超聲波處理對豌豆分離蛋白功能特性的影響

王忠合,王 軍,李珍妮,孫遠明,柳春紅,賴長鴻

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510630;2.韓山師范學院生命科學與食品科技學院,廣東潮州 521041;3. 華南農業大學資源與環境學院,廣東廣州 510630)

超聲波處理對豌豆分離蛋白功能特性的影響

王忠合1,2,王 軍2,*,李珍妮2,孫遠明1,柳春紅1,賴長鴻3

(1.華南農業大學食品學院,廣東廣州 510630;2.韓山師范學院生命科學與食品科技學院,廣東潮州 521041;3. 華南農業大學資源與環境學院,廣東廣州 510630)

以豌豆分離蛋白為原料,采用不同強度的超聲波處理,研究超聲波處理對豌豆分離蛋白溶解性、起泡性、乳化性、持水性、吸油性等功能特性的影響。結果表明,一定強度的超聲波處理范圍內,豌豆分離蛋白的溶解度、乳化性和乳化穩定性均隨著超聲波強度的提高而增大,當超聲波強度超過69.36 W/cm2時,豌豆分離蛋白的溶解度逐漸趨于平穩;豌豆分離蛋白的乳化性和乳化穩定性的變化在超聲波強度分別為75.68 W/cm2和59.28 W/cm2后趨于穩定。豌豆分離蛋白的起泡性、泡沫穩定性、持水性和吸油性隨著超聲波強度的增大呈現先上升后下降的趨勢,在超聲波強度為69.36 W/cm2時,起泡性和泡沫穩定性達到最高,持水性和吸油性則在超聲波強度分別為75.68、49.35 W/cm2時達到最高。上述分析表明,適度強度的超聲波處理可改善豌豆分離蛋白的功能特性。

超聲波,豌豆分離蛋白,功能性

豌豆(Pisum sativum L.)是重要的糧食作物之一,既可以作為糧食來食用,在其生長期間采摘也可作為蔬菜,營養豐富,蛋白質含量占干豌豆的23%～25%,是一種比較理想的植物蛋白,其組成比較平衡,特別是賴氨酸的含量高達1.5%[1-2],并且含有豐富的維生素和礦物質。豌豆蛋白是一種較好的必需氨基酸源,與FAO/WHO推薦的標準模式較為接近,富含賴氨酸,缺乏含硫氨基酸,并與其它的植物蛋白一樣,蛋氨酸和胱氨酸是限制氨基酸[3]。然而,由于豌豆蛋白溶解度低以及抗營養因子的存在,降低了其消化率和生物效價,并大大限制了其應用范圍,因此為了改善豌豆蛋白的營養性和生物利用率常采用發酵法或酶法將豌豆蛋白水解制備豌豆多肽[4]或采用糖基化法制備具有益生特性的糖蛋白[1]。

超聲波作為一種新型的非熱處理技術,具有空化作用,對大分子可產生機械性斷鍵作用,可以強化提取過程和加速反應,且產生的氣泡經擠壓破裂,可以在瞬間產生較強的機械剪切力,改變蛋白質的構象和特性,從而影響蛋白的功能特性[5-6]。研究表明,(低頻)高場強超聲波是頻率介于16～100 kHz、功率介于10～1000 W/cm2之間,其能量較大,常用于食品工業中改善物料的特性、促進反應、輔助提取和超聲嫩化等領域[6-8]。蛋白質的功能特性,如溶解性、起泡性和乳化性等,在提高食品品質方面尤為重要,因而提高蛋白質的功能特性是國內外學者研究的熱點內容之一[9-10]。本文采用超聲波處理豌豆分離蛋白,研究其對豌豆分離蛋白功能特性的影響,以揭示超聲波技術在改善豌豆分離蛋白功能性方面的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆 當地市場,常溫保存備用;花生油 當地市場;亞硝基鐵氰化鈉、十二烷基硫酸鈉(SDS) 生工生物工程(上海)有限公司;牛血清白蛋白、硫酸銨、蔗糖、濃硫酸、硫酸銅、無水硫酸鈉、磷酸氫二鈉、磷酸三鈉、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、水楊酸鈉、次氯酸鈉、磷酸等均為分析純。

