雙孢菇漆酶的固定化及其對鄰苯二甲酸二甲酯降解的研究

李 飛,夏文靜,周 惠,顧 波

(南京師范大學泰州學院 生物技術與化學工程學院,江蘇泰州 225300)

雙孢菇漆酶的固定化及其對鄰苯二甲酸二甲酯降解的研究

李 飛,夏文靜,周 惠,顧 波

(南京師范大學泰州學院 生物技術與化學工程學院,江蘇泰州 225300)

為提高漆酶的利用效率,進一步開發其在環境治理中的應用,以海藻酸鈉為載體,采用單因素實驗對雙孢菇漆酶凝膠包埋固定化的工藝進行探討,并利用固定化漆酶對鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)進行降解實驗。結果表明,采用直接包埋方式,固定化最佳單因素條件為:給酶量160 U/g載體,海藻酸鈉濃度為3%,CaCl2濃度為0.15 mol/L,固定化時間為2 h,可以獲得較佳的固定化效果。利用固定化漆酶降解DMP時,降解率隨DMP初始濃度的增加而下降,在pH3、4.5對DMP具有較好的降解效果,在25 mg/L的DMP溶液(pH4.5)中添加小分子介質ABTS濃度達到0.3 mmol/L,投加2 U/g固定化小球反應24 h,降解率最高達到56.9%。研究結果為處理含DMP污染提供了一種有效的方法和理論基礎。

漆酶,固定化,鄰苯二甲酸二甲酯,降解

鄰苯二甲酸酯類(Phthalic acidester,PAEs)被廣泛用于塑料、農藥、化妝品、汽車、服裝、電線電纜等產業[1-2],是世界上生產量大,應用范圍廣的人工合成有機化合物之一[3]。由于鄰苯二甲酸酯增塑劑并非與樹脂共價連接,在塑料及其制品中呈游離狀態,穩定性較差,極易釋放到環境中,廣泛存在于大氣、水體、土壤、食品以及生物體內[4-6],成為全球最普遍的污染物之一[7-8]。研究表明,PAEs及其降解產物會引起癌癥并損害腎臟,干擾動物及人類的生殖系統和發育[9-11]。此外,土壤中的PAEs污染對植物生長、品質和生理生化特征及土壤微生物代謝多樣性和遺傳多樣性產生顯著影響[12-14]。

PAEs在環境中的自然理化降解十分緩慢,主要依賴生物降解作用[5,15-16]。國內外學者已就PAEs的微生物降解做了大量的研究,主要集中在篩選高效降解菌株及其降解特性[3,5,9,17]。迄今為止,利用生物酶制劑降解PAEs的報道較少,有研究報道幾丁質酶和酯酶對PAEs具有較好的降解效果[18]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,可催化多種酚類及其衍生物、羧酸及其衍生物和非酚類化合物等氧化,因其廣泛的底物特異性,在環境治理領域具有廣闊的應用前景,能顯著減少排放到環境中的有毒污染物[19]。而利用真菌漆酶催化降解鄰苯二甲酸酯類還未見報道。由于漆酶易溶于水,限制了它在實際中的應用。固定化酶可以保持酶高效催化的特點,提高酶的穩定性,此外,固定化酶極易與底物、產物分開,有利于酶的多次重復,從而提高了酶的使用效率[20]。本實驗選用廉價的海藻酸鈉作為載體,研究了固定化雙孢菇漆酶的方法及其條件,并以PAEs中結構最簡單的鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)作為研究對象,首次利用固定化漆酶對DMP進行降解研究,旨在促進漆酶在處理含DMP污染等方面提供重要參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

漆酶由雙孢菇菌株(Pleurotuseryngii)液態發酵法制備,其粗酶液的酶活力為3.5 U/mL。2,2′-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(簡稱ABTS)購自sigma公司,甲醇為色譜純,鄰苯二甲酸二甲酯及海藻酸鈉等試劑均為分析純。

5810型高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司;UV1000紫外可見分光光度計 上海天美科學儀器有限公司;Mili-Q純水系統 美國Milipore公司;1260型液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 漆酶的固定化及固定率的測定 將質量分數為3%的海藻酸鈉和漆酶酶液(3.5 U/mL)按照一定比例混合均勻,用10 mL注射器將海藻酸鈉與漆酶混合液逐滴加入到0.15 mol/L的等體積的CaCl2溶液中,形成光滑的凝膠小球,于4 ℃冰箱中固化2 h后取出洗凈,貯存于4 ℃冰箱中備用。

