杭白菊不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

鄺春林,呂 都,黃 霞,高 瑋,申光輝,張志清

(四川農業大學食品學院,四川雅安 625014)

杭白菊不同溶劑提取物的抗氧化活性研究

鄺春林,呂 都,黃 霞,高 瑋,申光輝,張志清*

(四川農業大學食品學院,四川雅安 625014)

杭白菊,提取物,抗氧化活性,自由基

菊花為菊科植物菊(Chrysanthemummorifolium)的干燥頭狀花序,《神農本草經》將菊花列于上品,謂其“主風頭眩,腫痛,皮膚死肌,目欲脫,惡風濕痹,久服利血氣,輕身,耐老,延年”,樸實地載錄了本品的重要主治病證及功效[1]。杭白菊主要產地是浙江省桐鄉市,為“浙八味”之一,也是國家衛生部第一批批準的藥食同源的道地藥材之一[2],杭白菊是2010年版《中國藥典》收載的正品菊花,是我國菊花的一個重要品種[3]。杭白菊的主要化學成分有揮發油、多酚類、黃酮類、多糖、氨基酸和微量元素等,國內外學者已對菊花的藥理作用進行了大量的研究,證實菊花具有抗菌、抗病毒、降低血壓、預防高血脂、抗衰老等多種藥理活性,部分藥理活性與它的抗氧化和清除自由基有關,其中黃酮類是菊花提取物中含量較多的有效成分,具有良好的清除自由基、抗氧化的功能[4]。

機體氧化反應可以產生自由基,在生理情況下自由基不斷產生,也不斷被清除,其濃度保持著動態平衡,但是過量的自由基對機體有損傷效應[5-7]。傳統化學合成抗氧化劑的安全性問題越來越受到人們的重視,在使用上受到限制,很多研究已表明天然提取物有較強的抗氧化能力。Mehmet[8]發現薄荷提取物的清除DPPH自由基的活性優于陽性對照BHT。Masoumeh等[9]在研究艾菊提取物的抗氧化活性時發現其DPPH自由基清除活性比陽性對照 BHT好。葉漢俠等[10]研究表明杭白菊乙醇提取液對DPPH自由基的清除率高達93. 17%,其抗氧化能力是人工合成的TBHQ(叔丁基對苯二酚)的1/10。因此尋求人體容易吸收、能清除體內過量自由基的天然抗氧化劑具有非常重要的意義[11],但是天然抗氧化劑由于提取工藝落后,資源利用率低,我國天然植物的研究主要集中在其溶劑提取部位,對固體殘渣的研究比較少;研究方法不全面,同時藥理研究實驗主要是體外實驗,難以評價其體內功效;在有效成分的協同作用、抗氧化機理、構效關系等方面的研究也比較欠缺,加強這些方面研究可為天然植物開發抗氧化劑的應用奠定理論基礎[12]。

前人對天然抗氧化劑的研究,多采用水、堿性水溶液、酸性水溶液、乙醇、各種濃度的稀乙醇、丙酮、輕汽油等進行提取,再用氯仿、苯、乙醚、甲醇、乙酸乙酯、石油醚、丁醇等進行萃取,很少直接用不同極性溶劑進行提取,而這種分段萃取的方法可能造成某些極性成分的浸出不完全[13]。本研究直接用不同極性的溶劑對杭白菊活性成分進行提取,避免了某些極性成分浸出不完全的問題。不同化學成分有不同的極性大小,根據相似相溶的原理,采用不同極性溶劑對其進行浸提,可獲得具有不同溶解特性的菊花組分。另外前人對于菊花中抗氧化成分的研究主要還是針對某一種或幾種成分的抗氧化能力進行分析,而對總提取物抗氧化活性的研究報道很少,而天然抗氧化劑發揮抗氧化活性作用的成分在種類和數量上都比較復雜,因此對總提取物的抗氧化活性的研究顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杭白菊 四川省茂源農業科技開發有限公司;1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、Tris-HCl鹽 Sigma公司;鐵氰化鉀 天津博迪化工股份有限公司;乙醇、石油醚、乙酸乙酯、無水乙醇、鄰苯三酚、硫酸亞鐵、三氯化鐵、VC、水楊酸、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 成都科龍化工試劑廠;二甲基亞砜 天津科密歐化學試劑有限公司。

CP225D型電子天平 北京賽多利斯儀器系統有限公司;KQ5200DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;FW177中藥粉碎機 天津市泰斯特儀器有限公司;SCIENTZ-12N冷凍干燥機 寧波新芝生物科技股份有限公司;RE-52AA旋轉蒸發器 上海亞榮生化儀器廠;UV-3100紫外可見分光光度計 上海美普達儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 杭白菊粗提物的制備 新鮮杭白菊置于鼓風干燥箱中,45 ℃干燥至恒重,粉碎,過100目篩,密封保存,備用。精確稱取20 g杭白菊粉末4份,分別加入300 mL蒸餾水、80%乙醇、乙酸乙酯、石油醚,利用超聲波提取3次,每次超聲30 min,合并提取液,旋轉蒸發濃縮回收溶劑,真空冷凍干燥后分別得到蒸餾水、80%乙醇、乙酸乙酯、石油醚4種溶劑的杭白菊提取物,密封保存備用[14]。