JY92-2D型超聲波細胞粉碎機 寧波新芝生物科技股份有限公司;FD-1D-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;PHSJ-3F型pH計 上海精密儀器儀表有限公司;TU-1901紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱 上海精宏實驗設備有限公司;HH-2型數顯恒溫水浴鍋 江蘇金壇市環宇科學儀器廠;2-16P離心機 美國Sigma有限公司;IKA T18 basic高速分散器 德國ULTRA TURRAX公司;風選中藥粉碎機 山東省青州市益康中藥機械有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 豌豆分離蛋白(PPI)的制備 將豌豆經干燥、脫皮、粉碎,過80目篩,按照料液比1∶5加入正己烷脫脂制成脫脂豌豆粉。稱取100 g脫脂豌豆粉分散于500 mL去離子水中,用2.0 mol/L氫氧化鈉溶液調pH至9.0于40 ℃水浴中攪拌提取處理30 min。然后以4000 r/min離心10 min,沉淀物重復提取一次,合并上清液,用0.05 mol/L鹽酸調節pH到4.5進行酸沉,再以4000 r/min離心10 min,收集沉淀,用蒸餾水清洗2～3次,用0.5 mol/L氫氧化鈉調節其pH到7.0,然后進行冷凍干燥24 h,得到豌豆分離蛋白[4]。采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法[11]測定其蛋白質含量為:87.3%±1.2%。

1.2.2 超聲波處理 配制濃度為3%(w/v)的PPI溶液,置于超聲波細胞破碎儀中用直徑為0.6 cm的超聲波探頭插入溶液內1～2 cm深度處理10 min,工作參數為:工作4 s、間歇2 s、最高溫度50 ℃,為減少熱效應采用冰水浴進行控溫。超聲波功率分別為0、100、200、300、400、500、600 W,處理后的樣品冷凍干燥,測定功能特性。

1.2.3 超聲強度的測定 采用量熱法測定超聲強度,將蛋白樣品溶液置于絕熱容器中于不同功率下處理,超聲過程中溫度的升高通過電子溫度計TASI 601記錄,根據溫度隨時間的變化曲線,用下式估算聲能的大小[5-6],方程如下:

式中,P是超聲功率,W;m是指超聲處理的溶液質量,g;Cp為溶液的比容,J/(kg·K);dT/dt是指該曲線的斜率,K/s。

超聲強度的計算公式如下:

式中,UI是超聲強度,W/cm2;P是超聲功率,W;D是探針直徑,0.6 cm。

1.2.4 溶解度的測定 配制濃度為0.2 mg/mL的待測樣品溶液,用0.5 mol/L的氫氧化鈉溶液或0.5 mol/L的鹽酸調節樣品溶液的pH至7.0,在30 ℃水浴下攪拌30 min(攪拌過程中測定并保持pH),于3000 r/min的轉速離心20 min,取上清液采用微量凱氏定氮法消化-水楊酸比色法[11]測定上清液中蛋白質的含量,根據總蛋白的含量計算蛋白質的溶解性,結果表示為上清液中蛋白濃度占相應的總蛋白濃度的百分比。

1.2.5 起泡性和泡沫穩定性的測定 配制3%的蛋白質溶液,用0.5 mol/L的氫氧化鈉或者鹽酸調節樣品溶液的pH至7.0,在30 ℃水浴下保溫10 min,然后用高速分散器在10000 r/min下均質2 min,迅速倒入500 mL量筒中,記錄均質停止時泡沫的體積V(mL),并記錄均質停止后10 min的泡沫體積V10(mL),按照下式[12]計算起泡性FC和泡沫穩定性FS:

