蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutellasinensis)菌絲體發酵液免疫活性的研究

趙 萍,劉 冰，2,竹 軍,王 聰，丁毛毛

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050；2.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

蝙蝠蛾被毛孢(Hirsutellasinensis)菌絲體發酵液免疫活性的研究

趙 萍1,劉 冰1，2,竹 軍1,王 聰1，丁毛毛1

(1.蘭州理工大學生命科學與工程學院,甘肅蘭州 730050；2.合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽合肥 230009)

對蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發酵液(HSFL)制劑進行體內和體外免疫活性研究。結果表明:該制劑在體外對ConA誘導的小鼠脾淋巴細胞的轉化能力顯著增加,并且在體外顯著提高了小鼠脾臟中NK細胞的活性;在體內實驗中,該制劑可以顯著改善DNFB誘發的小鼠遲發型變態反應;顯著提高小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的能力。蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發酵液制劑具有調節免疫的生物活性。

菌絲體,發酵液制劑,免疫活性

冬蟲夏草Cordyceps sinensis(Berkeley)Saccardo.是我國傳統名貴中藥材,主要產于我國,分布在西藏、青海、四川、云南等地。冬蟲夏草是菌蟲復合體,即蝙蝠蛾幼蟲軀體上的一種子囊真菌[1]。冬蟲夏草主要功效成分為蟲草酸(D-甘露醇)、蟲草素(3-脫氧腺苷)及抗菌活性物質、麥角甾醇、多肽和氨基酸、多種維生素等[2]。

蟲草菌絲體液態深層發酵在蟲草菌絲體和發酵產物的獲得上大大緩解了蟲草自然資源的破壞[3]。嚴林[4]首次報道了冬蟲夏草的寄主之一——青海拉脊蝙蛾(Hepialus lagii Yan)幼蟲頭、胸、腹各部分的形態特征。目前,國家批準應用蝙蝠蛾擬青霉菌(Paecilomyces hepiali)和蝙蝠蛾被毛孢菌(Hirsutella sinensis)發酵產物作為人工發酵的蟲草菌絲體。蝙蝠蛾被毛孢蟲草菌絲體粉對大、小鼠急性毒性屬于無毒級[5]。冬蟲夏草及蟲草菌絲體對肝臟、腎臟、心臟、免疫系統、抗腫瘤、調節血糖水平的作用[6-12],還具有改善睡眠的作用[13]。

以青海地區蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發酵液(HSFL,fermented liquor of mycelium of Hirsutella sinensis)為研究對象,對其基本組成研究分析發現,其中蟲草多糖和蟲草素含量較高,也含有一些氨基酸和微量元素。蝙蝠蛾被毛孢菌絲體液態深層發酵在獲得蟲草菌絲體的同時,也得到了大量的菌絲體發酵液。鑒于HSFL含有的活性成分和高產量,HSFL可以作為保健食品的很好來源[14]。本實驗將蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發酵液配制成HSFL制劑,對該制劑進行免疫調節功能的研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發酵液 青海珠峰蟲草藥業有限公司;昆明種清潔級小鼠 160只,雌性,體質量為18～22 g,蘭州大學動物實驗中心(許可證號:SCXK(甘)2009-0004);YAC-1細胞株 西北民族大學醫學院;刀豆蛋白A(ConA) 美國Sigma公司產品;RPMI-1640培養基 Hyclone公司產品;四甲基偶氮唑鹽(MTT) 美國Sigma公司產品;胎牛血清 四季青公司產品;吉姆薩染液試劑盒 南京建成公司產品;2,4-二硝基氟苯(DNFB) 使用前稱取50 mg,溶解于5 mL的丙酮麻油溶液中(丙酮∶麻油=1∶1)待用;酶標儀 Elx808 Bio Tek;二氧化碳培養箱 CB210 Binder。

1.2 HSFL制劑的配制

蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發酵液60 ℃減壓濃縮,抽濾、靜置過夜去除沉淀,用苯酚-硫酸法測定的多糖含量,使濃縮液中多糖含量達到≥15 mg/mL,保證HSFL制劑具有增強免疫力的生物活性。濃縮去雜后的HSFL按比例加入甜味劑紐甜,得到HSFL制劑。

使用時,高劑量組取樣液30 mL加蒸餾水至50 mL,混勻;中劑量組取樣液30 mL加蒸餾水至100 mL,混勻;低劑量組取樣液30 mL加蒸餾水至150 mL,混勻。

