pH與微乳輔料對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性影響的研究

姚 倩,顏 軍,何 鋼,梁 立,代田洋,曾 聰,茍小軍

(成都大學(xué)藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610106)

pH與微乳輔料對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性影響的研究

姚 倩,顏 軍,何 鋼,梁 立,代田洋,曾 聰,茍小軍*

(成都大學(xué)藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,四川成都 610106)

本研究考察pH和微乳處方中的輔料對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響。首先制備含等量白藜蘆醇、pH不同的溶液,再分別將油相、乳化劑及助溶劑與白藜蘆醇單獨(dú)配伍或輔料混合后配伍,制成混合溶液,在40 ℃下放置不同時(shí)間,定時(shí)取樣測(cè)定。分別對(duì)濃度-時(shí)間曲線(xiàn)按各級(jí)動(dòng)力學(xué)方程進(jìn)行回歸,由降解速率常數(shù)推斷pH及各輔料對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響。結(jié)果表明,白藜蘆醇溶液穩(wěn)定的pH范圍為3.6～5.0;微乳各輔料單獨(dú)與白藜蘆醇配伍均加速了白藜蘆醇的降解,但輔料混合后再與成分配伍其降解減慢,甚至可改善白藜蘆醇的穩(wěn)定性。制備白藜蘆醇微乳適合選擇聚氧乙烯蓖麻油為乳化劑,聚乙二醇400為助溶劑。

白藜蘆醇微乳,pH,輔料,穩(wěn)定性

白藜蘆醇廣泛存在于自然界中,在日用食物如葡萄、花生及常見(jiàn)的植物如虎杖、藜蘆及決明中均含有白藜蘆醇[1]。大量的研究發(fā)現(xiàn)白藜蘆醇具有抗炎、抗菌、抗氧化、抗癌、調(diào)節(jié)血脂等作用[2-3],使得白藜蘆醇相關(guān)保健食品的開(kāi)發(fā)成為研究的一大熱點(diǎn)。然而因白藜蘆醇水溶性較差,溶解成為制約其吸收,繼而影響其功效發(fā)揮的一重要因素[4-5]。微乳是由油、水、表面活性劑與助溶劑形成的熱力學(xué)穩(wěn)定的一分散體系,由于表面活性劑與助溶劑的存在,微乳能增加難溶成分的溶解度,并具有靶向釋放、提高療效與降低毒副作用等功效[6-8]。如鹽酸黃連素制成納米微乳后對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌等多種細(xì)菌的抗菌活性明顯高于傳統(tǒng)片劑、膠囊劑和水溶液[8];紫杉醇-五味子乙素微乳顯著降低了紫杉醇的毒性,同時(shí)提高了紫杉醇的抗腫瘤作用[9]。基于微乳在增效與改善口服吸收方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì),本課題組分別以棕櫚酸異丙酯為油相,吐溫-80(Tween-80)、聚氧乙烯蓖麻油(cremophor EL,EL)為乳化劑,聚乙二醇300(polyethylene glycol 300,PEG300)、聚乙二醇400(polyethylene glycol 400,PEG400)為助溶劑,制備了白藜蘆醇微乳,以期提高白藜蘆醇口服生物利用度與療效。此項(xiàng)研究主要采用動(dòng)力學(xué)原理探討溶液pH及微乳處方輔料對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響,為微乳處方工藝的優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白藜蘆醇 西安天一生物制品有限公司,純度大于99.0%;EL Sigma公司;PEG300、PEG400 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑廠(chǎng);棕櫚酸異丙酯 Labcaster公司;吐溫-80 成都市科龍化工試劑廠(chǎng);HPLC儀用水為超純水,其余試劑均為分析純。

表1 白藜蘆醇與不同輔料配伍方案

P680型高效液相色譜儀、TCC-100型柱溫箱、PDA-100型二極管陣列檢測(cè)器 美國(guó)戴安公司;DNP-9025型電熱恒溫培養(yǎng)箱 揚(yáng)州洪都電子有限公司;KQ-3200型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 白藜蘆醇微乳處方 處方中油、表面活性劑、助溶劑及水的比例為2∶1∶1∶6(v/v/v/v),其中1 mL微乳中含白藜蘆醇0.1 mg。

