利用綠潮藻滸苔制備水溶色素的工藝研究

王 鵬,黃志俊,皎 皎,李銀平,江曉路

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

利用綠潮藻滸苔制備水溶色素的工藝研究

王 鵬,黃志俊,皎 皎,李銀平,江曉路*

(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

針對綠潮藻滸苔藻體中葉綠素不穩定的特點,本研究提出了一種通過銅代改性、丙酮浸提、成鹽等過程制備滸苔水溶色素的新工藝,并對工藝參數進行優化。研究結果表明,當CuSO4添加量為0.6%(w/w)時,滸苔葉綠素得率最高,達0.17%;采用單因素和響應面優化法對成鹽過程的參數進行優化,得到最佳工藝參數:向50mL、1g/L滸苔葉綠素濃縮液中添加50mg NaOH、反應溫度45.8℃、時間52.2min,在此最優條件下滸苔色素得率為1.068mg/mL;品質指標測定結果表明該工藝制備的水溶色素符合GB26406-2011中的各項指標。

滸苔,提取,水溶色素,響應面優化

葉綠素是一種廣泛存在于高等植物和藻類細胞中的天然色素。葉綠素在體外不穩定,耐光性差,且不溶于水,應用中通常將其轉化為穩定的銅鈉鹽形式[1],從而得到水溶性葉綠素衍生物。由于具有色澤鮮艷、安全穩定的特點,水溶性葉綠素產品已被廣泛用于飲料、果凍、糕點等食品的著色,是一種常見的食品添加劑。

滸苔作為一種廣泛分布于我國東海海域的大型綠藻,自2007年以來,已呈季節性爆發,形成綠潮,資源量巨大。同時,滸苔藻體內含有豐富的葉綠素[2],是一種潛在的廉價葉綠素生產原料。但是,滸苔在海域打撈、收集,陸域脫水打包及運輸處理過程中往往受到光照、高溫等因素的影響而導致色素變性退色[3],這使得采用常規生產工藝難以對其進行有效提取利用。迄今為止,國內外有關水溶葉綠素制備方法研究報道大多采用有機溶劑浸提、皂化、酸化、銅化、成鹽等工藝過程[4],制備過程操作復雜,有多次析出、溶解過程,并且需要消耗大量的酸、堿、以及丙酮和石油醚等有機溶劑,不適合于葉綠素部分或嚴重退色的滸苔原料的加工。因此,尋找一種適合于綠潮藻滸苔藻體特點的色素制備工藝將有助于實現滸苔高值綜合利用。

本實驗針對綠潮藻滸苔提出一種水溶色素的制備方法,首先通過藻體銅代改性,有機溶劑提取,并經成鹽反應制備滸苔水溶色素。采用單因素及響應面優化法,對銅代及成鹽工藝參數進行優化,并對獲得的色素進行品質檢測,為滸苔葉綠素的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

滸苔 原料由青島海大生物集團有限公司提供,該原料是通過海域打撈收集、陸域脫水打包、二次剪切及快速烘干制得滸苔粉(含水量小于10%);丙酮、硫酸銅、氫氧化鈉 均為分析純。

數顯式恒溫水浴鍋 上海啟前電子科技有限公司;DL6MB型大容量離心機 西安禾普生物科技有限公司;721型紫外-可見分光光度計 上海精密儀器有限公司;AA320N原子吸收光譜儀 上海達平儀器有限公司;PHS-3C型pH計 上海儀電科學儀器股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 滸苔水溶色素制備工藝 滸苔→銅代→清洗、過濾→丙酮浸提→成鹽→離心→低溫烘干沉淀→滸苔水溶色素

1.2.2 葉綠素濃度及得率的測定 參照趙慶生等[5]關于葉綠素濃度及得率的測定方法,取2g滸苔粉,以丙酮為提取液,用索氏提取器抽提至提取管中液體無色,收集提取液,在645nm和663nm下測定吸光值,計算公式如下:

葉綠素濃度(mg/L)=8.02A663nm+20.21A645nm

葉綠素得率(%)=葉綠素濃度(mg/L)×提取液體積(L)×100/滸苔粉質量(mg)

