海洋低溫α-淀粉酶水解玉米淀粉及其產物生物活性

呂明生,王淑軍,房耀維,焦豫良,劉 姝,劉 媛,徐 艷

(1.淮海工學院海洋學院,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋資源開發研究院,江蘇連云港 222005;3.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心,江蘇連云港 222005)

海洋低溫α-淀粉酶水解玉米淀粉及其產物生物活性

呂明生1,2,王淑軍2,3,房耀維1,2,焦豫良1,2,劉 姝1,2,劉 媛1,徐 艷1

(1.淮海工學院海洋學院,江蘇連云港 222005;2.江蘇省海洋資源開發研究院,江蘇連云港 222005;3.江蘇省海洋生物產業技術協同創新中心,江蘇連云港 222005)

本研究旨在開發適用于工業生產的新型酶制劑,采用研制的新型海洋低溫α-淀粉酶,研究該酶水解玉米淀粉最佳工藝條件以及其產物特性。低溫α-淀粉酶最佳的工藝條件為溫度30 ℃、時間90 min、淀粉濃度4.5%、加酶量8 U/g、pH6.5。酶解產物通過TLC和HPLC分析,酶解產物中主要為麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖,其中麥芽四糖和麥芽五糖的和達到69.62%。酶解產物對羥自由基和DPPH自由基均有清除作用,對羥自由基的清除效果要好于對DPPH自由基的清除。

低溫α-淀粉酶,玉米淀粉,酶解,羥自由基,DPPH自由基

低溫酶也稱適冷酶(cold-adapted-enzyme),是指在低溫條件下能有效催化生化反應的一類酶,最適反應溫度比普通酶要低20～30 ℃,而且在0 ℃有一定的活性[1]。低溫α-淀粉酶在面團發酵、污水處理、釀造、洗滌劑、食品、紡織和生物燃料生產方面具有廣泛的工業應用[2],不僅可用于焙烤工業的保鮮劑、醫藥工業中的糖漿制造、紡織工業中用作脫油爐、造紙和紙漿工業淀粉漿料的粘度控制,而且可在低溫下的廢水處理和生物修復[3-4]。

海洋具有高鹽、低溫、高壓等極端環境,使得海洋來源的低溫α-淀粉酶具有陸地微生物酶不具有的獨特催化性質和應用潛力[5-6]。人們已從海洋微生物如細菌[7-9]、放線菌[10]和真菌[11]中篩選低溫淀粉酶。低溫淀粉酶能節約能量,降低生產成本,在全世界的需求量逐年劇增,國外研究生產的低溫α-淀粉酶已創造了10億美元的價值[3],而國內低溫淀粉酶的生產還缺乏,有關低溫淀粉酶的報道尚處于實驗室研究階段。

目前應用的α-淀粉酶主要是中高溫淀粉酶(最適作用溫度約為50 ℃以上),這些酶只有在較高溫度下才具有較好的催化活性。α-淀粉酶水解淀粉研究報道很多對麥麩淀粉[12-13]、番薯淀粉[14]、芭蕉芋淀粉[15]、玉米淀粉[16-18]、木薯淀粉[19]、大米淀粉[20]、馬鈴薯淀粉[21]和板栗淀粉[22]的水解研究,但大部分采用中溫和高溫α-淀粉酶,水解板栗淀粉采用的低溫α-淀粉酶來自Sigma公司的酶作用溫度為40 ℃的低溫α-淀粉酶[23]。

本實驗采用自主研制的低溫α-淀粉酶[9]水解玉米淀粉,研究水解條件以及水解產物的生物特性,以期為今后低溫α-淀粉酶的工業應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

玉米淀粉 淀粉純度100%,菱花集團有限公司;硅膠板 上海信誼儀器廠生產的GF254硅膠板,厚度為0.20～0.25 mm;Tris、濃鹽酸、3,5-二硝基水楊酸、無水亞硫酸鈉、苯酚、氯仿、冰醋酸、濃硫酸、正丁醇、維生素C 國藥集團化學試劑有限公司;DPPH Sigma公司;iMarK680型酶標儀 美國BioRAD公司;DK-S24型電熱恒溫水浴鍋 上海精宏實驗設備有限公司;SevenEasy(S20)pH儀 上海梅特勒-托利多儀器有限公司;BS323S型電子天平 北京賽多利斯科學儀器系統有限公司;BR4i multifunction centrifuge 型冷凍離心機 法國Thermo公司;超聲波清洗器 上海科導超聲儀器有限公司;格蘭仕微波爐 廣東佛山市格蘭仕集團有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海洋低溫ɑ-淀粉酶 將海洋交替假單胞菌GS230(Pseudoalteromonasarctica)[9]以2.5%的接種量,接種于產酶發酵培養基中,180 r/min,20 ℃培養24 h,10000 r/min離心10 min,上清液用一萬超濾膜進行超濾,再將超濾液進行冷凍干燥即為海洋低溫ɑ-淀粉酶。

