反油酸和反異油酸對人臍靜脈內皮細胞炎癥反應的影響

文曉東,劉本欣,鄧澤元,范亞葦,李 靜

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330057)

反油酸和反異油酸對人臍靜脈內皮細胞炎癥反應的影響

文曉東,劉本欣,鄧澤元,范亞葦,李 靜*

(南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌 330057)

比較反油酸(9t18∶1)和反異油酸(11t18∶1)對內皮細胞炎癥反應的影響。用不同濃度的反油酸(9t18∶1)和反異油酸(11t18∶1)作用人臍靜脈內皮細胞(HUVEC),觀察其對細胞存活率、細胞形態學、氧化酶活(SOD、MDA)、LDH滲出率、一氧化氮量和NOS活力的影響。結果表明9t18∶1和11t18∶1均能降低細胞存活率,在100 μmol/L時,9t18∶1對內皮細胞存活率的抑制作用顯著強于11t18∶1;兩種反式脂肪酸均導致內皮細胞形態發生變化,細胞由正常的梭形變為圓形,而且邊緣呈粗糙狀態;9t18∶1和11t18∶1均能夠造成內皮細胞LDH滲出率和胞內MDA含量的顯著升高,但11t18∶1組明顯低于同濃度9t18∶1組;兩種反式脂肪酸均能夠降低HUVEC 細胞NO分泌量和NOS、SOD活力,且11t18∶1的降低作用低于同濃度9t18∶1組。此外,9t18∶1和11t18∶1均可提高ICAM、VCAM、IL-6 mRNA表達量,且前者顯著高于后者。總的來說,這兩種反式脂肪酸對內皮細胞都有一定致炎癥作用,但9t18∶1強于11t18∶1。

反油酸,反異油酸,內皮細胞損傷

血管疾病在中國成為導致死亡的首要誘因,研究表明通過膳食調節特別是膳食脂肪調節可以降低血管疾病的發病率。流行病學和臨床研究發現,反式脂肪酸(Trans fatty acids,TFAs)的攝入與血管疾病的發病率呈正相關性,TFA能改變人體的血脂組成、干擾人體正常的脂質代謝,并且TFA能夠刺激系統炎癥反應從而誘導內皮細胞的損傷和凋亡[1],TFA能增加內皮功能障礙過程中的循環生物標記物[2],同時降低動脈擴張依賴物一氧化氮的分泌[3],進一步促進心血管疾病的發生。

反式脂肪酸是一類含有一個或多個非共軛反式雙鍵的脂肪酸,主要分為工業反式脂肪酸(Industrial trans fatty acids,I-TFA,主要的反式異構體是9t18∶1)和反芻動物反式脂肪酸(Ruminant trans fatty acids,R-TFA,主要的反式異構體是11t18∶1)[4]。流行病學和臨床研究表明R-TFA和I-TFA對健康的影響存在差異,R-TFA與血管疾病呈正相關或者無相關性,而I-TFA則與血管疾病呈負相關[5-7]。但是它們對血管內皮細胞功能影響的差異研究甚少。因此,本課題擬通過血管內皮細胞功能研究了解R-TFA(11t18∶1)和I-TFA(9t18∶1)對血管內皮細胞炎癥反應的差異,通過檢測內皮細胞存活率,形態變化,乳酸脫氫酶(LDH)溶出率,一氧化氮合酶(NOS)活力,一氧化氮(NO)分泌量、超氧化物歧化酶(SOD)酶活,丙二醛(MDA)含量,細胞炎癥因子ICAM-1、VCAM-1、IL-6的變化,探討兩種TFA對內皮細胞功能影響的差異,完善對TFA安全性的認識,對調整我國居民膳食結構,提高健康水平具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