1.2.2 色譜條件 色譜柱:迪馬C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm);流動(dòng)相:甲醇-0.1 mol·L-1乙酸(40∶60);流速:1 mL·min-1;檢測(cè)波長(zhǎng):306 nm;柱溫:35 ℃;進(jìn)樣量:20 μL。

1.2.3 空白干擾實(shí)驗(yàn) 取棕櫚酸異丙酯(oil)、EL、Tween-80、PEG300及PEG400的混合物(2∶1∶1∶1∶1,v/v/v/v)15 mL,置25 mL量瓶中,用流動(dòng)相溶解并稀釋至刻度,搖勻;精密量取20 μL,注入液相色譜儀,考察各輔料對(duì)測(cè)定有無(wú)干擾。

1.2.4 線(xiàn)性關(guān)系 取白藜蘆醇對(duì)照品10.5 mg,置100 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,得白藜蘆醇對(duì)照品貯備液。精密量取上述貯備液0.5,1,2,3,4,5 mL,分別置10 mL量瓶中,加流動(dòng)相稀釋至刻度,搖勻。照“色譜條件”項(xiàng)下的方法分別取上述溶液20 μL注入液相色譜儀,記錄色譜圖,以主峰面積A對(duì)白藜蘆醇濃度C(μg·mL-1)回歸。

1.2.5 回收率 取3個(gè)25 mL量瓶,分別加入濃度為1 mg/mL的白藜蘆醇貯備液0.2、0.25、0.3 mL,另分別加入棕櫚酸異丙酯、EL、Tween-80、PEG300及PEG400的混合物(2∶1∶1∶1∶1,v/v/v/v)15 mL,用去離子水稀釋至刻度,搖勻;精密量取20 μL,注入HPLC儀,測(cè)定白藜蘆醇含量,以加入量作比較,計(jì)算回收率;每個(gè)濃度重復(fù)操作3次。

1.2.6 精密度 分別配制濃度為40 μg/mL的白藜蘆醇溶液,以及含各輔料、白藜蘆醇濃度為10 μg/mL的溶液各6份,用HPLC儀測(cè)定含量,以峰面積值計(jì)算RSD,考察方法的精密度。

1.2.7 pH對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響 根據(jù)《中國(guó)藥典》一部2010版附錄XVD[10],使用醋酸-醋酸鈉,氨-氯化銨緩沖系統(tǒng),配制pH分別為1.0,2.3,3.6,5.0,6.0,7.4,8.0和9.2等8個(gè)緩沖溶液,配制過(guò)程確保在各緩沖溶液中加入相同摩爾數(shù)的鹽,使得各緩沖系統(tǒng)有近似的離子強(qiáng)度。取8個(gè)25 mL量瓶,精密加入濃度為1 mg/mL的白藜蘆醇溶液1 mL,用不同pH的緩沖溶液稀釋至刻度,搖勻。將各量瓶的瓶口用封口膠密封后,置40 ℃下分別放置不同時(shí)間后,精密量取20 μL,注入液相色譜儀,測(cè)定白藜蘆醇含量;采樣時(shí)間120 h,前8 h取5個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè),之后每日測(cè)定一次,當(dāng)90%以上樣品中所含白藜蘆醇已降解一半時(shí),停止采樣。分別按零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程C=C0-kt,一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程lgC=lgC0-kt/2.303,及二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程1/C=1/C0+kt,對(duì)C-t數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

