全水化無醇提取γ聚谷氨酸工藝的研究

喬長晟,張苗苗,劉曉晨,高明昊,林虹秀,樓 鵬

(1.天津科技大學工業微生物教育部重點實驗室,天津 300457；2.天津北洋百川生物技術有限公司,天津 300457；3.食品營養與安全省部共建教育部重點實驗室,天津 300457)

喬長晟1,2,張苗苗1,劉曉晨3,高明昊1,林虹秀1,樓 鵬2

(1.天津科技大學工業微生物教育部重點實驗室,天津 300457；2.天津北洋百川生物技術有限公司,天津 300457；3.食品營養與安全省部共建教育部重點實驗室,天津 300457)

為實現γ-聚谷氨酸無醇提取,利用板框除菌,酶解除大分子多糖,活性炭脫色,超濾除小分子雜質,最后冷凍干燥獲得γ-聚谷氨酸(γ-PGA)成品。確定了全水化無醇提取條件:下罐調pH6.0,發酵液稀釋2倍;硅藻土和紅土配比為2∶1(m∶m),總添加量為1.5%(w/v),除菌率97%以上;脫色條件:活性炭添加量1.5%(w/v)、溫度30℃、pH5、時間60min。超濾選擇10ku的膜包除雜并最終濃縮至原液的1/9。冷凍干燥18h得到的γ-聚谷氨酸純度達90%。無醇提取工藝的探索為工業生產提取γ-PGA提供了重要參考依據。

γ-PGA,除菌,無醇提取,脫色,純化

γ-聚谷氨酸(γ-PGA)是一種天然存在的聚合物,是由L型和D型谷氨酸(Glu),通過γ-谷氨酰胺鍵聚合而成的均聚氨基酸,由于γ-PGA中的Glu有兩個羧基,所以它有兩種異構體:α-PGA和γ-PGA,生物合成的均為γ-PGA,即Glu單體通過α-氨基和γ-羧基形成的酰胺鍵連接;而化學合成的聚谷氨酸則為α-PGA。γ-PGA具有良好的吸水性能、生物相容性、生物降解性和無毒害性,可作為化妝品添加劑、保水劑、高吸水樹脂、重金屬吸附劑、食品添加劑、醫藥載體、組織工程材料等廣泛應用于化妝品、食品、農業、醫藥、合成纖維和涂膜等領域[1-3]。

用芽孢桿菌發酵生產γ-PGA已成為γ-PGA商業化的主要方法,發酵生產多采用有機溶劑絮凝方法提取,在工業生產中提取費用很高并且提取環境危險。一般工藝中發酵液提取多聚合物的主要方法為多次醇析聚沉法,即醇析-復溶-醇析的方法將產物提取出來,有機溶劑的使用在工業提取上比較廣泛,但人為添加的有機溶劑對產物有一定影響。目前,文獻報道優化好的γ-PGA提取工藝提取步驟為:γ-PGA發酵液——酸化稀釋除菌——硅藻土過濾——超濾——鹽析-醇析——真空干燥——γ-PGA成品[4-5],其中,酸化除菌體會降解γ-PGA,造成其降解損失,醇析步驟添加量為4倍溶液體積,使用乙醇較多,其他文獻報道,用其他有機溶劑如異丙醇代替乙醇[6],均未減少有機溶劑的使用。

本論文研究一種不添加有機溶劑提取γ-PGA的全水化提取工藝,結合粉末活性炭脫色技術和膜分離技術,為實現γ-PGA產業化提供了參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

新鮮發酵液γ-PGA,為黃褐色液體,濃度為34g/L,pH7.2,由天津北洋百川生物技術有限公司通過10L發酵罐分批補料發酵得到并提供;白色硅藻土、紅土 嵊州市華力硅藻土制品有限公司;活性炭 福建芝星炭業有限公司;糖化酶 諾維信(中國)生物技術有限公司;牛血清蛋白、硫酸、苯酚 國產分析純。濾布1100目 天臺華南濾布廠。