1.2.2 酶解工藝流程 精確稱取一定質量的玉米淀粉,加水調成所需濃度的粉漿→加酸或堿調節至所需pH→移入恒溫水浴鍋中按要求加入一定量的低溫α-淀粉酶→反應一段時間后取出滅酶并冷卻液化液→測定DE值。

1.2.3 DE值測定方法 用3,5-二硝基水楊酸(DNS)法測定還原糖,水解液中還原糖以葡萄糖計占干物質的百分比為DE值。

1.2.4 水解玉米淀粉工藝的優化

1.2.4.1 單因素實驗 分別研究時間、加酶量、淀粉濃度、溫度和pH對玉米淀粉水解的影響,實驗均設三個平行。具體條件如下。

時間對水解玉米淀粉的影響:5%淀粉濃度,加酶量按淀粉的重量每克加入低溫淀粉酶4 U,即4 U/g,在30 ℃分別水解30、60、90、120、150 min,測還原糖含量。

加酶量對水解玉米淀粉的影響:淀粉濃度5%,加酶量分別為2、4、6、8、10 U/g,在30 ℃分別水解90 min,測還原糖含量。

淀粉濃度對水解玉米淀粉的影響:淀粉濃度分別1%、2%、3%、4%、5%、6%,加酶量為4 U/g,在30 ℃分別水解90 min測還原糖含量。

溫度對水解玉米淀粉的影響:淀粉濃度4%,加酶量為4 U/g,分別在20、25、30、35、40 ℃水解90 min,測還原糖含量。

pH對水解玉米淀粉的影響:將糊化好的4%的玉米淀粉分別調節pH為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0,加酶量為4 U/g,在30 ℃分別水解酶解90 min,測還原糖含量。

1.2.4.2 正交實驗 在單因素實驗的基礎上,設計正交實驗L9(34),實驗因素水平見表1。

表1 低溫α-淀粉酶正交實驗因素水平表

1.2.5 水解產物分析

1.2.5.1 薄層層析法(TLC) 用正交實驗得到的最佳條件水解淀粉,同時檢測時間對產物的影響,水解時間分別為1、3、5 h。產生的反應產物為樣品進行鑒定。將反應得到的樣品煮沸5 min,用75%乙醇溶液進行溶解,10000 r/min離心15 min,獲得上清液。用硅膠板GF254,流動相為氯仿∶冰醋酸∶水=5∶7∶1。檢測時噴灑含20%濃硫酸的乙醇試劑,再放入100 ℃烘箱烘干3 min，得到結果。

1.2.5.2 高效液相色譜法(HPLC) 標品處理:配等質量分數的葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、四糖、五糖和六糖,超純水溶解。測高效液相圖譜。樣品處理:加酶量8 U/g、淀粉濃度4.5%、溫度30 ℃、pH6.5,水解90 min后,取5 mL,測高效液相圖譜。色譜條件:色譜柱為Waters Sugar-Pak1(300 mm×7.8 mm),流動相為水,流速為0.4 mL/min,柱溫為85 ℃。

1.2.6 酶解產物抗氧化性

1.2.6.1 水解液粗多糖的測定 優化最佳水解條件水解玉米淀粉,蒽酮硫酸法測定水解液中的總糖[24],DNS法測定還原糖[19],粗多糖等于總糖減去還原糖。維生素C作為陽性對照,測定水解液的抗氧化性。

1.2.6.2 對羥自由基(·OH)清除率的測定 取10 mL具塞試管,按順序加入5 mmol/L鄰二氮菲1.5 mL,0.5 mol/L、pH7.4的磷酸緩沖液3 mL,7.5 mmol/L的FeSO4,1 mL,不同多糖濃度酶解液3 mL,1 mL體積分數0.1%的H2O2,用重蒸水稀釋到10 mL,37 ℃保溫60 min,測A510(為As),空白管(Ab)不加H2O2及酶解液,對照管(Ap)只加H2O2不加酶解液[23]。