1.2.8 微乳處方對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響 稱(chēng)取白藜蘆醇原料25.3 mg,置25 mL量瓶中,用無(wú)水乙醇溶解并稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。另取9個(gè)25 mL量瓶,編號(hào),分別按表1依次加入各成分后,用去離子水稀釋至刻度,搖勻,瓶口用封口膠密封。將9份樣品置40 ℃恒溫箱中,分別于不同時(shí)間點(diǎn),精密量取20 μL,用HPLC儀測(cè)定白藜蘆醇含量;采樣時(shí)間100 h,前24 h設(shè)定5個(gè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè),之后每日測(cè)定一次,當(dāng)觀(guān)察到90%以上樣品中所含白藜蘆醇已降解50%時(shí),結(jié)束測(cè)定。以時(shí)間為自變量,藥物濃度為函數(shù),分別按零級(jí)、一級(jí)及二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程,對(duì)C-t數(shù)據(jù)進(jìn)行線(xiàn)性回歸,考察白藜蘆醇與不同處方配伍的降解動(dòng)力學(xué)。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理 所有數(shù)據(jù)為3次以上實(shí)驗(yàn)的平均值;采用Excel 2010版軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合。

2 結(jié)果與分析

2.1 空白干擾與線(xiàn)性關(guān)系

色譜圖(圖1)顯示,白藜蘆醇保留時(shí)間為4.26 min,在白藜蘆醇出峰處各輔料對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。峰面積 A 對(duì)白藜蘆醇濃度 C(μg·mL-1)回歸方程為A=3.289×103+5.743×104C,r=0.9999,表明白藜蘆醇在5～50 μg·mL-1濃度范圍內(nèi),線(xiàn)性關(guān)系良好。

圖1 空白輔料與白藜蘆醇的HPLC圖Fig.1 HPLC chromatographs of excipients and resveratrol

2.2 回收率與精密度

白藜蘆醇與混合輔料制成的高、中、低濃度溶液回收率分別為98.32%±0.45%,97.58%±0.61%,97.23%±1.17%,表明方法有較好的準(zhǔn)確度;40、10 μg/mL白藜蘆醇溶液HPLC測(cè)得值的RSD分別為0.81%及1.32%,方法精密度良好。

2.3 pH對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響

白藜蘆醇在不同pH溶液中的降解過(guò)程符合二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程(表2)。將回歸所得速率常數(shù)k取對(duì)數(shù)后,以pH為橫坐標(biāo),lgk為縱坐標(biāo)繪制曲線(xiàn)(圖2),擬合得到的方程為lgk=0.5961-0.6772pH+0.08566pH2(r=0.9943)。由方程和圖2可知,白藜蘆醇溶液最穩(wěn)定的pH范圍為3.6～5.0。

表2 白藜蘆醇在不同pH溶液中的二級(jí)降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程

圖2 lgk-pH曲線(xiàn)Fig.2 Curve of lgk versus pH

制備的微乳pH環(huán)境多在6左右,基于白藜蘆醇的pH穩(wěn)定性,曾考慮加入乙酸降低微乳pH,然而在酸性下微乳成型性不佳,易發(fā)生團(tuán)聚,因此微乳制備中取消了pH調(diào)節(jié)這一步,白藜蘆醇最后分散在pH6.0～6.5的近中性微乳溶液中。

2.4 微乳處方對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性的影響

對(duì)白藜蘆醇與微乳不同輔料混合后的降解動(dòng)力學(xué)過(guò)程進(jìn)行了擬合,結(jié)果顯示,一級(jí)與二級(jí)動(dòng)力學(xué)方程的擬合優(yōu)度較佳(r>0.90),而一級(jí)動(dòng)力學(xué)的擬合效果為最好(r>0.95)(表3,表4)。由表可知,微乳處方中的輔料均對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性產(chǎn)生了較大的影響,油、吐溫-80、EL及PEG300引起白藜蘆醇降解速率分別增大11、12.5、8.5及15倍;僅PEG400影響相對(duì)較小,配伍后白藜蘆醇降解速率增加了約60%。白藜蘆醇在PEG400中的穩(wěn)定性顯著優(yōu)于PEG300,可能的原因?yàn)镻EG300的引入增加了組分的溶解度[11],同時(shí)也增強(qiáng)了其與水之間的相互作用,導(dǎo)致降解加快;PEG400不僅可改善組分的水溶性,還能降低活性成分所處環(huán)境的極性,有助于提高成分的穩(wěn)定性[12]。乳化劑EL對(duì)白藜蘆醇穩(wěn)定性的不良影響小于吐溫-80(表3)。