1.2.6 乳化性和乳化穩定性的測定 采用經典的比濁法[13]測定乳化特性。取1.8 mL 1 mg/mL待測樣品,溶于0.2 mol/L pH7.2的磷酸鹽緩沖液中,加入0.6 mL花生油,經高速攪拌器于10000 r/min下處理1 min,分別在攪拌后0 min和10 min時從測試管底部取樣100 μL,用0.1%(w/v)十二烷基硫酸鈉(SDS)稀釋50倍后,測定500 nm處吸光度值,以SDS溶液做空白。乳化性指數(EAI,m2/g)和乳化穩定性指數(ESI,min)的計算公式[13]如下:

式中:DF-稀釋倍數,DF=100;C-為樣品濃度,g/mL;φ-光程,φ=1 cm;θ-乳液中油相所占比例,θ=0.25;A0-0 min時測定的吸光度;A10-10 min時測定的吸光度。

1.2.7 持水性的測定 準確稱取1.0 g樣品分散于20 mL蒸餾水中,80 ℃水浴保溫60 min后,用自來水冷卻至30 ℃,3000 r/min離心10 min,測出上清液的體積V(mL)。按照下式[14]計算持水性:

1.2.8 吸油性的測定 準確稱取2.0 g樣品于離心管中,加入色拉油10 mL混勻,靜置30 min,以3000 r/min轉速離心25 min,測出游離油的體積V(mL)。按照下式[15]計算吸油性:

1.3 數據處理

實驗平行測定3次,結果以平均值±標準偏差SD表示。

2 結果與討論

2.1 超聲強度的測定結果

超聲能量是超聲波在機械作用過程中產生的能量,當超聲波穿過介質時,這種能量會有部分以熱能的方式損失,使被超聲的液體發熱,依據溫度對時間的變化曲線可求得實際的超聲功率[16]。根據超聲強度的計算公式可求得20 kHz超聲波于不同功率下處理220 mL豌豆分離蛋白溶液的超聲強度,結果如表1所示。超聲輸出功率與超聲強度之間具有一定的相關性,且隨著超聲功率的增加超聲強度也逐漸增大,超聲處理過程中介質的特性、處理容器的尺寸與形狀以及阻抗的匹配等因素均影響超聲波的有效功率,因而選擇超聲強度可以更準確的表達超聲波處理的有效性。

表1 超聲功率與超聲強度的關系

注:同一行中數據右上角標注不同的小寫字母表示差異顯著,p<0.05,表2同。

2.2 超聲強度對PPI溶解性的影響

溶解度是蛋白的重要功能特性之一,蛋白質溶解度的大小在實際應用中非常重要,如可用于評定蛋白質的變性程度和聚集度等。超聲強度對PPI溶解性的影響如圖1所示。

圖1 超聲波強度對豌豆分離蛋白溶解度的影響Fig.1 Effect of ultrasound intensity on solubility of PPI

當超聲強度在0～85.36 W/cm2的范圍內,PPI的溶解度隨著超聲強度的增大而迅速增大,這可能是由于超聲波處理可引起蛋白質變性,能夠打斷自由氨基群和鄰近羧基群之間的次級鍵,使溶解度得到提高。同時,超聲波產生的空化效應和機械效應打開蛋白聚集體的同時打斷了蛋白質分子的四級結構,形成溶于水的非共價鍵分子,與溶劑水的相互作用力加強,使其溶解度增加[6]。當超聲強度超過69.36 W/cm2時,PPI溶解度的變化逐漸趨于平穩,這可能是由于超聲強度增大到一定程度,蛋白質分子高級結構受到破壞,使分子表面結構發生變化,原來藏在分子內部的疏水基團大量暴露在分子表面,蛋白質溶解度有所下降或趨于平穩[17]。豌豆蛋白的其他修飾也可提高其溶解度,如美拉德反應將糖基通過共價鍵連接而引入豌豆蛋白質分子中,所連接的糖基分子中羥基的親水特性能夠顯著提高蛋白質的溶解性,但是由于糖基化修飾過程中的副產物影響安全性而限制了其應用范圍[1]。然而,超聲波修飾豌豆蛋白屬于綠色加工技術,產物的安全性高、應用范圍廣。