SBA-40E生物傳感儀 山東省科學院生物研究所;板框過濾裝置 實驗室自制;ML204型電子分析天平 瑞士梅特勒-托利多集團;梅特勒FE20K型PH計 瑞士梅特勒-托利多集團;抽濾裝置 實驗室自制;電導率儀 瑞士梅特勒-托利多集團;超濾設備 合肥信達膜科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 除菌 下罐發酵液調pH6.0,利用板框過濾裝置進行除菌,操作壓力0.12MPa。測定除菌率和γ-PGA損失率,對發酵液稀釋倍數(1.0、1.5、2.0、2.5倍),白色硅藻土和紅土的添加配比(2∶0、1∶1、1∶2、2∶1),以及硅藻土(白色硅藻土和紅土)添加總量(質量m占發酵液體積v比重:1.0%、1.5%、2.0%、2.5%)進行優化,從而確定板框除菌最佳條件。

1.2.2 酶解及蛋白變性 選用諾維信糖化酶,按照酶的最適條件將大分子多糖酶解成小分子糖,酶解條件:pH5.5,55℃,酶添加量為:0.1mL酶液/L除菌上清液,酶解40min。結束后,進行蛋白變性,迅速升溫至80℃,保溫30min。

1.2.3 脫色 選用亞甲基藍吸附值17.5的活性炭進行脫色,對脫色條件進行優化:溫度20、30、40、50、60、70℃;活性炭添加量0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%;脫色最適pH:2、3、4、5、6、7;脫色時間30、40、50、60、80、100min。確定最優條件后,在此條件下,確定清液初始色素濃度(用OD值來反應色素濃度),使在此濃度下脫色率最高且γ-PGA得率最高。

1.2.4 超濾提純 使用超濾裝置對脫色后的清液進行除雜,同時對γ-PGA進行提純,篩選膜包10ku和30ku,條件為:常溫,進口壓0.14MPa,出口壓0.07MPa。定義每100mL清液添加100mL蒸餾水進行循環超濾至100mL,稱為一次循環超濾。檢測保留液谷氨酸含量、色素含量、電導率、γ-PGA濃度和總糖;檢測透過液中的谷氨酸含量、色素含量、電導率和總糖。SBA檢測谷氨酸含量,苯酚硫酸法檢測總糖含量,OD440檢測色素的含量。

1.2.5 真空冷凍干燥 取經提純濃縮后γ-PGA的清液,鋪于平板中,厚度約為0.7cm,放于-80℃冰箱中預凍,過夜。然后將平板置于真空冷凍干燥設備中干燥,調定冷阱溫度-65℃,真空度-0.09Mpa,干燥時間18h,得到白色γ-PGA樣品。

1.3 分析方法

1.3.1 谷氨酸檢測 采用SBA-40E生物傳感分析儀測定谷氨酸濃度[6]。

1.3.2 γ-PGA含量檢測 取清液加入4倍體積的無水乙醇沉淀產物,棄上清加適量蒸餾水復溶沉淀至原體積,檢測水解前后谷氨酸的含量,前后的差值即為γ-PGA含量[7-10]。

1.3.3 色素濃度測定 利用紫外分光光度計在440nm測定吸光度[11]。

1.3.4 電導率檢測 每次均取相同體積(10mL)的待測液,利用電導率儀進行測定[12]。

1.3.5 總糖測定 采用蒽酮-硫酸法進行測定[13-14]。

1.3.6 蛋白測定 采用Bradford法進行測定[15]。

1.3.7 菌體濃度測定 將待測液稀釋適當濃度,利用紫外分光光度計在660nm測定吸光度[16]。

1.3.8 除菌率的計算方法:

計算公式如下:

式(1)

式中：Y1:除菌率;OD1:原液稀釋25倍后OD660吸收值;OD2:處理后清液稀釋25倍OD660吸收值。

1.3.9 γ-PGA損失率和γ-PGA得率的計算方法

γ-PGA損失率計算公式如下:

式(2)

式中：Y2:γ-PGA損失率,%;m1:處理前溶液中γ-PGA的濃度,(g/L);m2:處理后溶液中γ-PGA的濃度,(g/L)。

γ-PGA得率的計算公式如下:

式(3)

式中：Y3:γ-PGA得率,%;c0:處理后溶液中γ-PGA的濃度,(g/L);c:原溶液中γ-PGA的濃度,(g/L)。

1.3.10 脫色率計算方法 脫色率計算公式如下:

式(4)

式中：Y4:γ-PGA發酵液的脫色率,%;A:脫色前γ-PGA發酵液的色素含量(OD值);A0:脫色后γ-PGA發酵液的色素含量(OD值)。

1.3.11 數據統計與分析 所有實驗均重復三次,數據使用SPSS 10.0軟件進行方差分析[17]。

2 結果與討論

2.1 除菌條件優化

2.1.1 發酵液稀釋倍數對發酵液預處理的影響 首先考察了稀釋倍數對發酵液預處理的影響,由圖1可以清晰地看出,隨著稀釋倍數的增加,除菌率逐漸降低,當發酵液稀釋倍數小于2.0時,除菌率均在97%以上,其中,稀釋倍數為2.0時,除菌率為97.21%,而當稀釋倍數大于2.0時,除菌率嚴重下降;觀察γ-PGA損失率,隨著稀釋倍數的增加,γ-PGA損失率呈下降趨勢,當稀釋倍數為2.5時,達到最低。綜合考慮,選擇除菌率較高,γ-PGA損失率較低的稀釋倍數,應選擇稀釋倍數為2.0進行除菌。

圖1 稀釋倍數對發酵液預處理的影響Fig.1 Effect of dilution on pretreatment fermentation liquor

2.1.2 白色硅藻土和紅土的配比對發酵液預處理的影響 在板框過濾除菌的過程中,設定硅藻土總添加量為1.5%(w/v)時,對白色硅藻土和紅土配比進行優化,結果發現紅土目數較白色硅藻土細,并且吸附效果優于硅藻土,在白色硅藻土與紅土配比為2∶1時,除菌率達最高值,之后除菌率沒有明顯變化,但γ-PGA損失率升高,故選擇白色硅藻土與紅土配比為2∶1,此時除菌率達96.35%,γ-PGA損失率較低。

圖2 硅藻土紅土的配比對發酵液預處理的影響Fig.2 Effect of different ratio of diatomite added on pretreatment fermentation liquor

2.1.3 硅藻土總添加量對發酵液預處理的影響 選定白色硅藻土與紅土配比為2∶1時進行除菌實驗,由圖3可知,當助濾劑總添加量為1.5%(w/v)時,菌體的去除率較高,達97.27%,總添加量再增加時,除菌率變化不大,但γ-PGA損失率也逐漸升高,這是由于過量的硅藻土形成的濾餅層比較致密,增大了γ-PGA損失率。

圖3 硅藻土總添加量對發酵液預處理的影響Fig.3 Effect of diatomite added on pretreatment fermentation liquor

圖4 脫色溫度、添加量、pH和時間對脫色率的影響Fig.4 Effect of temperature,adding quantity, pH,and time on the decolourization ratio注:a:脫色溫度對脫色率的影響;b:活性炭添加量對脫色率的影響;c:清液pH對脫色率的影響;d:脫色時間對脫色率的影響。

綜上所述,確定了板框過濾除菌的最優條件:發酵液稀釋倍數2.0,白色硅藻土∶紅土配比2∶1,其總添加量1.5%(w/v),除菌率97%以上。

2.2 活性炭脫色條件優化

2.2.1 脫色條件對脫色效果的影響 由圖4a可知,當溫度在30℃時,脫色率達最高點,隨著溫度繼續升高,脫色率明顯下降;由圖4b可知,脫色率隨著活性炭添加量的升高而升高,當添加量到達1.5%(w/v)時,脫色率為78.72%,當添加量到達2.0%(w/v)時,脫色率為79.19%,脫色率升高趨勢不明顯,之后略有下降;由圖4c可知,pH為5.0時,具有最佳的脫色效果,pH>5.0或pH<5.0脫色率均會降低;由圖4d可知,隨著脫色時間延長脫色率的變化趨勢為先升高后略有降低后又升高,說明在時間為60min時,脫色率達到飽和點,當時間大于60min后,隨著時間的延長,脫色率略有細微的變化,推測原因為活性炭吸附飽和后將處于一定程度內的動態平衡,造成脫色率略有差別。