1.2.6.3 DPPH自由基清除率的測定 在比色管中依次加入3.5 mL 6.5×10-5mol/L DPPH溶液和0.5 mL不同多糖濃度酶解液,混勻20 min后,于517 nm處測定吸光值。用3.5 mL無水乙醇和0.5 mL蒸餾水作為參照,以上各實驗均做3組平行。As為加入樣品的吸光度,Ar為本底吸收的吸光度,A0為空白溶液的吸光度[24]。

2 結果與分析

2.1 水解玉米淀粉的單因素實驗

2.1.1 時間對水解玉米淀粉的影響 由圖1可知,在90 min之前,DE值隨時間的延長變化較大,90 min之后,DE值變化趨于平緩,最后DE值基本穩定在23%～25%之間。分析原因,可能是因為反應體系中的酶液被完全利用,導致90 min后圖線趨于平緩。從節約時間和效益最大化的角度考慮,后續實驗反應時間選擇為90 min。

圖1 時間對水解玉米淀粉的影響Fig.1 Effect of time on the degree of hydrolysis corn starch

2.1.2 加酶量對水解玉米淀粉的影響 由圖2可知,當加酶量從2 U/g增加到4 U/g時,DE值增加近20%;而當加酶量從4 U/g增加到8 U/g時,DE值僅增加5%左右,變化漸漸趨于平緩,最后基本穩定在27%～31%之間。可能是因為反應體系中能夠被利用的底物漸漸耗盡,導致加酶量大于4 U/g時的圖線趨于平緩。從節約成本的角度考慮,后續玉米淀粉實驗的加酶量選擇4 U/g。

圖2 加酶量對水解玉米淀粉的影響Fig.2 Effect of enzyme dosage on the degree of hydrolysis corn starch

2.1.3 淀粉濃度對水解玉米淀粉的影響 由圖3知,淀粉濃度從1%增加到4%時,DE值增加幅度較大;當淀粉濃度上升到5%時,DE值突然下降,可能是因為隨著淀粉濃度的增加,其本身流動性變差,加入酶液以后,底物不能與酶液充分接觸,從而使水解效果變差。從節約成本,提高效率的角度考慮,后續玉米淀粉實驗的淀粉濃度選擇4%。

圖3 淀粉濃度對水解玉米淀粉的影響Fig.3 Effect of substrate concentration on the degree of hydrolysis corn starch

2.1.4 溫度對水解玉米淀粉的影響 由圖4可知,在30 ℃之前,隨著溫度的升高,DE值逐漸增大,說明30 ℃之前,溫度越高,酶促反應速率越大。本實驗室制備的低溫α-淀粉酶最適作用溫度為30 ℃[9],后續玉米淀粉的相關實驗溫度選擇30 ℃。

圖4 溫度對水解玉米淀粉的影響Fig.4 Effects of temperature on the degree of hydrolysis corn starch

2.1.5 pH對水解玉米淀粉的影響 由圖5可知,在pH5.5時DE值達到最高,在pH5.5～6.5之間水解效果比較穩定,過酸或堿性環境都會對酶促反應產生抑制作用,玉米淀粉水解時的最適pH為5.5。

圖5 pH對水解玉米淀粉的影響Fig.5 Effect of pH on the degree of hydrolysis corn starch

2.2 低溫α-淀粉酶水解玉米淀粉的正交實驗

根據以上研究結果,分別選擇加酶量、淀粉濃度、溫度、pH四個影響較大的因素,并以各因素的最佳實驗條件為依據確定其最佳使用范圍,進行正交實驗。實驗結果見表2。

表2 玉米淀粉正交實驗L9(34)

將獲得數據用SPSS 17 Statistics軟件進行方差分析得表3:

表3 正交實驗方差分析

從表3中可看出,各因素對實驗結果的重要次序為A>D>B>C,由方差分析可知,加酶量(A)和pH(D)對玉米淀粉的水解顯著性影響(p<0.05)。根據K值和極差分析,選定玉米淀粉水解最佳條件為A3B3C1D3,即優化是最佳條件為:加酶量8 U/g、淀粉濃度4.5%、溫度25 ℃、pH6.5。在此條件下,進行驗證實驗,得到DE值為57.98。優化后的條件更有利于對玉米淀粉的水解。

2.3 玉米淀粉水解產物分析

2.3.1 薄層層析(TLC) 由圖6可知,玉米淀粉水解產物大致有四種,分別為麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、五糖。3 h時開始有少量葡萄糖生成,主要產物為麥芽糖和異麥芽三糖。5 h的結果表明異麥芽三糖和麥芽五糖的量在增加,但從各種糖的比例上來看,沒有大的變化,因此,水解時間的適當延長有利于寡糖的產生。