1.2.2 體外抗氧化活性研究

1.2.2.1 總還原能力的測定 分別適量稱取杭白菊不同溶劑提取物,用二甲基亞砜溶液溶解,蒸餾水定容,配制成一系列質量濃度分別為 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL的待測液,參照文獻[15]的方法進行測定。

1.2.2.2 清除DPPH·能力的測定 參照文獻[16]的方法,略有改動。取0.5 mL不同質量濃度的待測溶液,分別加入2.0 mL(0.2 mmol/L)DPPH-乙醇溶液,混勻,避光反應30 min,在波長517 nm處測定吸光度,調零用95%乙醇。對照組用2.0 mL 95%乙醇代替DPPH溶液,空白組為2.0 mL DPPH溶液與2.0 mL 95%乙醇混合,VC作為陽性對照,每樣品重復實驗3次,取平均值。按以下公式計算DPPH·清除率。

式中:I表示清除率(%);Ai為樣品組吸光度;Aj為對照組吸光度;Ao為空白組吸光度。

1.2.2.4 清除·OH能力的測定 參照文獻[18-19]的方法并略做改進。在10mL的試管中依次加入1.0mLFeSO4溶液(6mmol/L),不同質量濃度的待測溶液1.0mL,再加1.0mLH2O2溶液(6mmol/L),搖勻,靜置10min,再加入6mmol/L的水楊酸溶液3.0mL,搖勻,37 ℃恒溫水浴鍋中反應30min后,于波長510nm處測吸光度,空白試劑代替水楊酸為對照組,空白試劑代替樣品為空白組,以VC作為陽性對照,每個樣品重復實驗3次,取平均值。并按1.2.2.2中的公式計算·OH的清除率。

1.2.3IC50值的測定 以樣品的不同濃度值為橫坐標x,自由基清除率為縱坐標y進行方程擬合。根據擬合方程計算各提取物清除率的IC50值,即當方程中y取50%時,x對應的數值。

1.3 數據處理

采用Origin8.1及SPSS軟件對實驗數據進行統計分析,0.01

2 結果與分析

2.1 杭白菊4種溶劑提取物總還原能力的測定

杭白菊不同溶劑提取物的總還原能力測定結果如圖1。由圖1可知,在所測定的質量濃度范圍內,杭白菊不同溶劑提取物的還原能力隨著質量濃度的增加而增強,但與同質量濃度的VC相比較,還原能力較弱。其能力強弱依次為80%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提取物>石油醚提取物,當提取物質量濃度為0.6mg/mL時,水提物和乙酸乙酯提取物的還原能力接近(p>0.05),差異不顯著。當質量濃度達到1mg/mL時,80%乙醇提取物與乙酸乙酯提取物的還原能力相當,都具有較強的還原能力,差異不顯著(p>0.05)。對同一溶劑提取物在不同質量濃度條件下的還原能力進行顯著性分析,差異極顯著(p<0.01),表明濃度是影響各提取物還原能力的因素。張東娣[20]等研究表明開封產的3種白色菊花不同溶劑提取物還原Fe3+的能力均是甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物,同一種菊花的甲醇提取物具有很好的還原鐵離子的能力,而石油醚提取物幾乎無活性。而本研究的杭白菊石油醚提取物有活性,可能是由原料本身或者提取方法的差異造成的。綜上,杭白菊提取物的還原能力不僅與其提取溶劑有關還與質量濃度有關,原因是不同極性溶劑對抗氧化活性成分的溶解度不同,因此對抗氧化活性成分的提取程度不同;另外,隨著提取物質量濃度增加抗氧化活性成分也相應增加,還原能力增強。

圖1 杭白菊不同溶劑提取物總還原能力Fig.1 The total reduction abilities of different extracts of Chrysanthemum

2.2 杭白菊4種溶劑提取物對DPPH·的清除作用

由圖2可知,杭白菊4種溶劑提取物都具有清除DPPH·的能力,且各提取物在質量濃度0.2～1.0 mg/mL范圍內隨著質量濃度的增加對DPPH·清除率也隨之提高,但均低于同質量濃度的VC的清除率。當質量濃度為1.0 mg/mL時,80%乙醇提取物、水提物和乙酸乙酯提取物的清除率分別為90.47%、72.57%、73.67%,表現出良好的清除DPPH·能力。石油醚提取物的DPPH·清除率最低,在質量濃度為1.0 mg/mL時,清除率僅為27.58%。根據樣品清除DPPH·的曲線方程分別計算其IC50值和相關系數r值,結果見表1。

圖2 杭白菊不同溶劑提取物對DPPH·的清除作用Fig.2 The effects on scavenging DPPH· of different extracts of Chrysanthemum