人臍靜脈內皮細胞株 南昌大學高等研究院;反油酸、反異油酸標品 美國Sigma公司;新生牛血清 杭州四季青生物工程材料有限公司;DMEM完全培養基 美國Gbico 公司;谷氨酰胺、青霉素鏈霉素混合液、胰蛋白酶、噻唑蘭(MTT) 北京Solarbio公司;磷酸緩沖鹽(PBS)粉劑(pH7.2～7.4) 北京中杉金橋生物技術有限公司;鬼筆環肽-FITC染液、DAPI染液、免疫染色洗滌液、免疫染色通透液、抗熒光猝滅封片液、免疫染色固定液 碧云天生物技術研究所;一氧化氮(NO)測定試劑盒、一氧化氮合酶(NOS)測定試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)測定試劑盒、丙二醛(MDA)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所;熒光定量PCR試劑盒 Takara公司;RNAiso Takara公司。

CPST 200型CO2恒濕恒溫培養箱 長沙長錦科技有限公司;BHC-1300IIA/B3型生物安全柜 蘇州安泰空氣技術有限公司;37XC(XDS-1A)倒置顯微鏡 上海蔡康光學儀器公司;BD-86L低溫冰箱 香港力康公司;Neofuge 15R臺式高速冷凍離心機 力康發展有限公司;Multiskan MK3型酶標儀 賽默飛世爾(上海儀器有限公司;激光共聚焦顯微鏡 卡爾蔡司公司;DSX-280 B不銹鋼手提式滅菌器 上海申安醫療器械廠;JY-86-2-50L-80 ℃冰箱 香港力康公司;溫度梯度PCR儀 芬蘭Thermo公司;7900HT實時熒光定量PCR儀 美國ABI公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 HUVEC的培養 細胞鋪滿后,棄去原來培養液,用PBS緩沖液5 mL分兩次洗滌細胞,加入1 mL胰蛋白酶(含EDTA)消化液于培養箱中消化1 min,取出后加入5 mL10% FBS培養液,用吸管將細胞輕輕吹下制成單細胞懸液,分裝于新的培養瓶中,置于5% CO2,37 ℃恒溫恒濕培養箱中培養。隔天換液,隔2 d傳一代。

1.2.2 MTT法測定9t18∶1和11t18∶1對內皮細胞活力的影響 兩種反式脂肪酸分別用0.5 mL 0.1 mol/L的氫氧化鈉在60 ℃水浴促溶,用PBS緩沖液稀釋至1000 μmol/L,過膜-20 ℃保存。取生長至對數生長期的細胞,胰蛋白酶消化后以 1×105/mL 接種于 96 孔細胞培養板,置于培養箱培養。培養24 h待細胞完全貼壁后吸去培養液,每組加含5%血清的 DMEM培養液 180 μL和各濃度9t18∶1和11t18∶1 20 μL,9t18∶1和11t18∶1最終濃度分別為 5、25、50、100 μmol/L;設置陰性對照組和PBS溶劑對照組每組5個復孔。繼續培養24 h后吸棄培養液,每孔用150 μL PBS清洗換180 μL新培養液并加 20 μL MTT。37 ℃避光孵育4 h,小心吸棄上清液,每孔加 150 μL 二甲基亞砜(DMSO),微量振蕩器上振蕩10 min使藍紫色結晶充分溶解,用酶標儀490 nm測定OD值。計算TFA對細胞活力的影響。

細胞存活率(%)=(OD實驗組-OD對照組)/OD對照組×100

1.2.3 鬼筆環肽-FITC和DAPI雙染觀察9t18∶1和11t18∶1作用細胞形態學的變化 經100 μmol/L9t18∶1和11t18∶1作用24 h后,內皮細胞消化稀釋成1×105/mL單細胞懸液,取200 μL平鋪至蓋玻片上,置于六孔板中于培養箱中培養6 h,至細胞完全貼壁伸展。鬼筆環肽-FITC染液按1∶200比例稀釋后4 ℃避光保存。用PBS洗一次六孔板中細胞,4%多聚甲醛室溫固定細胞10 min,PBS洗細胞30 s,再用細胞通透液室溫作用5 min。PBS洗一次細胞,每孔加200 μL鬼筆環肽-FITC,室溫避光作用30 min。PBS洗細胞3次,每孔加200 μL DAPI染色1 min。PBS沖洗蓋玻片2次,室溫避光晾干,反扣至滴有一滴抗熒光猝滅封片液的載玻片上,指甲油固封四角。置于4 ℃,避光,激光共聚焦顯微鏡觀察結果。

