桑葚果酒全渣發酵過程中生物活性物質及其抗氧化活性變化的研究

趙紅宇,陳敦洪,鄧 良,雷 激,李玉鋒,張 良,*

(1.西華大學生物工程學院,食品生物技術四川省高校重點實驗室,四川成都 610039;2.遂寧市川梁農業開發有限公司,四川遂寧 629000)

桑葚果酒全渣發酵過程中生物活性物質及其抗氧化活性變化的研究

趙紅宇1,陳敦洪1,鄧 良2,雷 激1,李玉鋒1,張 良1,*

(1.西華大學生物工程學院,食品生物技術四川省高校重點實驗室,四川成都 610039;2.遂寧市川梁農業開發有限公司,四川遂寧 629000)

以桑葚干果為實驗原料,考察桑葚發酵液中總酚、類黃酮、花青素的含量及抗氧化活性能力在發酵過程中的變化情況。結果表明:發現前發酵10 d的類黃酮和花青素類物質受發酵的影響逐漸變少,而總酚類物質含量逐漸升高;抗氧化活性總體上呈先升后降的趨勢,相比于發酵開始時下降了近50%。DPPH和FRAP法相較于ABTS法,更適合表征桑葚發酵液的抗氧化活性變化情況。桑葚酒再經過40 d陳釀最終殘還原糖為14.21 g/kg,乙醇濃度為101.6 g/kg,總酚含量2.124 g/kg,花青素含量579.4 mg/kg,類黃酮41.2 g/kg,DPPH自由基清除率為21.1%,FRAP抗氧化活性為40.9 μmol Fe2+/L,總浸出物為23.241 g/L,符合國家相關標準,為進一步開發高生物活性桑葚精深加工產品提供了一條可行的途徑。

桑葚，抗氧化活性，果酒

桑葚又名桑果,桑棗,葚子,烏葚等,是落葉喬木桑樹(MorusalbaLinn)的果穗。桑葚營養成分豐富,不僅含有多種糖類、氨基酸、脂肪酸、維生素,還含有蘆丁、桑色素、花青素、鞣質、揮發油、磷脂矢車菊素和生物堿等生物活性成分,早在1988年就被衛生部首批列為“既是食品又是藥品”的藥食同源植物之一[1-2]。

目前,國內的桑葚加工產品有桑葚果醬、果汁飲料、桑葚果酒、桑葚果醋等[3]。其中,桑葚果酒已逐漸成為國內外學者的研究熱點,王婷[4]、黃星源[5]等人優化了桑葚果酒的發酵工藝及澄清工藝;史清龍[6]、劉瑋[7]等人分析了桑葚果酒中香氣成分的變化。但對桑葚發酵過程中抗氧化活性變化的研究,則幾乎沒有報道。國外有學者指出,果酒和啤酒的釀造過程會使原料的抗氧化活性能力增強[8];林巧[9]等研究了櫻桃果酒發酵過程中黃酮、多酚的含量及抗氧化性隨時間的變化情況,發現隨著發酵時間的延長,發酵體系中酒精含量逐漸增加,體系中黃酮與多酚含量及清除羥基自由基的能力也緩慢增加。本研究以市售的自然曬干的紫色川南桑葚干果為主要原料,考察深層靜止發酵過程中發酵液中酚類、類黃酮、花青素含量的變化情況,以及通過ABTS、FRAP和DPPH方法衡量其抗氧化活性能力的變化,以期找到其中蘊含的規律,為進一步開發桑葚精深加工產品提供科學支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桑葚干果 產自四川遂寧市川梁農業開發有限公司規模化種植園,經熱風干燥后儲存,要求無霉變、含水率低于15%、色澤深紫、成熟度佳、口感淡甜的桑葚;無水葡萄糖、安琪果酒酵母(安琪葡萄酒果酒專用酵母RW)、焦亞硫酸鈉、檸檬酸 均為食品級。

YJ-875型醫用超凈工作臺、恒溫搖床培養箱、臺式干燥箱 重慶醫療設備廠;751 GW紫外、可見分光光度計 惠普上海分析儀器有限公司;JA2003電子天平 上海天平儀器廠;LD5-2A離心機 北京醫用離心機廠;酶標儀 美國Bio-Rad 公司;氣質聯用系統 日本島津公司GC20,配GC-Solution 7.0數據分析工作站。