1.3 HSFL制劑體外免疫活性實驗

1.3.1 ConA誘導的體外小鼠淋巴細胞轉化實驗 參考文獻[15-18],常規制備小鼠脾淋巴細胞懸液,活細胞數>95%,調整細胞濃度為3×106/mL。將脾細胞懸液加入24 孔培養板中1 mL/孔,再加入ConA液1 mL/孔,空白組加雙蒸水1 mL/孔,實驗組分別加入不同稀釋度HSFL制劑1 mL/孔。置于5% CO2、37 ℃孵箱中孵育68 h。之后離心,棄上清,加入MTT 50 μL/孔,繼續培養4 h。培養結束后,每孔加入1 mL酸性異丙醇,吹打均勻,分裝到96 孔培養板中,每個孔設置三個平行孔。用酶標儀在570 nm波長處測定光密度值。加ConA孔的光密度值減去不加ConA孔的光密度值,代表小鼠脾淋巴細胞的增殖能力。

1.3.2 小鼠體外NK細胞活性測定實驗 參考文獻[19-21],將YAC-1傳代培養,調整細胞濃度為4×105/mL。制備小鼠脾淋巴細胞懸液,完全培養液調整細胞濃度3×106/mL。96 孔培養板中加入YAC-1細胞和小鼠脾淋巴細胞懸液各100 μL,自然釋放孔加培養液100 μL,最大釋放孔加1% NP40 100 μL。實驗組加不同稀釋度HSFL制劑各100 μL,每組設置三個平行孔,于37 ℃、5%二氧化碳培養箱中培養4 h,之后離心,棄上清液,加入LDH基質液,反應10 min,每孔加入1 mol/L的HCl 30 μL,在酶標儀490 nm處測定光密度值。按下述方法計算NK細胞活性。

NK細胞活性(%)=(反應孔OD-自然釋放孔OD)/(最大釋放孔OD-自然釋放孔OD)×100

1.4 HSFL制劑體內免疫活性實驗

將實驗動物分為三大組,分別為免疫一組(體質量增重、臟器/體質量比值實驗)、免疫二組(二硝基氟苯誘導小鼠遲發型變態反應)、免疫三組(小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗),每大組隨機分配40 只實驗動物,按每千克體質量的實驗劑量分為4個小組,分別為:對照組(0 mg/kg),低劑量組(25 mg/kg),中劑量組(50 mg/kg),高劑量組(100 mg/kg),對照組用生理鹽水。按照以上分組和劑量,連續灌胃30 d。

1.4.1 體質量增重、臟器/體質量比值實驗 末次稱重后,頸椎脫臼處死小鼠并解剖,取出脾臟、肝臟和胸腺并稱量,計算臟器和體質量間的比值。

1.4.2 二硝基氟苯誘導小鼠遲發型變態反應(DTH) 每只小鼠腹部脫毛,用DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏。5 d后,用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(兩面)。24 h后頸椎脫臼處死小鼠,剪下左右耳殼,用打孔器取下直徑8 mm的耳片,稱重。小鼠左右兩耳質量之差表示DTH程度。

1.4.3 小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗 每只小鼠腹腔注射20%的雞紅細胞懸液1 mL,間隔30 min處死小鼠,腹腔注射2 mL生理鹽水,吸出腹腔洗液0.5 mL,滴于預先處理過的載玻片的瓊脂圈內,37 ℃孵育30 min后,迅速用生理鹽水沖洗,4%的吉姆薩溶液染色3 min,蒸餾水沖洗晾干。顯微鏡下計數,計算吞噬指數和吞噬百分率。

吞噬百分率(%)=吞噬雞紅細胞的巨噬細胞數/計數的巨噬細胞數×100

吞噬指數=被吞噬的雞紅細胞總數/計數的巨噬細胞數

1.5 統計學分析

采用SPSS17.0統計軟件對實驗數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 HSFL制劑在體外對免疫活性的影響

2.1.1 HSFL制劑對ConA誘導的體外小鼠淋巴細胞轉化實驗的影響 通過人為添加抗原(ConA),使之侵入機體,通過觀察淋巴細胞的轉化能力來判斷細胞免疫的強弱。高濃度的HSFL制劑對T淋巴細胞的免疫調節功能產生影響,而ConA刺激T細胞產生的增殖細胞中的線粒體水解酶活力也受到影響,從而使得光密度差值增大,顯示出調節免疫的作用。表1結果顯示,中劑量組和高劑量組與對照組比較有顯著性差異(p<0.05),低劑量組與對照組比較無顯著性差異(p>0.05)。根據《保健食品檢驗與評價技術規范(2003)》中“細胞免疫功能測定項目中的任一實驗的兩個劑量組結果陽性”,可判定HSFL制劑對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗結果為陽性。