綜上所述,最優的脫色條件為:活性炭添加量1.5%(w/v)、溫度30℃、pH5.0、時間60min。

2.2.2 初始上清顏色對脫色效果的影響 粉末活性炭吸附原理既有物理吸附也有化學吸附,活性炭多孔結構提供了大量的表面積,達到吸附雜質的目的,活性炭孔壁上的大量分子也可以產生強大的引力,使雜質被吸引到孔徑中,通過改變原材料和活化條件來使活性炭有不同孔徑結構,從而適用于不同雜質吸收[17]。選用的亞甲基藍吸附值17.5的活性炭可以吸附清液中大量色素、蛋白和多糖,同時也會吸附少量的γ-PGA。為了得到較好的脫色效果,同時兼顧γ-PGA得率,因此本實驗在最佳脫色條件下對初始色素濃度進行篩選。

如圖5顯示,當清液初始OD440為0.344時,脫色率最高,達83.38%,此時,γ-PGA得率為90.37%,脫色后清液γ-PGA的含量為6.1g/L,此時脫色后OD440為0.064,脫色效果最佳,γ-PGA得率最高。

圖5 脫色率和γ-PGA得率與OD440分析圖Fig.5 The analysis of the relationship of decolourization ratio and receiving rate

2.3 超濾提純條件優化

通過實驗室制備的γ-PGA分子量在300ku以上,經過上述步驟處理后,含有小分子雜質,如小分子蛋白、多糖、無機鹽、色素及其他小分子可溶物。利用超濾中不同分子量膜包截留作用,將這些雜質除掉,并達到濃縮的目的。選用10ku膜包和30ku膜包循環超濾進行除雜效果對比,結果如圖6～圖9。

分析保留液,圖6中結果顯示,選用10ku膜包對清液進行超濾,在第4次超濾時,總糖和電導率的下降趨勢減小,OD440和谷氨酸(Glu)為0,說明小分子雜質已全部被洗出,且γ-PGA損失較小,在第5次超濾時,γ-PGA損失了9.83%,但第6次時γ-PGA損失較第4次并沒有明顯增加,可推斷第5次γ-PGA濃度下降是檢測誤差導致,并非損失。γ-PGA在第2、3、4次超濾時損失沒有增加,趨于較穩定狀態,說明有發酵中產生的分子量較小的γ-PGA被洗出。對比透過液(圖7)中各項指標檢測,第4次超濾后,洗出的色素、離子和總糖的檢測指標變化不大,趨于穩定,說明超濾除雜已經完成。

圖6 10ku超濾時超濾次數對保留液的影響Fig.6 Effect of ultrafiltrated times on intercepted liquid with 10ku ultrafiltration

圖7 10ku超濾時超濾次數對透過液的影響Fig.7 Effect of ultrafiltrated times on permeabled liquid 10ku ultrafiltration

圖8 30ku超濾時超濾次數對保留液的影響Fig.8 Effect of ultrafiltrated times on intercepted liquid with 30ku ultrafiltration

分析30ku超濾后保留液的檢測結果(圖8),在第3次超濾后,總糖、色素和電導率趨于0,但γ-PGA仍在下降,說明30ku膜包能洗出較多γ-PGA,損失較大,對比透過液(圖9),在第4次超濾時,雖然顯示有多糖、離子和色素被洗出,但量都很小,說明用30ku膜超濾,在第3次就已經基本完成洗滌,但此時γ-PGA含量已降到4.5g/L,損失較多,故應選用10ku膜進行超濾純化,超濾次數為4次。用10ku循環超濾濃縮,考察不同濃縮倍數下滲透通量和γ-PGA得率的變化,確定最終濃縮倍數(圖10)。