1.2.3 CuSO4添加量的確定 取5g滸苔粉于三角瓶,加入蒸餾水,同時加入相對于滸苔質量0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1%、2%、4%的CuSO4,沸水浴1h,過濾,濾渣用水沖洗3次,烘干粉碎濾渣得到銅代滸苔粉,以葉綠素得率為指標,確定最適CuSO4添加量。

1.2.4 成鹽反應工藝參數優化 在1.2.3中得到的最適CuSO4添加量下制備銅代滸苔粉,用丙酮浸提葉綠素,濃縮,獲得濃度為1g/L的滸苔葉綠素濃縮液。每組取50mL濃縮液,在不同NaOH添加量、反應溫度、反應時間下進行成鹽反應,反應過程在加熱回流裝置中進行,再經離心、烘干得到墨綠色滸苔水溶色素,稱量色素質量,并計算色素得率,計算公式如下:

色素得率(mg/mL)=色素質量(mg)/葉綠素濃縮液體積(mL)

以色素得率為指標,以NaOH添加量、反應溫度、反應時間為考察因素,進行單因素優化實驗,實驗設計如表1。

表1 單因素實驗因素與水平Table 1 Factors and levels of single factor experiments

根據單因素實驗結果,利用Box-Behnken中心組和實驗設計方法,設計3因素3水平的響應面分析實驗。具體實驗因素水平及編碼見表2。

采用Design Expert 8.0軟件對表中因素及實驗所得響應值進行分析,研究不同因素對滸苔水溶色素得率的影響,并得到最佳成鹽反應條件。

表2 Box-Behnken實驗因素和水平設計Table 2 Factors and levels in Box-Behnken analysis

1.2.6 數據分析方法 優化過程中每組實驗重復三次,實驗所得數據采用平均值±標準偏差表示,采用SPSS13.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)。

2 結果與分析

2.1 CuSO4添加量的確定

分別對不同CuSO4添加量處理下的滸苔葉綠素含量進行測定,并計算葉綠素得率,結果見圖1。當CuSO4添加量為0%至0.6%時,葉綠素得率隨CuSO4添加量的增加而升高。當CuSO4添加量為0.6%時,其得率達到最高,為0.17%,是未經銅代(CuSO4添加量0%)滸苔葉綠素得率的2.83倍。王敏等[7]研究表明,葉綠素降解產物脫鎂葉綠素分子與銅離子結合,使已退色的葉綠素分子呈色功能重新復原,從而使葉綠素得率明顯增加。但是,當CuSO4添加量超過0.6%后,滸苔葉綠素得率呈現下降趨勢,且CuSO4添加量高于1%后,葉綠素得率保持在較低的水平。鄧麗萍[8]認為,非活體綠藻細胞壁中含有氨基、羧基硫酸等帶電基團,由于斥力作用而阻礙金屬離子對細胞壁的靠近;潘進芬[9]在研究中發現,金屬離子可以通過物理吸附在藻體細胞壁上形成無機沉淀,并引起細胞外觀變形,同時使藻體細胞熒光性喪失。因此,推測引起滸苔葉綠素得率降低的原因可能是滸苔藻體細胞壁中的氨基等帶電基團與藻體內部的脫鎂葉綠素競爭性與Cu2+結合,阻礙了金屬離子向藻體細胞內的擴散,同時過量的Cu2+可能會對葉綠素分子造成破壞,使其退色。根據實驗結果,CuSO4最適添加量為0.6%。該條件可以有效對滸苔原料銅代修復。

圖1 CuSO4添加量對葉綠素得率的影響Fig.1 Effect of CuSO4 on the chlorophyll extraction rate

2.2 成鹽反應工藝參數優化

葉綠素分子屬卟啉化合物,是由葉綠酸和葉綠醇、甲醇所組成的二醇脂[10]。脂類在堿性溶液中可發生成鹽反應,使葉綠素分子脫去脂基,生成鮮綠色的葉綠酸鹽,從而使其具有水溶性。該過程受NaOH添加量、反應溫度、反應時間的影響。