比較不同單因素對漆酶固定化的影響,包括固定化時間(1～4 h,間隔1 h)、海藻酸鈉濃度(0.5%、1%、2%、3%、4%)、給酶量(40、80、120、160、300 U/g絕干載體)及CaCl2濃度(0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mol/L)。若無特殊說明,固定化條件采用:在海藻酸鈉質量濃度為3%,CaCl2濃度為0.15 mol/L,給酶量為160 U/g載體條件下固化2 h。

分別測定固定化過程中加入游離酶的總活力M0以及固定化后上清液中酶的總活力M1。固定率(%)=(M0-M1)/M0×100。

1.2.2 固定化漆酶對DMP的降解 以DMP為降解對象,探索合適的降解條件,包括降解時間(4、8、12、24、30、48 h)、反應pH(3～5,間隔0.5)、DMP濃度(5、10、15、20、25、50 mg/L)、給酶量(1～5 g固定化小球,2 U漆酶活力/g固定化小球)和小分子介質ABTS濃度(0.01、0.05、0.1、0.2、0.3 mmol/L)。若無特殊說明,降解條件采用:40 mL反應體系含50 mmol/L pH4.5檸檬酸-檸檬酸鈉,DMP(初始濃度為25 mg/L),漆酶酶量(1 g固定化小球,2 U/g固定化小球),30 ℃降解24 h后利用高效液相色譜法測定DMP含量。用同樣的方法在DMP溶液中以不加入固定化小球作為對照。以上實驗處理均為3次重復。

DMP降解率=(ρ0-ρ1)/ρ0×100%,式中,ρ0為降解前DMP質量濃度/(mg/L);ρ1為降解后DMP質量濃度/(mg/L)。

1.2.3 漆酶活力的測定 漆酶測定以2,2′-連氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)(簡稱ABTS)為底物[21]。3 mL反應體系中含有1 mmol/L ABTS底物1 mL,50 mmol/L pH5.0檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液和酶液共計2 mL,420 nm(ABTS的ε=3.6×104mol/(L·cm))下測定反應液3 min內的吸光值變化。一個酶活力單位定義為在當前反應條件下每分鐘氧化1 μmol ABTS所需的酶量。

1.2.4 DMP分析方法 樣品處理:將反應液抽濾除去固定化小球,按1∶1向濾液中加入正己烷,震蕩萃取10 min,收集有機相,水相再用正己烷萃取2次,合并有機相,濃縮至5 mL[22]。用安捷倫1260型液相色譜儀測定DMP含量。

1260型液相色譜儀條件:色譜柱Agilent HC-C18(4.6 mm×150 mm,5 μm),柱溫40 ℃,流動相甲醇∶水=70∶30,流速為1 mL/min。檢測器波長為225 nm,進樣量為20 μL。

2 結果與分析

2.1 海藻酸鈉凝膠固定漆酶條件優化

2.1.1 固化時間對漆酶固定率的影響 如圖1所示,漆酶固定率隨著固化時間的延長而增加,當固化時間超過2 h后固定率隨著時間的延長而逐漸下降,可能是因為Ca2+通過海藻酸鈉膠囊由外向內置換Na+形成海藻酸鈣,如果固定化時間太長,交聯程度高,導致海藻酸鈣凝膠結構過于緊密,從而影響到酶促反應時的反應速率[20],所以最佳固化時間選擇為2 h。

圖1 固化時間對漆酶固定率的影響Fig.1 Effect of immobilized time on the rate of immobilized laccase

2.1.2 海藻酸鈉濃度對漆酶固定率的影響 如圖2所示,當海藻酸鈉的質量濃度為3%時,固定率最高,濃度過高或過低都不利于漆酶的固定化?？赡苁呛Ｔ逅徕c濃度影響凝膠孔徑的大小,濃度過低導致凝膠內的酶分子容易流失,而濃度過大導致凝膠孔徑太小,使底物和產物的擴散受到限制[23]。因此,海藻酸鈉載體的最佳濃度為3%。

圖2 海藻酸鈉濃度對漆酶固定率的影響Fig.2 Effect of concentration of sodium alginateon the rate of immobilized laccase

2.1.3 給酶量對漆酶固定率的影響 如圖3所示,給酶量對酶固定率影響顯著,隨著給酶量的增加,固定率逐漸增加,最大值達到65.7%,當給酶量超過每g絕干載體含160 U時,固定率趨于穩定?？赡苁钱斀o酶量超過160 U/g載體后,交聯載體活性基團結合達到飽和,使得過量的酶呈現游離狀態,無法固定在載體上[20]。為節約成本,固化時給酶量為160 U/g載體較為適宜。

圖3 給酶量對漆酶固定率的影響Fig.3 Effect of different enzyme amounts on the rate of immobilized laccase