2.3 超聲強度對PPI起泡特性的影響

由圖2可知,隨著超聲強度的增大,PPI的起泡性和泡沫穩定性均呈現先增加后減小的趨勢,當超聲強度在69.36 W/cm2時,豌豆分離蛋白的起泡性和泡沫穩定性達到最大。原因可能是,其一,超聲波處理改變了PPI的表面疏水性,蛋白分子發生伸展,而適度伸展的蛋白分子間能形成更為穩定的網絡結構和界面膜,因而超聲處理后PPI的起泡性增強。其二,當超聲強度逐漸增大時,PPI的表面疏水性降低,這樣由蛋白分子間相互作用形成的穩定網絡結構和界面膜遭到破壞,產生的泡沫界面膜由于缺乏韌性而容易破裂,導致PPI的起泡性和泡沫穩定性開始下降[18]。

圖2 超聲強度對豌豆分離蛋白起泡性和泡沫穩定性的影響Fig.2 Effect of ultrasound intensity on foaming ability and foam stability of PPI

2.4 超聲強度對PPI乳化特性的影響

由表2可知,PPI的乳化性和乳化穩定性均隨著超聲強度的增大而逐漸增加,乳化活性和乳化穩定性在超聲強度分別達到75.68、59.28 W/cm2后其值趨于穩定，但是在超聲強度超過75.68 W/cm2時,PPI的乳化性和乳化穩定性都有所降低,而乳化穩定性在超聲強度超過59.28 W/cm2后其值趨于穩定。這可能因為,其一,當超聲強度增大時,蛋白質結構的完整性被破壞,造成空穴,蛋白質分子的結構變得疏松,乳化能力和乳化穩定性提高,且蛋白質的乳化性與其溶解度存在正相關,當超聲強度不斷增大,蛋白質高級結構造成大的破壞,蛋白質變性增大,溶解度降低,乳化性能隨之降低。其二,蛋白質的乳化性與其表面疏水性存在著正相關的關系,當超聲強度逐漸增大至75.68 W/cm2時,蛋白質的表面疏水性開始增加,促使蛋白質分子與水形成油-水界面膜,但是過高的超聲強度使得蛋白質表面疏水性顯著降低,使蛋白質分子與水不易形成油-水界面膜,從而使得蛋白質乳化性能開始降低[19]。另外,采用中性蛋白酶法改性豌豆蛋白后乳化性和乳化穩定性明顯提高,但豌豆蛋白的一級結構發生了一定的變化,酶解形成了較多的小分子肽段[20]，因而超聲處理是一種較好的改善豌豆蛋白乳化特性的處理方法。

表2 超聲強度對豌豆分離蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

2.5 超聲強度對PPI持水性的影響

蛋白質的持水性是指蛋白質將水截留在其組織內的能力。由圖3可知,超聲強度在0～75.68 W/cm2時,PPI的持水性隨著超聲強度的增大而增大,但是超過75.68 W/cm2時持水性又開始降低,這可能是因為,超聲處理使蛋白分子發生伸展,將原來被掩蓋的一些肽鍵和極性基團暴露于表面,提高了蛋白質的水結合能力,但是隨著超聲強度的繼續增大,蛋白質的變性增大,降低了蛋白質的表面積和極性氨基酸與水結合的有效性,從而降低蛋白質的持水性[14]。

圖3 超聲強度對豌豆分離蛋白持水性的影響Fig.3 Influence of ultrasound intensity on water binding ability of PPI