1.2.4 細胞NO分泌量和NOS活力的測定 取對數生長期細胞,消化吹散制成單細胞懸液,稀釋至細胞濃度為1×105/mL,接種于6孔板,每孔2 mL,每個濃度設3個復孔。將6孔板置于37℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱中培養24 h,待細胞完全貼壁后,分別加入反油酸和反異油酸(終濃度分別為25、50、100 μmol/L)并作用24 h,取上層培養液采用比色法測定NO 分泌量,具體操作參考試劑盒說明書。PBS清洗2次,用細胞刮刮下細胞,離心收集細胞,每孔加入細胞裂解液300 μL裂解30 min,離心取上清,采用比色法測定總的NOS活性。具體操作參考試劑盒說明書。

1.2.5 細胞LDH滲出率的測定 取對數生長期細胞,消化吹散制成單細胞懸液,稀釋至細胞濃度為1×105/mL,接種于6 孔板,每孔2 mL,每個濃度設3個復孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱中培養24 h,待細胞完全貼壁后,分別加入反油酸和反異油酸,使其終濃度為25、50、100 μmol/L并繼續培養24 h后,取上清液測定細胞外LDH含量。每孔PBS清洗2次,用細胞刮刮下細胞,離心收集細胞,每孔加入細胞裂解液300 μL裂解30 min,離心取上清,采用比色法測定細胞內LDH含量,具體操作步驟參考試劑盒說明書。

LDH滲出率(%)=細胞外LDH含量/(細胞內LDH含量+細胞外LDH含量)×100

1.2.6 細胞SOD酶、MDA含量的測定 取對數生長期細胞,消化吹散制成單細胞懸液,稀釋至細胞濃度為1×105/mL,接種于6 孔板,每孔2 mL,每個濃度設3個復孔。將6孔板置于37 ℃、5% CO2恒溫恒濕培養箱中培養24 h,待細胞完全貼壁后,分別加入反油酸和反異油酸,使其終濃度為25、50、100 μmol/L作用24 h,移除培養液,每孔用PBS 清洗 2 次,用細胞刮刮下細胞,離心收集細胞,每孔加入細胞裂解液300 μL 4 ℃裂解30 min,離心取上清,按照試劑盒說明測定SOD活力和MDA含量。

表1 反轉錄cDNA反應體系

表2 引物序列

表3 熒光定量PCR反應體系

1.2.7 細胞炎癥因子的測定 總RNA的提取:細胞接種于直徑為5 cm平皿,待貼壁后分別加入反油酸和反異油酸(終濃度為25、50、100 μmol/L)并作用24 h。處理結束后,用冷的PBS清一次,加入1 mL RNAiso裂解細胞5 min,吹打后移入1.5 mL離心管(DEPC水處理)中,再加入200 μL氯仿,劇烈震蕩15 s,室溫放置5 min;12000 r/min 4 ℃離心15 min,此時管內液體分三層,上層為RNA溶液,中層為DNA白色絮狀沉淀,下層為蛋白質溶液,輕輕吸取上清轉移到新的離心管中。加入500 μL異丙醇混勻,靜止30 min,12000 r/min 4 ℃離心10 min,出現白色RNA沉淀。吸取上清液,加入1 mL 75%乙醇(DEPC水配置),8000 r/min離心5 min,除去上清液,超凈臺內室溫晾干,加入50 μL DEPC水溶解后放入-80 ℃冰箱保存。紫外分光光度法檢測RNA純度,樣品在260 nm和280 nm出吸光度比值要求在1.8～2.0之間。

1.2.8 數據統計 所有實驗數據用SPSS13.0統計軟件進行單因素方差分析,p<0.05 表示有顯著性差異。

鉤藤根腐病可用3億CFU/克哈茨木霉菌20～50倍，或10億個/克枯草芽孢桿菌800～1 000倍，或1%申嗪霉素懸浮劑800～1 000倍，或8%井岡霉素A水劑100～125倍灌根或噴淋。