1.2 實驗方法

1.2.1 主要培養基的制作 種子培養基(g/L):葡萄糖5.0,酵母粉5.0,蛋白胨5.0,(NH4)2SO41.5,KH2PO41.5,MgSO4·7H2O 0.65,CaCl22.8,pH6.0,115 ℃條件下高壓蒸汽滅菌15 min。

菌種活化:取0.5 g干酵母至預先配制的種子培養基中,30 ℃搖床培養16 h,搖床轉速150 r/min。

桑葚發酵工藝:將桑葚干打粉后,按照120 KNU/kg添加焦亞硫酸鈉,取桑葚粉100 g按照1∶4(桑葚粉∶水)混合,測定總糖,按照一定比例加無水葡萄糖,使初始糖濃度為300 g/L,初始發酵醪重量500 g,裝入1000 mL具塞三角瓶。接入預先活化的菌種,靜止發酵,溫度為28 ℃,接種量為2%(v/w),每日取樣。

1.2.2 發酵過程中還原糖、乙醇測定 待測樣品分離:在2 mL EP管取少量發酵醪液在2400×g冷凍離心機(4 ℃)中離心1 min,再以孔徑為0.45 μm的微孔濾膜過濾發酵液,-20 ℃保存備用。

還原糖測定以無水葡萄糖為對照,采用略作改進的3,5-二硝基水楊酸(DNS)比色法[10]。具體為:吸取0.25～1.5 mL 0.2%標準葡萄糖溶液,置于25 mL容量瓶中,再加入3,5-二硝基水楊酸溶液3 mL,用蒸餾水補足至總體積5 mL沸水浴中顯色5 min,然后以流動水迅速冷卻,蒸餾水定容至刻度,搖勻。以蒸餾水2 mL與3,5-二硝基水楊酸溶液3 mL試劑同樣操作為空白調零,在波長540 nm處比色,得到吸光度值,參照葡萄糖標準曲線,求出還原糖的量。

乙醇測定采用氣相色譜法[11],以正丙醇為內標,氫火焰離子化檢測器,Agilent DB-WAX型柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)。具體為:進樣口溫度220 ℃,檢測器220 ℃,柱流速1.6 mL/min;載氣為40 mL/min氫氣,空氣流速400 mL/min;采用分流進樣,分流比30∶1,進樣量1 μL;程序升溫條件:初始溫度50 ℃,保持2 min,以10 ℃/min升至100 ℃,再以20 ℃/min升至160 ℃,保持1 min;單個樣檢測時間為10 min。

1.2.3 總多酚、總黃酮、總花青素測定 總多酚以沒食子酸為標準品,依據文獻采用福林-酚法略作修改測定[12]。總類黃酮以蘆丁為標準品,將一定濃度的標準品和樣品加入一定量質量分數為5%的NaNO2、10%的Al(NO3)3和4% NaOH溶液反應,在510 nm處用酶標儀測定吸光度,利用標準曲線測定總黃酮含量[13]。總花青素含量以矢車菊素-3-葡萄糖苷為標準品,采用pH示差法測定[14]。將經稀釋的樣品1 mL,分別用pH1.0的氯化鉀和pH4.5的乙酸鈉定容至10 mL,暗處反應30 min后在510 nm和700 nm處測定其吸光值,總花青素含量=(A/εL)×MW×DF×V/Wt,其中A=(A510 nmpH1.0-A700 nmpH1.0)-(A510 nmpH4.5-A700 nmpH4.5);MW為矢車菊素-3-葡萄糖苷的分子量449.2;ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數,取26900;DF為稀釋倍數;L為光程;V為樣品體積;Wt為樣品質量。

1.2.4 抗氧化活性能力測定 為準確考察桑葚酒的抗氧化能力,本研究采用了ABTS、FRAP和DPPH這3種生物氧化劑,分別測試了桑葚果酒在發酵過程中抗氧化活性能力的變化。ABTS測定,采用試劑盒法(方法見http://www.senbeijia.com/njsbjsw-Products-4874682/。購自南京森貝伽生物科技有限公司,貨號SBJ-0186)。DPPH法根據文獻方法略作改進測定[15],具體為:取1 mL用甲醇稀釋至一定濃度的樣品,加入2 mL的DPPH溶液(0.5 mol/mL),搖勻至暗處反應20 min后,于波長517 nm處測定吸光值,以清水作為對照,DPPH自由基清除率(%)=(Acontrol-Asample)/Acontrol× 100。FRAP法采用試劑盒方法(購自碧云天生物科技公司,產品標號S0116,方法見http://www.beyotime.com/reactive-oxygen/s0116. html)。