2.6 超聲強度對PPI吸油性的影響

蛋白質的非極性區域和脂類的非極性脂肪族鏈間存在疏水作用,蛋白質與甘油三酸酯形成脂-蛋白復合物,因而具有吸油性。由圖4可知,當超聲強度小于49.35 W/cm2時,PPI的吸油性隨著超聲強度的增大而增大,之后PPI的吸油性呈現下降的趨勢,這是因為超聲作用使得蛋白質分子原有結構發生變化,變得疏松,將原來在分子內部的一些非極性基團暴露在分子表面,從而提高了蛋白質分子的吸油性,但是,隨著超聲強度的增加,蛋白質變性程度增大,使得蛋白質分子的吸油性降低[21]。

圖4 超聲強度對豌豆分離蛋白吸油性的影響Fig.4 Influence of ultrasound intensity on oil absorbency of PPI

3 結論

在超聲波強度一定的范圍內,超聲波處理對PPI功能特性的影響有促進作用。PPI的溶解度隨著超聲波強度的提高而增大,當超聲強度超過69.36 W/cm2時,溶解度的變化逐漸趨于平穩;起泡性和泡沫穩定性隨著超聲強度的增大而呈現先增加后減小的趨勢,在超聲強度為69.36 W/cm2時達到最大;乳化性和乳化穩定性均隨著超聲強度的增加而增大，當超聲強度分別超過75.68、59.28 W/cm2時乳化性和乳化穩定性的變化趨于平緩的趨勢;持水性和吸油性則隨著超聲強度的增大呈現先上升后下降的趨勢,分別在75.68 W/cm2和49.35 W/cm2時達到最高。因此,適宜的超聲波處理可以改善豌豆分離蛋白的功能特性。

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Effect of ultrasound treatment on functional properties of pea protein isolate

WANG Zhong-he1,2,WANG Jun2,*,LI Zhen-ni1,SUN Yuan-ming1,LIU Chun-hong1,LAI Chang-hong3

(1.College of Food Science,South China Agricultural University,Guangzhou 510630,China;2.College of Life Science and Food Technology,Hanshan Normal University,Chaozhou 521041,China;3.College of Natural Resources and Enviroment,South China Agricultural University,Guangzhou 510630,China)

In this paper,pea protein isolate(PPI)was subjected to ultrasound treatment,and the effects of ultrasonic intensity on functional properties of PPI,such as solubility,foaming ability and foam stability,emulsifying properties,water binding ability and oil absorbency,were investigated. Results showed that ultrasonic intensity significantly influenced solubility,emulsifying capacity and emulsifying stability of PPI,and with the increase of ultrasonic intensity level,solubility of PPI were increased at first and then tended to maintain a steady value at ultrasonic intensity level of 69.36 W/cm2. Moreover,with the increase of ultrasonic intensity level,emulsifying capacity and emulsifying stability of PPI was increased at first and then tended to maintain a steady value at ultrasonic intensity level of 75.68 W/cm2and 59.28 W/cm2,respectively. However,foaming ability,foam stability,water binding ability and oil absorbency of PPI appeared in the trend of first increase then decrease with the increase of ultrasonic intensity. The highest value of foaming ability and foam stability were achieved at ultrasonic intensity of 69.36 W/cm2. Meanwhile,water binding ability and oil absorbency showed the peak value at ultrasonic intensity of 75.68 W/cm2and 49.35 W/cm2,respectively. From the above results,ultrasound treatment could be used to modify some functional properties of PPI by appropriate selection of ultrasonic intensity level.

ultrasound;pea protein isolate;functional properties

2015-04-09

王忠合(1980-),男,博士,講師,研究方向:食品加工與安全控制技術,E-mail:wangzh20@163.com。

*通訊作者:王軍(1981-),女,博士,講師,研究方向:食品加工技術,E-mail:wangjun19811210@163.com。

廣東省自然科學基金項目(S2013040015478);廣東省高校優秀青年創新人才培養計劃項目(2013LYM0056);韓山師范學院博士啟動項目(QD20130516 & QD20140324);韓山師范學院一般項目(LY201306);潮州市科技計劃項目(2013X05 & 2013X06)資助。

TS214.9

A

1002-0306(2015)23-0116-05

10.13386/j.issn1002-0306.2015.23.015