2 結果與討論

2.1 9t18∶1和11t18∶1對內皮細胞存活力影響對比

如圖1所示,與培養液對照組和溶劑對照組(PBS)相比,11t18∶1組和9t18∶1組對內皮細胞活力的抑制作用隨濃度的升高而增強。其中5 μmol/L和25 μmol/L的兩種TFA對細胞活力的影響相對較小且兩種TFA之間沒有顯著性差異(p<0.05)。兩種TFA在50～100 μmol/L劑量范圍內對HUVEC增殖具有明顯的抑制作用。100 μmol/L 9t18∶1在100 μmol/L的對HUVEC細胞存活率的抑制作用顯著強于100 μmol/L 11t18∶1(p<0.05)。

圖1 9t18∶1和11t18∶1對HUVEC細胞存活率的影響Fig.1 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on survival rates of HUVEC cells注：標注不同字母表示有顯著性差異(p<0.05)，圖3～圖6同。

2.2 9t18∶1和11t18∶1對內皮細胞形態影響對比

從上述MTT實驗中得出,100 μmol/L的9t18∶1和11t18∶1作用內皮細胞時,內皮細胞存活率有明顯的下降,且兩者之間具有顯著性差異,因此選用100 μmol/L濃度來觀察兩種反式脂肪酸對內皮細胞形態的影響。

圖2 9t18∶1和11t18∶1對細胞形態學的影響Fig.2 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on HUVEC morphology

如圖2所示,正常的內皮細胞呈梭狀,細胞形態規則,細胞核呈橢圓形且輪廓清晰。100 μmol/L 9t18∶1和11t18∶1作用24 h后細胞形態均有明顯的變化,細胞由正常的梭形變為圓形,而且邊緣呈粗糙狀態。細胞質分布散亂,細胞核破損嚴重。該結果提示兩種反式脂肪酸作用后內皮細胞嚴重變形,細胞功能損傷明顯。

如圖3所示,9t18∶1和11t18∶1作用細胞后,LDH有滲出現象且LDH滲出率與濃度呈正相關關系。9t18∶1在100 μmol/LLDH滲出率最高,相比于25、50 μmol/L具有顯著性差異。11t18∶1 100 μmol/L和25 μmol/L組間具有顯著性差異。相同濃度9t18∶1和11t18∶1組間均有顯著性差異,11t18∶1作用細胞后的LDH滲出率明顯低于同濃度9t18∶1。

圖3 9t18∶1和11t18∶1對HUVEC LDH滲出率的影響Fig.3 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on LDH leakage

2.4 9t18∶1和11t18∶1對內皮細胞NOS活力、NO分泌量的影響

由圖4 可知,隨著反式脂肪酸濃度的升高,細胞NOS活力降低且與濃度呈正相關關系。11t18∶1各濃度組間沒有明顯差異,而9t18∶1在100 μmol/L比25 μmol/L的NOS活力低,且有顯著性差異。9t18∶1組NOS酶活性較11t18∶1組低。可見9t18∶1對NOS抑制作用較11t18∶1強。與對照組相比,9t18∶1和11t18∶1作用后內皮細胞NO分泌量均明顯下降(p<0.05)。隨著兩種反式脂肪酸濃度的升高,內皮細胞NO分泌量下降。相同濃度的9t18∶1組NO分泌量比11t18∶1組低。

圖4 9t18∶1和11t18∶1對內皮細胞NOS活力和NO分泌量的影響Fig.4 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on NOS activity and NO secretion

2.5 9t18∶1和11t18∶1對內皮細胞SOD酶活、MDA含量的影響

超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)都是評價細胞內氧化水平的重要指標。由圖5可知9t18∶1和11t18∶1作用后,細胞SOD活力有顯著下降的趨勢,在50、100 μmol/L時9t18∶1組SOD明顯低于11t18∶1組且有顯著性差異。9t18∶1對內皮細胞損傷強于11t18∶1。9t18∶1和11t18∶1作用后,細胞MDA含量均有上升,但9t18∶1組比11t18∶1組上升更為明顯(50、100 μmol/L)。可見9t18∶1和11t18∶1均會造成細胞內氧化應激水平失衡,且9t18∶1比11t18∶1更為明顯。