1.2.5 感官評價 感官評定通過30名不同年齡階段的食品專業人員采用果酒產品常用的盲評打分法進行,評分標準參照《葡萄酒、果酒通用實驗方法》GB/T15038-2006進行,統計平均評價作為有效數據。

1.3 計算

發酵效率(%)=實際發酵乙醇濃度/理論乙醇發酵濃度(初始糖濃度×0.511)×100

糖利用率(%)=(初始糖濃度-最終殘糖濃度)/初始糖濃度×100

2 結果與分析

2.1 桑葚果酒發酵情況分析

圖1為桑葚酒發酵過程中還原糖消耗和酒精生成的情況,從中可以看出,桑葚果酒的發酵狀況較好,發酵10 d后殘還原糖為20.13 g/kg,酒精濃度為90.42 g/kg。發酵液中的還原糖消耗速度存在先升高后降低的情況,發酵第4 d的還原糖濃度從194.62 g/L快速下降至98.07 g/kg,究其原因,可能是由于酵母增殖和代謝速度在靜止條件下較慢,到第3 d之后達到高峰。桑葚酒發酵完成時,其糖利用率為93.29%,發酵效率為65.53%,這與徐輝艷[16],郭衛蕓[17]等人的發酵結果較為相似。耿紅玲[18]等人的研究表明,全渣發酵比清液發酵其干浸出物高20%以上,而桑葚中的主要活性成分均大量分布在浸出物中,本研究采用全渣發酵有利于后續生物活性成分的研究。

圖1 桑葚發酵過程中乙醇生產和糖消耗隨時間變化曲線圖Fig.1 Ethanol production and sugar consumption during fermentation

2.2 發酵過程中總酚、類黃酮、總花青素含量變化情況

如圖2所示,本研究考察了桑葚酒發酵10 d過程中總酚、類黃酮和花青素的變化情況。從圖2可以看出,桑葚酒釀造過程前5 d,總酚出現先上升后下降,最后5 d再上升的情況,發酵液總酚在第2 d出現最高值(2145 mg/kg),相比初始發酵液(1442 mg/kg,0 d)和最終發酵液(1898.6 mg/kg,10 d)高了48.75%和12.97%。值得注意的是:總酚含量最高的第3 d,發酵液中還原糖含量也較高,這可能是由于糖的高濃度促進了酚類在發酵液中的溶解;而之后的3～5 d,總酚出現快速下降,其原因可能是由于酵母發酵過程總產生的有機酸與酚類反應,生產酚酸類化合物,導致酚類物質快速減少;但是,這些酚酸在不斷的聚合、氧化反應過程中,酚類物質會發生復雜的變化。在桑葚酒發酵后期,酚酸可與花色素及酒石酸結合,同時微生物代謝會生成對羥基類肉桂酸,并生成酚類,這也可能導致發酵后5 d桑葚發酵液中總酚含量的上升。

如圖2所示,花青素含量出現先升高后降低的過程,最高值出現在發酵2 d時,達到623 mg/kg,這可能是由于原料結果前期干燥,花青素物質在發酵液中逐漸溶出導致。而發酵后期的緩慢下降,可能是由于花青素較敏感性,容易受到光照、pH、糖、乙醇等相關因素的影響,這也與張紅娜等人的研究結果相似[19]。桑葚酒發酵過程中,類黃酮成分在發酵4 d時達到最低值22.71 mg/kg,相比最高值71.1 mg/kg(初始發酵液,發酵0 d)低了68%,而發酵后期含量趨于穩定后,含量為44.7 mg/kg(發酵10 d),也低了45%。究其原因,可能是由于,隨著發酵前期總酚含量的快速上升,多酚氧化酶和氧氣促進了花青素的轉化,使其含量下降[20]。

圖2 桑葚酒發酵過程中總酚、類黃酮、花青素含量隨時間變化曲線Fig.2 Flavonoids,anthocyanins and total phenol content change of mulberry wine during fermentation