表1 HSFL制劑對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化的影響

注:*表示與對照組比較p<0.05；光密度差值=OD加ConA孔-OD不加ConA孔。

2.1.2 HSFL制劑對小鼠體外NK細胞活性的影響 NK細胞是區別于T、B淋巴細胞的淋巴細胞群,主要存在于外周血、脾臟、骨髓及淋巴結中,因此可以通過測定機體脾臟中NK細胞的活性來反映機體的免疫功能。表2結果顯示,中劑量組和高劑量組與對照組比較有顯著性差異(p<0.05),低劑量組與對照組比較無顯著性差異(p>0.05),根據《保健食品檢驗與評價技術規范(2003)》中“NK細胞活性測定實驗的一個以上劑量組結果陽性”,可判定HSFL制劑對NK細胞活性實驗結果為陽性。

表2 HSFL制劑對NK細胞活性的影響

注:*表示與對照組比較p<0.05，表3～表5同。

2.2 HSFL制劑在體內對免疫活性的影響

2.2.1 HSFL制劑對小鼠肝臟、脾臟、胸腺指數的影響 胸腺和脾臟是機體重要的免疫器官,與細胞免疫、體液免疫相關,當機體接受外界免疫調節劑時,會使胸腺和脾臟的重量發生變化,因此測量其重量可作為判斷機體免疫功能的輔助指標。如表3所示,與空白對照組相比,中、高劑量組肝臟系數顯著增加(p<0.05);低劑量組無顯著性差異(p>0.05);低、中、高劑量組脾臟系數顯著增加(p<0.05);低、中、高劑量組胸腺系數無顯著差異(p>0.05)。而與低劑量組相比,中、高劑量組的HSFL制劑能提高小鼠肝臟系數、脾臟系數和胸腺系數。

表3 HSFL制劑對小鼠肝臟、脾臟、胸腺指數的影響

2.2.2 HSFL制劑對小鼠遲發型變態反應的影響 T淋巴細胞經特異性抗原活化后,合成并分泌細胞因子,其中,細胞因子IL-2、TNF-β等使得吞噬細胞活化,引起以單核-巨噬細胞為主的遲發型超敏反應;細胞因子IFN-γ介導機體的細胞免疫;效應T細胞與同一抗原再次結合后刺激B細胞增殖分化,從而介導機體的體液免疫。因此,測定T淋巴細胞活性可以用來判定機體免疫功能的強弱。表4結果顯示,低劑量、中劑量、高劑量的HSFL制劑對小鼠遲發型變態反應的影響差異顯著(p<0.05),根據《保健食品檢驗與評價技術規范(2003)》中“細胞免疫功能測定項目中的任一實驗的兩個劑量組結果陽性”,可判定HSFL制劑對DNFB誘發的小鼠遲發型變態反應實驗結果為陽性。

表4 HSFL制劑對遲發型變態反應的影響

2.2.3 HSFL制劑對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響 單核-巨噬細胞是參與機體非特異性免疫防御的重要細胞,具有吞噬及殺傷能力,它的功能強弱可以反映機體非特異性免疫功能的強弱。表5結果顯示低劑量HSFL制劑對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響差異不顯著(p>0.05),而中、高劑量對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響差異顯著(p<0.05),說明一定劑量的HSFL制劑能夠提高機體的抗異物能力,從而增強機體的非特異性免疫能力。根據《保健食品檢驗與評價技術規范(2003)》中“單核-巨噬細胞功能測定項目中的任一實驗的兩個劑量組結果陽性”,可判定HSFL制劑對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗結果為陽性。

表5 HSFL制劑對腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞的影響

3 結論

根據上述實驗,HSFL制劑在體外免疫活性實驗的結論為:HSFL制劑對ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗結果為陽性,對NK細胞活性實驗結果為陽性。HSFL制劑在體內免疫活性實驗的結論為:HSFL制劑對DNFB誘發的小鼠遲發型變態反應實驗結果為陽性,對小鼠腹腔巨噬細胞吞噬雞紅細胞實驗結果為陽性。

根據中華人民共和國衛生部《保健食品檢驗與評價技術規范(2003)》[22]對保健食品評價結果判定的標準“在細胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細胞功能、NK細胞活性四個方面任兩個方面結果陽性,可判定該受試樣品具有增強免疫力功能作用”,可判定:HSFL制劑在體外具有免疫力調節功能,HSFL制劑在體內具有免疫力調節功能。最終表明,蝙蝠蛾被毛孢菌絲體發酵液制劑具有調節免疫的生物活性。

[1]張永杰,孫炳達,張姝,等.分離自冬蟲夏草可培養真菌的多樣性研究[J].菌物學報.2010,29(4):518-527.

[2]李連德,李增智,樊美珍,等.蟲草多糖研究進展[J].安徽農業大學學報.2000,27(4):413-416.