2.1.4 CaCl2濃度對漆酶固定率的影響 Ca2+作為交聯劑和海藻酸鈉分子中的-COO-結合,從而使海藻酸鈉-漆酶復合液的液滴交聯固化,形成微球。因此,體系中Ca2+的質量分數對微球的形成和機械強度也有較大的影響。如圖4所示,隨著CaCl2濃度的增加,固定率呈現先增加后降低的趨勢,當CaCl2濃度為0.15 mol/L時,對漆酶的固定率最高。主要原因是當CaCl2濃度過小時,海藻酸鈣凝膠固化不充分,凝膠小球孔徑較大,導致漆酶包埋不完全,容易流失;而CaCl2濃度過高,使固定化小球的交聯程度變強,導致小球的空隙減少,影響物質的傳質[20]。因此,固化時CaCl2最佳濃度為0.15 mol/L。

圖4 CaCl2濃度對漆酶固定率的影響Fig.4 Effect of concentration of CaCl2 on the rate of immobilized laccase

2.2 固定化漆酶對DMP的降解

2.2.1 反應時間對固定化漆酶降解DMP的影響 如圖5所示,隨著作用時間的延長,固定化漆酶對DMP的降解逐漸增加,當超過24 h后,對DMP的降解作用變得緩慢,可能是固定化酶經過長時間作用穩定性降低,且凝膠小球機械強度下降,導致酶活力下降,從而降解作用減弱。因此,選擇最佳降解時間為24 h。

圖5 反應時間對漆酶降解DMP的影響Fig.5 Effect of time on DMP degradation byimmobilized laccase

2.2.2 反應pH對固定化漆酶降解DMP的影響 如圖6所示,在pH3～4范圍內,固定化酶對DMP的降解率隨著pH的增大而減小;而pH4～5范圍內,對DMP的降解呈現先增大后減小的趨勢。不同pH條件下,底物與漆酶的結構和穩定性改變,影響與DMP的親和力,從而影響降解效果[24]。對雙孢菇漆酶的酶學性質研究表明,該漆酶最適反應pH為3,酶活力隨著pH的增大而減小,在30 ℃,pH3條件下處理24 h,酶活力喪失52.3%,而在pH4～5條件下處理24 h漆酶仍保持90%以上的活力,表明該漆酶在pH4～5條件下具有較好的穩定性,這與固定化酶對DMP的降解結果一致,在pH3、4.5具有較好的降解率。

圖6 反應pH對漆酶降解DMP的影響Fig.6 Effect of pH value on DMP degradation by immobilized laccase

2.2.3 固定化酶用量對固定化漆酶降解DMP的影響 如圖7所示,DMP的降解效果隨著酶用量的增大而增大,在酶用量達到1 g固定化小球時,DMP的降解率達到26.2%,繼續增大酶用量,降解效果反而下降。可能是酶用量越多,反應體系內凝膠小球越擁擠,使固定化酶不能充分結合底物,從而降低了固定化酶對DMP的作用。

圖7 固定化酶用量對漆酶降解DMP的影響Fig.7 Effect of immobilized laccase amout on DMP degradation

2.2.4 DMP濃度對固定化漆酶降解DMP的影響 如圖8所示,固定化酶對DMP的降解率隨著DMP濃度的增加而顯著下降。DMP濃度在5～15 mg/L之間時,具有較好的降解效果,降解率均在40%以上。可能是高濃度的DMP對固定化漆酶產生了較大的毒性,大部分漆酶在失活之前沒有參與催化反應,導致對DMP的降解率下降[25]。綜合考慮催化效率及污染實際情況,本研究采用較大的DMP濃度25 mg/mL為研究對象。

圖8 DMP濃度對漆酶降解的影響Fig.8 Effect of different initial DMP concentration on DMP degradation

2.2.5 小分子介質(ABTS)濃度對固定化漆酶降解DMP的影響 漆酶在一些小分子氧化還原介體的協助下具有更強的催化氧化能力,擴大漆酶對底物的作用范圍[26]。由于小分子介質價格昂貴,濃度過高會產生有毒的衍生物,本實驗選擇在反應體系中添加較低濃度的ABTS,結果如圖9所示。小分子介質ABTS的加入能顯著增強固定化酶對DMP的降解,降解率隨著ABTS濃度的增加而增加。當ABTS濃度為0.3 mmol/L時,對DMP的降解率達到56.9%,與不加ABTS相比,降解率增加了一倍?？赡苁切》肿咏橘|ABTS作為電子載體,克服了阻礙漆酶與DMP直接作用的空間結構的影響,從而提高催化效率[27]。

圖9 ABTS濃度對漆酶降解DMP的影響Fig.9 Effect of ABTS concentration on DMP degradation by immobilized laccase