本研究追蹤了桑葚酒前發酵期間主要生物活性物質的變化情況,這些物質均與桑葚酒的保健作用密切相關,同時對桑葚酒的品質也有重要影響。尤其是發酵過程中酚類物質會發生一系列復雜變化,引起桑葚酒色澤、口感等品質變化,因此研究發酵過程中活性成分的變化為釀造優質桑葚果酒提供了基礎數據,為指導建立高保健功能桑葚酒生產工藝提供了理論基礎。

2.3 基于ABTS、FRAP和DPPH法分析桑葚酒發酵過程中抗氧化活性能力變化情況

抗氧化活性主要表現在抑制脂質氧化降解、清除自由基、抑制促氧化劑(如螯合過渡金屬)、還原性或者促進機體產生內源性抗氧化物質(如SOD、CAT、GSH等),相關的測定方法有很多[21]。桑葚發酵酒由于原料成分復雜,微生物水解等因素都會影響其抗氧化活性,因此利用多種方法同時評價其抗氧化活性能力變化情況非常有必要。

從圖3可以看出,桑葚酒在發酵前5 d,DPPH自由基清除能力從39.61%下降至11.04%,在隨后的5 d又逐步上升至14.5%左右,這與圖2中前4 d花青素類物質快速下降的總趨勢較為一致。有報道表明[22]桑葚細胞壁在微生物酶的作用下解聚并釋放出蛋白質、糖苷等植物胞內成分,一定程度上會影響其DPPH自由基清除能力。同時,發酵液pH、溫度、水分活度、乙醇濃度等均可能影響DPPH自由基的清除能力。從而導致本研究中DPPH自由基清除能力呈現大幅下降的趨勢,而與林巧[9]等人的研究結果不相符。

ABTS法與DPPH法相似,均是基于分光光度測定反應體系的顏色改變來確定待測液的抗氧化活性。有報道表明[23],ABTS法和DPPH法測定柑橘、檸檬、白柚和橘子果汁的抗氧化能力結果基本一致。但是,從圖3中可以看出,ABTS與DPPH法測定的抗氧化能力存在明顯差異,ABTS法出現先下降后上升的過程,最低值出現在第5 d,僅41.24%,最高值出現在第8 d,達60.03%。ABTS法本質是一種間接方法,是反映桑葚發酵液清除ABTS+自由基的能力,與真實的氧化分解過程沒有關系,ABTS+的氧化還原電勢為0.68 V,也就是說只要某化合物的氧化還原電勢低于0.68 V就能將ABTS+還原,出現顏色變化,進而出現ABTS自由基清除能力[24]。桑葚發酵液是一個復雜體系,其中有大量物質的氧化還原電勢均低于0.68 V,因此該方法可能不適合反映桑葚發酵液的抗氧化能力。

Thaipong[25]等人比較了ABTS、DPPH、FRAP和ORAC法測定番石榴提取物的抗氧化能力,發現FRAP法在重復性、快速性和簡潔性等多方面具有顯著的優勢,這也與我們的結果相似。從圖3可以看出,利用FRAP法測定桑葚發酵液的抗氧化活性出現先上升后下降的趨勢,從最高值的92.04 μmol Fe2+/L(第4 d)下降至41.71 μmol Fe2+/L(第10 d),下降了54.7%,這可能是由于桑葚中的抗氧化物質本身較敏感,容易收到發酵的影響,但這與酚類物質的變化情況較為一致。因此,利用DPPH和FRAP兩種方法表征桑葚發酵液的抗氧化能力變化情況可能更為適宜,而ABTS法可能不太適合。

圖3 發酵過程中基于DPPH、ABTS和FRAP法測定抗氧化活性變化圖Fig.3 Antioxidant activities(DPPH,FRAP,ABTS) change during fermentation

2.4 桑葚發酵酒的產品分析

依據葡萄酒、果酒通用分析方法(國標GB/T 15038-2006),將本研究發酵10 d并陳釀40 d的桑葚酒與市場購買的桑葚泡酒(果露酒)和鮮桑葚清液發酵酒進行感官分析比較,統計20人數據取平均值,結果見表1。表明:通過總計50 d的發酵過程,桑葚果酒在香氣、滋味和典型性上具有明顯優勢。在色澤方面,普遍比清液發酵制作的要深沉自然,具有明顯的深紫色,但是澄清度方面不及清液發酵和露酒;在香氣方面,比液態攪拌發酵的果香濃郁,無其他異香。滋味及典型性方面,該產品為典型的半甜型低度發酵酒。綜合評分來看:相比市售的對照品具有果香濃郁、色澤深厚、甜酸適口綿長厚重的優勢。