[3] Y J Chen,M S Shiao,S S Lee,S.Y. Wang,Effect of Cordyceps sinensis on the proliferation and differentiation of human leukemic U937 cells[J]. Life Science. 1997,10(60):2349-2359.

[4]嚴林.青海拉脊蝠蛾幼蟲分類特征研究[J].青海大學學報(自然科學版),2001,19(1):5-9.

[5]查捷,項華,孫建榮.蝙蝠蛾被毛孢蟲草菌絲體粉急性毒性和致突變作用[J].浙江預防醫學,2008,20(6):92-93.

[6]趙祥軍,邱瑞桂,袁海龍,等.冬蟲夏草道地藥材與人工蟲草菌絲體的分析比較[J].中藥材,2003,26(6):408-409.

[7]張小強,浦躍樸,仲偉鑒.冬蟲夏草及蟲草菌絲體的藥理作用研究現狀[J].環境與職業醫學,2002，19(2):122-123.

[8]許建明,丁長海,李連德,等.冬蟲夏草多糖保護小鼠免疫性肝損傷的篩選研究[J].安徽醫科大學學報,1999,34(3):173-175.

[9]戴春筍,劉志紅,李恒，等.冬蟲夏草防治環孢素A腎毒性的體內與體外實驗研究[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2000,9(4):322-328.

[10]俞宙,何建新.冬蟲夏草水提取液對觸發性心律失常的治療作用[J].中國醫藥學報,1999,14(1):32-34.

[11]劉超,盧珊,姬美蓉,等.冬蟲夏草對白血病NK細胞影響的體外研究[J].中國中西醫結合雜志,1992,12(5):267-269.

[12]季暉,涂紅湖,李耐三.人工蟲草菌絲多糖的分離提取及其降血糖作用研究[J]. 中國藥科大學學報,1993,24(1):39-42.

[13]俞萍，徐德洲.蝙蝠蛾被毛孢菌絲體改善小鼠睡眠的作用[J].中國醫院藥學雜志,2006，26(9):1179-1180.

[14]趙萍,曹心張,張新國等.冬蟲夏草菌絲體發酵液中多糖的抗氧化活性研究[J].中醫藥學報，2014(05):27-29.

[15]周妍,王凌,孫利芹,等. 5種海洋微藻多糖體外免疫調節活性的篩選[J].海洋通報,2010(4):194-198.

[16]黃文凱,華欲飛,賀大偉,等.超濾處理對大豆肽體外免疫功能的影響[J].食品與生物技術學報,2010,26(5):31-34.

[17]馬偉偉,李麗,周革非,等.海黍子硫酸多糖體外免疫與抗腫瘤活性[J].食品科學,2013,34(7):70-74.

[18]齊春會,張永祥,喬善義,等.六味地黃多糖體外對正常及衰老小鼠脾細胞免疫功能的影響[J].中國藥理學通報,1999,15(2):157-160.

[19]王劍,蒲薔,何開澤,等.川牛膝多糖的體外免疫活性研究[J].應用與環境生物學報,2008,14(4):481-483.

[20]徐明生,林日新,湯群,等.卵轉鐵蛋白體外免疫活性研究[J].食品與機械,2012,28(2):115-118.

[21]董國霞,陳靠山,石 磊,等.柘樹根多糖的體外免疫增強作用[J].現代免疫學,2005,25(3):247-248.

[22]中華人民共和國衛生部.保健食品檢驗與評價技術規范[M].2003:22-34.

Evaluation of immune function of fermented liquor of mycelium ofHirsutellasinensis

ZHAO Ping1,LIU Bing1,2,ZHU Jun1,WANG Cong1,DING Mao-mao1

(1. School of Life Science and Engineering, Lanzhou University of Technology, Lanzhou 730050, China;2.Institute of Bbiological and Food Engineering of Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

The purpose of this paper was to prove immune biological activity of preparation prepared by the fermented liquor of mycelium ofHirsutellasinensis(HSFL)invitroandinvivo. The preparation of HSFL could significantly influence both proliferation of ConA-induced spleen lymphocytes and activity of natural killer cellinvitro. Delayed-type hypersensitivity(DTH)and phagocytosis function of mononuclear-macrophage in high-dose and intermediate-dose of preparation of HSFL were significantly enhancedinvivo. These data indicated that the preparation of HSFL had immunomodulatory activity.

mycelium ofHirsutellasinensis;the preparation of fermented liquor;immunomodulatory activity

2015-04-09

趙萍(1964-),女,碩士,教授,主要從事食品科學、農產品加工與副產物綜合利用方面的研究，E-mail:pingzhaogdqg@lut.cn。

甘肅省自然科學研究基金計劃(0803RJZA044)。

TS201.4

B

1002-0306(2015)23-0363-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.067