由表1可知,80%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、水提物的清除DPPH·的IC50分別為0.33、0.56、0.57 mg/mL,根據IC50值評價杭白菊不同溶劑提取物清除DPPH·能力的強弱,IC50值越小,清除能力越好。DPPH·清除能力大小依次為80%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>水提物。水提物、乙酸乙酯提取物清除DPPH·的IC50分別為0.57、0.56 mg/mL,二者清除DPPH·能力差異不顯著(p>0.05),與總還原能力結果一致。石油醚提取物在實驗設定的質量濃度范圍內清除DPPH·能力相對較弱,清除率小于50%,而VC的清除率均高于50%。周瑞等[21]研究黃參不同溶劑提取物抗氧化活性,結果表明4種溶劑提取物清除DPPH·作用的強弱順序為:乙酸乙酯提取物>甲醇提取物>正己烷提取物>二氯甲烷提取物,用乙酸乙酯提取得到的提取物清除DPPH·自由基效果最好。原因可能是不同極性溶劑對清除DPPH·的有效成分的溶出不同,原料不同,有效成分的含量也有差異。根據表1的相關性分析可知,80%乙醇提取物、乙酸乙酯提取物、水提物、石油醚提取物的質量濃度與DPPH·清除率的相關系數分別為0.998、0.997、0.993、0.996,表明杭白菊不同提取物清除DPPH·能力與質量濃度之間有良好的相關性,呈劑量依賴性。

表1 杭白菊不同溶劑提取物對·、·OH清除能力的曲線方程、相關系數及IC50值

注:“-”表示樣品清除率始終高于或低于50%。

圖3 杭白菊不同溶劑提取物對·的清除作用Fig.3 The effects on scavenging · of different extracts of Chrysanthemum

2.4 杭白菊4種溶劑提取物對·OH的清除作用

圖4 杭白菊不同溶劑提取物對·OH的清除作用Fig.4 The effects on scavenging·OH of different extracts of Chrysanthemum

3 討論

朱尚彬等[26]研究黑靈芝不同溶劑提取物的抗氧化活性,結果表明乙酸乙酯提取物表現出最強的活性,其次是水提物。劉曦等[27]對藍莓葉不同溶劑提取物抗氧化活性進行研究,表明藍莓葉不同溶劑提取物的抗氧化活性存在較大差異,所得出的其抗氧化能力的順序為水提取物﹥甲醇提取物﹥乙醇提取物﹥乙酸乙酯提取物﹥氯仿提取物﹥石油醚提取物。劉瑜新[28]對兩種開封黃色菊花體外抗氧化活性進行考察發現,隨著提取溶劑極性的增大,同種菊花不同溶劑提取物總的抗氧化活性逐漸增大,即甲醇提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物。這些差異的原因可能是原料不同抗氧化物質的種類和極性不同,導致不同溶劑提取液中抗氧化物質的種類和量均有所差異,最終在清除自由基能力的強弱上表現出來。秦衛東[29]研究發現,杭白菊抗氧化活性強弱與提取溶劑有關,其中,杭白菊的乙醇提取物抗氧化活性最強,與本研究結果一致。楊英士等[30]對不同溶劑對雪菊萃取效果的影響研究結果表明,不同溶劑對粗提物及雪菊黃酮含量的影響差異顯著,甲醇和水的粗提物含量遠高于其他幾種溶劑提取的,分別為(420±1.63)mg/g和(500±2.94)mg/g;甲醇提取所得黃酮含量遠高于其他溶劑,為(32.29±0.08)mg/g;水提取的粗提物含量雖高,但黃酮含量卻遠低于甲醇提取的,僅為(0.86±0.04)mg/g。因此在評價溶劑提取物時,不僅要考慮提取量,更要考慮有效成分的含量。

本研究結果表明杭白菊乙醇提取物有較強的抗氧化活性,其次是乙酸乙酯提取物,因此在研究天然抗氧化劑時應考慮不同極性萃取劑的提取效果,不能僅限于傳統的水提。本研究可為深入探討杭白菊提取物的抗氧化作用機制和合理開發利用杭白菊資源提供一定的理論依據。

4 結論

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Research of the antioxidant activity ofChrysanthemumMorifolium’sextracts with different solvents

KUANG Chun-lin,LV Du,HUANG Xia,GAO Wei,SHEN Guang-hui,ZHANG Zhi-qing*

(College of Food Science,Sichuan Agricultural University,Ya’an 625014,China)

Chrysanthemum;extracts;antioxidant activity;free radical

2015-02-09

鄺春林(1989-),女,碩士,研究方向:功能性食品,E-mail:chunlinkuang@163.com。

*通訊作者:張志清(1976-),男,博士,教授,研究方向:糧油副產物開發利用,E-mail:zqzhang721@163.com。

寶興縣-四川農業大學校縣合作項目。

TS201.2

A

1002-0306(2015)21-0083-06

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.008