表1 發酵成品桑葚酒的分析結果

根據國標GB/T15038-2006的相關檢測要求,結合本研究情況,對總發酵50 d的桑葚果酒進行相關指標分析,發現殘還原糖為14.21 g/kg,乙醇濃度為101.7 g/kg,總酚含量2.124 g/kg,花青素含量579.4 mg/kg,類黃酮41.2 g/kg,DPPH自由基清除率為21.1%,FRAP抗氧化活性為40.9 μmol Fe2+/L,總浸出物為23.241 g/L,符合國家標準要求。

3 結論

本研究通過對自然干燥的桑葚全渣深層靜止發酵,發現前發酵10 d的類黃酮和花青素類物質受發酵的影響逐漸變少,而總酚類物質含量逐漸升高,發酵10 d后殘還原糖為20.13 g/kg,酒精濃度為93.71 g/kg;DPPH和FRAP法相較于ABTS法,更適合表征桑葚發酵液的抗氧化能力變化情況;通過40 d的后發酵陳釀發現,該桑葚酒相比市售的桑葚果露酒和桑葚清液發酵酒具有果香濃郁、色澤深厚、甜酸適口綿長厚重的優勢。桑葚酒最終殘還原糖為14.21 g/kg,乙醇濃度為101.7 g/kg,總酚含量2.124 g/kg,花青素含量579.4 mg/kg,類黃酮41.2 g/kg,DPPH自由基清除率為21.1%,FRAP抗氧化活性為40.9 μmol Fe2+/L,總浸出物為23.241 g/kg,符合國家相關標準,為進一步開發高生物活性桑葚精深加工產品提供了一條可行途徑。

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Influence of alcoholic solid-state fermentation process on bioactive constituents and antioxidant activity from mulberries(MorusnigraL.)

ZHAO Hong-yu1，CHEN Dun-hong1，DENG Liang2，LEI Ji1,LI Yu-feng1，ZHANG Liang1，*

(1.Key Lab of Food Biotechnology of Sichuan Province,College of Food & Bioengineering,Xihua University,Chengdu 610039,China;2.Suining Chuanliang Agricultural development Co.,Ltd. Suining 629000,China)

The aim of the present study was to evaluate the changes of contents of total phenol,flavonoids and anthocyanins from sun-dried mulberry(MorusnigraL.)and their antioxidant activities(DPPH,FRAP,ABTS)during fermentation process. The result showed that the total phenol was increased with the 10 days prefermentation period,while the contents of flavonoids and anthocyanins were gradually decreased. The antioxidant activity,showing a trend of a rise at first followed by a decline,was reduced by nearly 50% after the end of fermentation. The methods of DPPH and FRAP radical scavenging activities were more suitable for displaying the variation of antioxidative capacity of fermented mulberry wine than the method of ABTS radical scavenging activities. After the end of fermentation,14.21 g/kg of reducing sugar,101.6 g/kg concentration of ethanol,2.124 g/kg of total phenol,579.4 mg/kg of anthocyanins,41.2 g/kg of flavonoids,21.1% of DPPH radical scavenging rate,40.9 μmol Fe2+/L of FRAP antioxidant activity and 23.241 g/L of total extracts were obtained,which provided a feasible way to further develop high biological activity and deeply processed products of mulberries.

mulberries;antioxidant activity;wine

2015-03-23

趙紅宇(1992-)，男，在讀碩士研究生，研究方向：食品科學，E-mail:zhyshian104@163.com 。

*通訊作者:張良(1982-)，男，博士，副教授，研究方向：食品生物技術，E-mail:zhang-liang@foxmail.com。

四川省科技廳應用基礎項目(2013jy0091)；食品生物技術四川省高校重點實驗室建設項目資助(川教2006-313)；國家教育部春暉計劃項目；西華大重點科研基金項目(Z1120538)。

TS201.1

A

1002-0306(2015)23-0182-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.029