為研究NaOH添加量對滸苔水溶色素得率的影響,向葉綠素丙酮提取液中分別加入不同量的NaOH,在反應溫度為60℃、反應時間為1h的條件下進行反應,再經離心、烘干得到墨綠色滸苔水溶色素,并計算色素得率,結果如圖2。隨著NaOH添加量的增加,色素得率逐漸上升,當添加量達到50mg后色素得率為0.76mg/mL,之后增加NaOH滸苔色素得率略有下降。因此,成鹽反應所需NaOH添加量在40～60mg為最適范圍。

圖2 NaOH添加量對色素得率的影響Fig.2 Effect of NaOH on the production of pigment

反應溫度是影響反應速率的重要因素,本實驗研究了在NaOH添加量為1.70mg/g、反應時間為1h條件下,不同溫度對滸苔水溶色素得率的影響,結果如圖3。隨著反應溫度的增加,色素得率先升高后降低,最高達到0.81mg/mL。這主要是隨著反應溫度的升高,反應速率加快,在一定時間內色素得率隨反應溫度的升高而增加。當反應溫度超過40℃,色素得率反而下降,可能是在過高溫度環境下,葉綠素分子降解為脫鎂葉綠酸及其它小分子物質[11],從而造成得率降低。因此反應溫度選擇40～50℃為適宜范圍。

圖3 反應溫度對色素得率的影響Fig.3 Effect of reaction temperature on the production of pigment

反應時間是決定成鹽反應進行程度的另一個重要因素,本實驗在NaOH添加量50mg、反應溫度40℃條件下,以反應時間為變量,以色素得率為指標,研究反應時間對滸苔水溶色素得率的影響,結果如圖4。隨著反應時間的延長,滸苔水溶色素的得率逐漸升高,當反應時間為50min時,得率達到最高0.94mg/mL,但當反應時間為60min時,得率為0.72mg/mL,這可能是葉綠素分子在高溫環境中,隨著時間的延長,出現氧化現象[12],造成葉綠素的降解與退色,從而降低了滸苔色素的得率。

圖4 反應時間對色素得率的影響Fig.4 Effect of reaction time on the production of pigment

為進一步優化滸苔色素的成鹽反應工藝條件,本研究選取NaOH添加量(X1)、反應溫度(X2)、反應時間(X3)為響應變量,以色素得率(Y)為響應值,使用Design Expert 8.0軟件,采用Box-Behnken中心組和實驗設計方法得到響應面實驗設計及結果如下:

表3 Box-Behnken實驗設計與結果Table 3 Box-Behnken design matrix and experimental results

表4 響應面回歸結果及方差分析Table 4 ANOVA of quadratic polynomial model and significance test

注:**表示極顯著(p<0.01),*表示顯著(p<0.05)。

根據F值大小可以得到各因素對滸苔色素得率的影響因素按主次順序排列為NaOH添加量(X1)>反應溫度(X2)>反應時間(X3),其中NaOH添加量對色素得率的影響極顯著(p<0.0001),反應溫度對色素得率的影響顯著(p=0.0258),反應時間對色素得率的影響不顯著。在交互項中,X1X2項p值為0.0339,表明NaOH添加量和反應溫度對滸苔色得率的影響顯著,X1X3項、X2X3項p值均大于0.05,表明NaOH添加量與反應時間、反應時間和反應溫度的交互作用對色素得率的影響不顯著。三因素的交互相應曲面圖見圖5～圖7。

圖5 NaOH添加量和反應溫度對色素得率的三維響應分析圖Fig.5 Interactive effect of NaOH suppliment and temperature on production of pigment

圖6 NaOH添加量和反應時間對色素得率的三維響應分析圖Fig.6 Interactive effect of NaOH suppliment and reaction time on production of pigment

圖7 反應溫度和反應時間對色素得率的三維響應分析圖Fig.7 Interactive effect of temperature and reaction time on production of pigment