圖6 玉米淀粉水解產物薄層層析Fig.6 Corn starch hydrolyzate TLC

2.3.2 高效液相色譜法(HPLC) 通過HPLC對優化條件下的酶解產物的定量分析,水解產物有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、麥芽四糖、麥芽五糖,其中水解產物中麥芽五糖含量很高。根據峰面積計算,麥芽四糖和麥芽五糖的總和達到69.62%。低聚麥芽糖可以促進腸道有益微生物的生長,改善腸道內環境[25],有利于健康,這為利用低溫淀粉酶對玉米淀粉進行深入加工提供了一定的依據。

圖7 水解產物的HPLC圖譜Fig.7 HPLC of hydrolyzate

2.4 玉米淀粉水解產物的抗氧化作用

2.4.1 羥自由基清除率 由圖8可知,水解液對羥自由基清除作用較好,最佳條件下水解的水解液可以清除反應體系中的羥自由基;然而與維生素C相比,其清除作用還是較弱。玉米淀粉水解液的清除作用比甘薯多糖的清除作用弱[23],與山藥多糖的清除作用相似[25]。玉米是我國的主要糧食作物之一,玉米淀粉在我國消費量較大,其水解產物具有較好的抗氧化作用是值得關注的。

圖8 玉米淀粉水解產物的羥自由基清除率Fig.8 Scavenging rate of hydroxyl radical from hydrolyzed corn starch

2.4.2 DPPH自由基清除率 由圖9可知,和維生素C相比,玉米淀粉水解液對DPPH自由基的清除能力不強,最佳條件下水解的水解液可以清除30%的DPPH自由基。這可能是因為水解液中多糖分子上的還原性的半縮醛羥基與DPPH自由基單電子的反應作用弱。

圖9 玉米淀粉水解產物的DPPH自由基清除率Fig.9 Scavenging rate of DPPH radical from hydrolyzed corn starch

3 結論

本實驗采用研制的新型海洋低溫α-淀粉酶,結合單因素實驗和正交實驗優化了α-淀粉酶水解玉米淀粉的工藝參數,并對水解產物的生物活性進行研究。結果表明:低溫α-淀粉酶水解玉米淀粉的最佳工藝條件為溫度30 ℃、時間90 min、玉米淀粉濃度4.5%、加酶量8 U/g、pH6.5。TLC分析水解產物主要為麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、麥芽五糖,3 h開始有少量葡萄糖生成,主要產物為麥芽糖和異麥芽三糖。HPLC分析水解產物有葡萄糖、麥芽糖、麥芽三糖、異麥芽三糖、麥芽四糖和麥芽五糖,其中水解產物中麥芽五糖含量很高,根據峰面積計算,麥芽四糖和麥芽五糖的總和達到69.62%。水解產物對羥自由基和DPPH自由基均有清除作用,對羥自由基的清除效果好于對DPPH自由基的清除效果。

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Hydrolyzate of corn starch by marine cold-adaptedα-Amylase and its biological activity

LV Ming-sheng1,2,WANG Shu-jun2,3,FANG Yao-wei1,2,JIAO Yu-liang1,2,LIU Shu1,2,LIU Yuan1,XU Yan1

(1. School of Marine Science and Technology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China;2.Jiangsu Marine Resources Development Research Institute,Lianyungang 222005,China;3. Co-Innovation Center of Jiangsu Marine Bio-industry Technology,Huaihai Institute of Technology,Lianyungang 222005,China)

The purpose of this study was to develop a new enzyme for industrial production. A kind of marine cold-adaptedα-amylase was adopted to hydrolyze corn starch. Some factors which could influence enzymatic hydrolysis were studied. The optimal conditions of corn starch hydrolysis with theα-amylase:temperature 30 ℃,hydrolysis time 90 min,substrate concentration 4.5%,enzyme amount 8 U/g and pH6.5. The amylase could hydrolyze raw starch into maltose,maltotriose,isomaltotriose,maltotetraose and maltopentaose by TLC and HPLC of analysis. The quantity of maltotetraose and maltopentaose was 69.62%. The hydrolyzate had the scavenging effect on the hydroxyl radical and DPPH radical. The scavenging effect of the hydroxyl radical was better than the DPPH radical.

cold-adaptedα-amylase;corn starch;enzymatic hydrolysis;hydroxyl radical;DPPH radical

2015-02-09

呂明生(1963-),男,學士,教授,研究方向:食品生物技術,E-mail:mingshenglu@hotmail.com。

國家海洋公益性行業科研專項(201205020-8)；國家自然科學基金(31271929)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)23-0152-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.023