3 結論與討論

鄰苯二甲酸酯類有機化合物污染問題是全球共同關注的問題之一,美國環境保護署和中國環境監測總站已先后將該類污染物列為優先控制的污染物[22]。自然環境中鄰苯二甲酸酯完全礦化的主要依賴于微生物降解,但歸根結底取決于微生物代謝過程中所分泌的降解酶類。近年來,鄰苯二甲酸酯的生物降解方面有一些研究,主要集中在對鄰苯二甲酸酯降解菌的篩選及降解途徑,曾峰等[28]從處理石化廠廢水的活性污泥中分離出1株鄰苯二甲酸酯降解菌FS 1,對鄰苯二甲酸二甲酯具有高效降解作用。金雷等[29]從長期受食品塑料垃圾污染的土壤中通過富集培養和分離純化,獲得一株DBP高效降解菌H-2能高效降解短鏈鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二乙酯和DBP,而對長鏈鄰苯二甲酸二辛酯的降解效果較差。盡管在篩選降解有效微生物方面取得了不錯的進展,但利用關鍵酶對鄰苯二甲酸酯進行降解的研究較少。Kim等[18]報道利用幾丁質酶和酯酶對各類鄰苯二甲酸酯進行純酶降解的比較研究,發現幾丁質酶對鄰苯二甲酸酯的降解更具高效性,且降解產物無毒。漆酶由于其獨特的作用機理,可催化多種酚類和非酚類化合物氧化,在環境治理領域有著廣泛的應用和深入的研究,利用真菌漆酶催化降解鄰苯二甲酸酯類還未見報道。

本實驗研究了雙孢菇漆酶的固定化工藝,并利用固定化漆酶對鄰苯二甲酸二甲酯進行降解,單因素實驗結果表明漆酶的適宜固定化條件為給酶量160 U/g載體,海藻酸鈉濃度為3%,CaCl2濃度為0.15 mol/L,固定化時間為2 h。在上述條件下,利用固定化漆酶降解DMP,可知固定化漆酶在pH3、4.5,DMP濃度在5～15 mg/L范圍內具有較好的降解效果,降解率均高于40%。最佳降解時間為24 h,適宜給酶量為1 g固定化小球,當添加小分子介質ABTS時能顯著促進漆酶對DMP的降解,且降解率隨ABTS濃度的增加而提高,當DMP濃度為25 mg/mL,添加ABTS濃度為0.3 mmol/L時,最高降解率達到56.9%。

研究表明固定化漆酶對DMP具有一定的降解效果,顯示漆酶在處理含DMP污染方面存在一定的應用潛力,研究結果與金德才等[22]報道的利用細菌JDC-3降解DMP的降解率相似,但與曾峰[28]等報道的利用FS 1降解DMP,降解率在24 h內達到100%相比,本研究利用漆酶對DMP的降解效果并不高,還需要進行大量長期的研究工作。

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Immobilization of laccase fromAgaricusbisporusand the degradation of dimethyl phthalate

LI Fei,XIA Wen-jing,ZHOU Hui,GU Bo

(College of Biochemical Engineering,Nanjing Normal University Taizhou College,Taizhou 225300,China)

In order to improve the utilization efficiency and explore the application of laccase in environmental governance,the immobilization process of the laccase fromAgaricusbisporusin sodium alginate gel spheres and the degradation of dimethyl phthalate(DMP)using the immobilized enzyme were investigated by single-factor experiments. According to the research,the best efficiency of immobilization was obtained by using the direct embedding method when the enzyme dosage was 160 U/g carrier,the concentration of sodium alginate was 3%,the concentration of CaCl2was 0.15 mol/L and the immobilized time was 2 h. The degradation rate of DMP was decreased with the improvement of the initial concentration of DMP. In a initial pH of 3 and 4.5,the DMP has a good degradation effect. At a initial DMP concentration of 25 mg/L(pH4.5),the degradation rate of DMP reached 56.9% within 24 h,with 2 U/g the amount of immobilized enzyme-ball and 0.3 mmol/L of ABTS as redox mediator added. The research provided an efficient way and theoretical basis for DMP waste treatment.

laccase;immobilization;dimethyl phthalate;degradation

2015-03-25

李飛(1986-)，男，碩士，講師，主要從事天然產物的開發、酶工程、基因工程，E-mail：kasber-lee@163.com。

泰州市社會發展項目(TS019、TS201337)；南京師范大學泰州學院青年項目(Q201242)；2015年江蘇省高等學校大學生創新訓練計劃項目；江蘇省高校自然科學研究項目(15KJB220004)。

TS201.3

A

1002-0306(2015)23-0177-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.028