圖5 9t18∶1和11t18∶1對內皮細胞SOD酶活和MDA含量的影響Fig.5 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on SOD activity and MDA contents

2.6 9t18∶1和11t18∶1對ICAM-1、VCAM-1、IL-6(白細胞介素6)mRNA表達量的影響

ICAM-1、VCAM-1和IL-6都是評價細胞內炎癥反應的重要指標,其mRNA表達量的變化反映了細胞內炎癥反應的激烈程度。由圖6可以看出,9t18∶1和11t18∶1作用內皮細胞后細胞內ICAM-1 VCAM-1 IL-6mRNA表達量都有明顯提高,特別是100 μmol/L時。同濃度組間對比9t18∶1高于11t18∶1,且在50、100 μmol/L時有顯著性差異。

圖6 9t18∶1和11t18∶1對HUVEC內皮細胞ICAM-1、VCAM-1、IL-6mRNA表達量的影響Fig.6 Effects of 9t18∶1 and 11t18∶1 on the mRNA expression levels of ICAM 1,VCAM 1,IL-6 mRNA in HUVEC cells

3 結論與討論

一氧化氮(nitric oxide,NO)是一類調節生物體循環系統功能的非常重要的氣體信號分子,在正常生理狀態下,內皮型一氧化氮合酶(eNOS)可產生低濃度的NO,發揮內皮細胞源性舒張因子作用而舒張血管。NO分泌量的變化是檢測內皮細胞是否受損的一個重要指標。NO不僅能調節血管張力,還被認為是一種抗炎分子[8],其抗炎作用主要是通過抑制核轉錄因子kappa B(NF-κB)活性,從而抑制動脈粥樣硬化的形成。Kitamot 等[9]運用基因轉染技術以大鼠為載體證實在內皮細胞處NO可通過NF-κB 途徑抑制單核細胞趨化蛋白(MCP-1)的表達,從而減少單核細胞的遷移,發揮抗炎、抗動脈粥樣硬化作用。目前公認的NOS被分為兩個亞型,一種是結構型NOS(cNOS),包括eNOS和nNOS,另一種是誘導型NOS(iNOS)[10]。有研究表明隨著eNOS水平的降低,會導致NO的分泌量相應減少,最終造成動脈血管的舒張功能受損和炎癥的發生。邱斌[10]等報道不同飽和度反式脂肪酸可抑制eNOS活性減少NO的分泌。可見,TFA引發內皮細胞損傷可能是通過NOS-NO系統誘導。9t18∶1和11t18∶1作用后細胞內NOs活力呈現出下降,導致NO分泌量也相應的減少。而9t18∶1抑制NOS強度高于11t18∶1,NO分泌量也低于11t18∶1,所以9t18∶1對NOS-NO系統的影響要強于11t18∶1。

LDH存在于人體所有細胞中,是人體能量代謝中十分重要的酶。LDH的變化會直接或間接影響機體的能量代謝,當機體各組織器官發生病變時,其組織器官本身的LDH含量 要發生改變從而引起血液中LDH的改變。LDH滲出率是細胞氧化應激的指示因子之一,細胞LDH 滲出率提高表明細胞功能受損或者死亡,細胞膜的結構發生了脂質過氧化,導致細胞膜轉運功能改變[11]。本實驗發現9t18∶1和11t18∶1誘導細胞LDH 滲出率增加,且9t18∶1比11t18∶1作用更強。所以9t18∶1引起的LDH滲出導致內皮細胞功能障礙比11t18∶1要強。