通過Design-expert8.0分析得到成鹽反應最佳優化方案為:NaOH添加量54.2mg、反應溫度45.8℃、反應時間52.2min,在此條件下滸苔色素得率預測值為1.1mg/mL。為了驗證回歸方程所得預測值與真實值之間的擬合程度,根據實際情況NaOH添加量選擇50mg，溫度45.8℃，時間52.2min經測定滸苔色素得率為1.068mg/mL,與預測值的相對誤差為3.0%,與回歸方程預測值十分接近,由此說明該優化成鹽工藝穩定可靠。

2.3 滸苔水溶色素品質檢測

經銅代、有機溶劑浸提、成鹽、過濾烘干得到的滸苔色素為墨綠色粉末,易溶于水,水溶液澄清透明,不溶于石油醚、氯仿。在pH6.0以下有沉淀析出。將色素產物配置成濃度為1%的溶液,用UV2550可見分光光度計于300～800nm波段進行光譜掃描,結果如圖8,可以看出,滸苔色素產品在421、630nm處有特征吸收峰,這與陳晨[13]報道的葉綠素銅鈉鹽的特征吸收峰405～414nm和627～633nm接近。

圖8 紫外-可見吸收光譜圖Fig.8 UV-Vis absorption spectra

參照食品添加劑葉綠素銅鈉鹽的標準(GB 26406-2011)對滸苔色素進行測定,結果見表5。被檢測的主要指標均符合國家標準,其中總銅和游離銅明顯低于標準中規定的最高含量。銅代過程是影響色素產物中總銅和游離銅含量的關鍵步驟[14],本研究在有機溶劑提取葉綠素之前對原料進行銅代,并通過清洗、過濾將藻體外的Cu2+有效去除,從而有效降低了色素產物中游離銅的含量。

表5 滸苔水溶色素各項指標測定結果Table 5 Quality indexes of Enteromorpha water soluble pigment

3 結論

研究表明,在有機溶劑對綠潮藻滸苔提取色素之前,添加CuSO4有助于脫鎂葉綠素轉化為葉綠素銅,進而提高葉綠素得率。但并非CuSO4添加量越多得率越高,過高的添加量將導致滸苔藻體細胞壁中的氨基等帶電基團與藻體內部的脫鎂葉綠素競爭性與Cu2+

結合,使得葉綠素得率顯著降低。通過響應面優化方法,得到滸苔水溶色素最佳工藝參數為:NaOH添加量為50mg、反應溫度為45℃、反應時間為50min,在此最優條件下滸苔色素得率為1.068mg/mL。該工藝具有操作簡單、高效快速的特點,且反應過程避免酸、堿的過度使用,為綠潮藻滸苔原料提供一條高值利用的新途徑。

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Study on the preparation of water soluble pigment from thegreen tide algaeEnteromorphaprolifera

WANG Peng,HUANG Zhi-jun,JIAO Jiao,LI Yin-ping,JIANG Xiao-lu*

(College of Food Science and Engineering,Ocean University of China,Qingdao 266003,China)

Due to the unstability of chlorophyll inEnteromorphaprolifera,a new method for water-soluble pigment preparation was established in this study. The detailed process mainly included Cu2+replacement,acetone extraction,and salifying reaction and the related technical parameters were optimized. Results showed that the chlorophyll extraction rate reached 0.17% with 0.6%(w/w)CuSO4addition. Effect of NaOH dose,duration,and temperature on the salifying reaction were also investigated by single factor experiment and response surface methodology. For 50mL 1g/L chlorophyll concentrate,the optimum conditions were NaOH dose 50mg,temperature 45.8℃,and reaction time 52.2min,respectively. And the corresponding pigment production could reach 1.068mg/mL.Main indexes of the pigment product produced by this method met all the requirements of GB26406-2011.

Enteromorphaprolifera;extraction;water soluble pigment;response surface experiment

2014-10-11

王鵬(1989-)，男，碩士，主要從事微生物應用方面的研究。

*通訊作者:江曉路(1959-)，女，碩士，教授，研究方向：海洋微生物。

國家海洋局公益性專項(201105028-4)。

TS201.1

B

1002-0306(2015)13-0212-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.036