多項回歸方程(1):

Y=57.44+5.86X1-1.25X2+2.90X3-0.83X1X2-2.86X1X3+2.64X1X3-7.28X12-0.97X22-5.75X32

由表3可知,堿濃度X1的一次項、堿濃度的X1的二次項及乙醇體積X3的二次項對硫酸軟骨素含量的影響顯著;堿濃度X1和乙醇體積X3的一次項、三個因素的一次項、沉淀時間X2和乙醇體積X3的二次項對硫酸軟骨素含量影響不顯著。因此,可得到優化方程(2):

Y=57.44+5.86X1-7.28X12-5.75X32

2.3 響應曲面分析

根據由擬合的回歸模型作響應曲面圖和等高線圖,結果如圖1～圖3所示。

圖1 沉淀時間與堿濃度對產率的影響Fig.1 Effect of precipitation time and alkali concentration on the yield of Chondroitin sulfate

圖2 乙醇體積與堿濃度產率的影響Fig.2 Effect of ethanol and alkali concentration on the yield of Chondroitin sulfate

圖3 乙醇體積與沉淀時間對產率的影響Fig.3 Effect of ethanol volume and precipitation time on the yield of Chondroitin sulfate

從圖1可知,當乙醇體積定為提取液1倍時,堿濃度的變化對硫酸軟骨素含量的影響較顯著,隨著堿濃度增加硫酸軟骨素含量先升高后下降。原因是在低濃度堿液中,部分多糖降解不完全或沒有降解。從圖2可知,乙醇體積和堿濃度的交互作用較小,而堿濃度在0.4～0.6mol/L范圍內,硫酸軟骨素的含量較大。從圖3可知,乙醇體積和沉淀時間對硫酸軟骨素含量的交互作用較強,當沉淀時間一定,乙醇體積為0.9～1.1倍左右時,硫酸軟骨素含量較高。

2.4 最佳工藝參數確定

為了進一步得到各因素的最佳條件組合,使得提取硫酸軟骨素含量達到最佳值,采用Design-Expert軟件對各因素和響應值的數據進行優化分析,以硫酸軟骨素含量為響應值,經響應面分析可得到最佳的提取條件:堿濃度X1=0.49mol/L、沉淀時間X2=20.36min、乙醇體積X3=0.98倍,硫酸軟骨素含量的預測值為59.31%。根據實際操作,將預測條件修正為堿濃度0.5mol/L、沉淀時間20min、乙醇體積1倍,并進行實驗得到硫酸軟骨素產率為57.21%,結果與理論預測值基本相符,對硫酸軟骨素提取低堿處理參數具有一定的實際預測價值。根據文獻報道郝淑賢[11]、劉安軍[12]、徐傳屯[13]等的提取硫酸軟骨素產率分別是16.65%、35.70%、31.56%,本研究硫酸軟骨素產率結果遠遠高于其它實驗結果,從食品安全方面考慮低濃度堿處理方法較為安全,優化工藝條件更有效地提高了硫酸軟骨素的產率和質量。

3 結論

通過采用Box-Behnken的中心組合設計響應面法建立了3個影響因素(堿濃度、沉淀時間及乙醇體積)和響應值(產率)結合相互作用的數學模型,得出堿處理時硫酸軟骨素提取條件的優化。三個因素對硫酸軟骨素含量的影響順序:NaOH濃度、乙醇體積、沉淀時間,結果表明,最佳優化工藝條件:NaOH 0.5mol/L、乙醇體積1倍、沉淀時間20min,按此優化工藝條件得到硫酸軟骨素產率為57.21%,建立的數學模型能較好地預測各實驗因素和考察指標之間的關系。

[1]孫大江,曲秋芝,馬國軍,等.中國鱘魚養殖概況[J].大連水產學院學報,2003,18:216-221.

[2]魏涯,趙永強,郝淑賢,等.咔唑法與間苯三酚法測定硫酸軟骨素比較研究[J].南方水產科學,2012,8(6):65-71.

[3]陳磊,凌培學,張天民. 硫酸軟骨素在骨關節炎防止中的作用[J].中國生化藥物雜志社,2008,29(2):137-139.

[4]孫豐梅. 硫酸軟骨素的提取及其降血脂、抗氧化保健功能的研究[D].保定:河北農業大學,2003.

[5]徐慶陽,黎興榮,石墨,等. 硫酸軟骨素研究現狀[J].生物技術通訊,2006,15(6):633-635.

[6]尚軍,李來好,吳燕燕,等.響應面優化超聲波輔助蛋白酶水解合浦珠母貝肉的條件研究[J].食品科學,2009,30(18):44-49.

[7]中國國家標準化管理委員會.GB/T20365-2006.硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖含量的測定[S].北京:中國標準出版社,2006.

[8]楊文雄,高彥祥. 響應面法及其在食品工業中的應用[J]. 中國食品添加劑,2005,2:68-71.

[9]黃卉,李來好,楊賢慶,等.響應面法優化羅非魚油微膠囊壁材的研究[J].食品工業科技,2009,30(12):225-228.

[10]戚勃,李來好,楊賢慶,等.響應曲面法優化麒麟菜卡拉膠堿處理工藝[J].南方水產科學,2011,7(6):26-34.

[11]郝淑賢,魏涯,李來好,等.鱘魚軟骨素提取工藝研究[J].食品工業科技,2012,33(24):253-255,261.

[12]劉安軍,王慧,朱振元,等.鱘魚硫酸軟骨素提取工藝的研究[J].現代食品科技,2009,25(6):617-619.

[13]徐偉屯,關瑞章,鄭江,等.養殖鱘魚軟骨中硫酸軟骨素的優化提取工藝研究[J].中國生化藥物雜志,2004,30(3):154-157,161.

Optimization technology of extractionof the chondroitin sulfate from sturgeon

ZHOU Wan-jun,HAO Shu-xian,WU Yan-yan,WEI Ya,LIN Wan-ling,WANG Jin-xu,CEN Jian-wei*

(South China Sea Fisheries Research Institute,Chinese Academy of Fishery Sciences,Key Laboratoryof Aquatic Product Processing,Ministry of Agriculture,National R&D Centerfor Aquatic Product Processing,Guangzhou 510300,China)

Extraction of the chondroitin sulfate in sturgeon was studied by response surface methodology. The influence of alkalinity,sedimentation time,ethanol volume on extract rate of chondroitin sulfate was studied. On the basis of single-factor investigation,Box-Benhnken central composite experiments were carried out to build the quadratic regression model for the extraction yield with above 3 factors,the optimizing process parameters were:alkalinity 0.5mol/L,sedimentation time 20min,ethanol volume 1 times of the extraction solution. Under the optimal processing condition,the yield of chondroitin sulfate was 57.21%,and the forecasted yield was 59.31%.

sturgeon;chondroitin sulfate;extraction;response surface methodology

2015-01-15

周婉君(1961-)，女，本科，實驗師，主要從事水產品加工與質量安全控制技術方面的研究。

*通訊作者:岑劍偉(1976-)，男，碩士，副研究員,主要從事水產品加工與質量安全控制技術方面的研究。

國家公益性(農業)行業專項(201003055-06)；國家重大科技成果轉化項目(ZD-2013-345-3)；中央級公益性科研院所基本科研業務費專項(2012YD01)。

TS254.9

B

1002-0306(2015)13-0209-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.035