SOD和MDA都是評估體內氧化程度的重要指標。SOD是一種蛋白酶,在體內能夠清除氧自由基,保護生物體免受氧自由基的攻擊,其活力的高低反應了機體內清除氧自由基的能力強弱。MDA作為生物膜中不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的產物,通過MDA 含量可以反映細胞內氧自由基水平和脂質過氧化反應的強弱。9t18∶1和11t18∶1作用后,SOD酶活明顯下降,而MDA含量上升,說明細胞內氧化還原平衡遭到破壞,氧化應激水平上升。而總體看來9t18∶1作用后SOD下降及MDA上升的量都要高于11t18∶1,可見9t18∶1對內皮細胞造成的氧化損傷明顯高于11t18∶1。

炎癥反應被認為是動脈粥樣硬化的起始階段。當系統炎癥出現時,內皮細胞介導炎癥細胞向感染部位和損傷的組織聚集,同時并釋放相關細胞因子和生長因子,再與白細胞進行信號交流。TFA作為一種外源性刺激物可引起體內一系列炎性反應。9t18∶1和11t18∶1刺激產生的細胞間粘附因子(ICAM-1)、血管細胞粘附分子(VCAM-1)、白細胞介素(IL-6)等細胞炎癥因子不僅會影響內皮細胞和炎癥細胞之間的相互作用,還會影響內皮細胞的活力,誘導產生炎性表型的內皮細胞[12]。

上述實驗結果總體顯示出相同濃度的11t18∶1對人臍靜脈內皮細胞造成的損傷明顯低于9t18∶1。有研究指出11t18∶1在人類和反芻動物體內經過乙酰輔酶A脫飽和酶1催化可生成9c11t-CLA,9c11t-CLA有一定的抗炎作用[13-15],它能顯著降低ICAM、VCAM、TNF-а、IL-1、IL-6的mRNA表達水平,抑制NF-кB通路的激活[16-18]。是否由于9c11tCLA的抗炎作用減少了11t18∶1對內皮細胞的損傷呢？這有待進一步研究。

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Exploration of elaidic acid and trans-vaccenic acid on inflammation of human umbilical vein endothelial cells

WEN Xiao-dong,LIU Ben-xin,DENG Ze-yuan,FAN Ya-wei,LI Jing*

(Key Laboratory of Food Science of Ministry of Education,Nanchang University,Nanchang 330047,China)

The aim of the present study was to compare the effects of the elaidic acid(9t18∶1)and the trans-Vaccenic acid(11t18∶1)on endothelial cells injury. After adding different concentrations of 9t18∶1 11t18∶1,the cell viability,cell morphology,oxidase activity(SOD and MDA),LDH leakage rates,effects of NO content and NOs activity were obserred. The results showed that 9t18∶1 and 11t18∶1 reduced the cell survival rate,and the inhibitory effect of 9t18∶1 on proliferation of endothelial cells were stronger than 11t18∶1 in 100 μ mol/L.Both of trans fatty acids lead to changes in endothelial cell morphology,cells from normal spindle to round and edge became rough. 9t18∶1 and 11t18∶1 increased LDH leakage rate and MDA in endothelial cell,but the 11t18∶1-treated group was reduced than 9t18∶1 in the same concentration. NO secretion,NOS and SOD activity was reduced by 9t18∶1 and 11t18∶1,but 11t18∶1 group was significantly higher in the same concentration of 9t18∶1. Both of 9t18∶1 and 11t18∶1 could increase the mRNA expression levels of ICAM,VCAM,and IL-6,the former was obviously higher than the latter. In summary,the HUVEC cells injury induced by 11t18∶1 was significantly weaker than that of 9t18∶1.

elaidic acid;trans-vaccenic acid;Endothelial cells injury

2014-12-24

文曉東(1989-),男,碩士研究生,研究方向:食品科學,E-mail:goodwenxiaodong@163.com。

*通訊作者:李靜(1982-),女,博士,副教授,研究方向:營養學,E-mail:lijing66@ncu.edu.cn。

教育部新教師基金(20113601120004);江西省科技廳自然基金(20114BAB214016);國家自然基金(31401485)。

TS201.4

A

1002-0306(2015)23-0352-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.065