圖9 30ku超濾時超濾次數對透過液的影響Fig.9 Effect of ultrafiltrated times on permeabled liquid 30kDa ultrafiltration

圖10 超濾濃縮倍數對滲透通量和得率的影響Fig.10 The influence of ultrafiltration concentration ratio to permeate flux and receiving rate

由圖10可知,隨著濃縮倍數增加,滲透通量逐漸降低,且降低的幅度逐漸增大,γ-PGA得率隨著濃縮倍數增高而降低,在第9次后趨于平緩,之后γ-PGA得率隨濃縮倍數的增加而變化很小,故最終確定將清液濃縮至1/9。

綜上,選擇10ku進行超濾,超濾4次后,將清液濃縮至1/9,之后進行冷凍干燥18h,得到白色γ-PGA樣品,純度最低為90%,灰分4.3%,蛋白質0.01%,總糖含量0.05%,谷氨酸(Glu)含量0%。

3 結論

γ-PGA發酵液有一定粘度,稀釋后板框過濾除菌,助濾劑選擇硅藻土和紅土搭配,配比為2∶1,起到助濾除菌的作用,除菌效果與離心相同,除菌率達97%以上,γ-PGA未降解。發酵生產γ-PGA時,會產生多糖,用酶解法去除大分子多糖,在經過后續超濾去除小分子糖,可達到有效去除多糖的結果。確定初始的色素濃度對脫色有一定的意義,實驗證明此方法在脫色上有顯著效果,γ-PGA發酵液中,色素多為水溶性色素,且大分子量的色素居多,活性炭在吸附色素的同時,對γ-PGA也有一定的影響,將清液稀釋到OD4400.344后再進行脫色,脫色效果明顯提高,且γ-PGA得率較高。采用循環超濾濃縮的方法去除小分子雜質如無機鹽、小分子色素、谷氨酸和小分子糖等。選擇截留分子量為10ku的膜組件,循環定容超濾4次除掉小分子雜質后,將清液濃縮至1/9。濃縮液真空冷凍干燥,得到白色γ-PGA樣品,純度90%以上,灰分4.3%,蛋白質0.01%,總糖含量0.05%,谷氨酸含量0%。

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Study on the separation and purification ofpoly-γ-glutamtic acid without any organic solvents

QIAO Chang-sheng1,2,ZHANG Miao-miao1,LIU Xiao-chen3,GAO Ming-hao1,LIN Hong-xiu1,LOU Peng2

(1.Key Laboratory of Industrial Microbiology,Ministry of Education,College of Biotechnology,Tianjin University ofScience and Technology,Tianjin 300457,China；2.Tianjin Beiyang Biotrans Co.,Ltd,Tianjin 300457,China；3.Key Laboratory of Food Nutrition and Safety,Ministry of Education,Tianjin 300457,China)

For separating γ-PGA without any alcohol,a extractive method was developed to separate and purify γ-PGA from culture broth. The culture broth was filtrated with diatomite to remove cells,and the macromolecular polysaccharide was catabolized by enzymolysis. Then,active carbon was added as decoloring agent and the small molecular weight impurity was removed by ultrafiltration. Finally,purified γ-PGA was obtained by lyophilization. The optimum quantity of using mixed diatomite loading(ratio of coarse to small diatomite 2∶1)was 1.5%(w/v)and over 97% of cells were removed from γ-PGA broth. The optimum conditions of decoloration were as follows:the addition of active carbon 1.5%(w/v),temperature 30℃,pH5,processing time 60min. The optimum membrane module of ultrafiltration was 10ku and the concentration rate of ultrafiltration was 9:1. The purity of γ-PGA was 90% after lyophilization for 18h. The study of separation and purification of poly-γ-glutamtic acid without any organic solvents was imperative and it provided an important basis for Industrial production of γ-PGA.

γ-PGA;remove the bacteria;separation without organic solvents;decoloration;purification

2014-09-02

喬長晟(1969-),男,博士,教授,研究方向:氨基酸及有機酸發酵。

TS201.2

B

1002-0306(2015)13-0247-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.13.044