雖然微乳處方各輔料單獨(dú)與白藜蘆醇配伍極大地促進(jìn)了組分的降解,但若預(yù)先將各輔料混合后再配伍,白藜蘆醇的降解則開(kāi)始減慢,如PEG300與油、乳化劑的混合物使組分降解速率增大7倍,較單獨(dú)配伍時(shí)的降解速率有了大幅度的減小;PEG400與油、EL合用甚至提高了組分的穩(wěn)定性,白藜蘆醇降解速率僅為原組分的86%。可能的原因?yàn)楦鶕?jù)微乳緩釋的特性可判斷[13],白藜蘆醇被包裹在乳滴內(nèi),減少了組分與水之間的接觸;另一種可能是某些輔料本身可引起白藜蘆醇降解,當(dāng)它與其他輔料混合時(shí),輔料之間也將產(chǎn)生相互作用,如PEG400的羥基與EL結(jié)構(gòu)中的氧原子能形成氫鍵結(jié)合;油、表面活性劑與助溶劑的疏水基團(tuán)間可發(fā)生疏水鍵的融合,這些相互作用均可以削弱它們與組分之間的連接,因而對(duì)組分的不良影響減弱。

在油相選擇方面,除棕櫚酸異丙酯外,另考察了菜籽油和花生油,后二者因很難制備出質(zhì)量穩(wěn)定的微乳而未選用。在不同pH下的降解實(shí)驗(yàn)中,設(shè)置的白藜蘆醇初始濃度約為40 μg·mL-1,初濃度設(shè)置較高,目的是保證能在較長(zhǎng)的時(shí)間內(nèi)觀(guān)察活性成分的含量變化;而在研究輔料對(duì)組分穩(wěn)定性的影響時(shí),選擇的白藜蘆醇濃度為10 μg·mL-1,這主要考慮到口服微乳在體內(nèi)將被體液稀釋,而注射用微乳在使用前通常會(huì)用生理鹽水或葡萄糖溶液稀釋,白藜蘆醇的實(shí)際使用濃度約為10 μg·mL-1。

表3 一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程擬合結(jié)果

注:C單位μg/mL;RES為白藜蘆醇，表4同。

表4 二級(jí)動(dòng)力學(xué)擬合結(jié)果

3 結(jié)論

白藜蘆醇在不同pH環(huán)境及微乳輔料溶液中的降解過(guò)程分別符合二級(jí)及一級(jí)降解動(dòng)力學(xué)方程,其穩(wěn)定的pH范圍為3.6～5.0。從穩(wěn)定性方面考察,白藜蘆醇微乳助溶劑及乳化劑應(yīng)分別選擇PEG400與EL。雖然微乳處方各輔料單獨(dú)與白藜蘆醇配伍均可加快白藜蘆醇的降解,但若預(yù)先將各輔料混合后再配伍則組分降解減慢,PEG400、棕櫚酸異丙酯與EL的混合物甚至提高了白藜蘆醇的穩(wěn)定性。

[1]郜海燕,于震宇,陳杭君,等. 白藜蘆醇功能和作用機(jī)理研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)食品學(xué)報(bào),2006,6(1):411-416.

[2]張初署,楊慶利,潘麗娟,等. 白藜蘆醇的提取及分離純化研究進(jìn)展[J]. 食品工業(yè)科技,2008,29(8):289-292.

[3]李延華,王偉君,張?zhí)m威,等. 白藜蘆醇的研究現(xiàn)狀及應(yīng)用前景[J]. 中國(guó)釀造,2008,184(7):10-12.

[4]Amri A,Chaumeil J C,Sfar S,et al. Administration of resveratrol:What formulation solutions to bioavailability limitations?[J]. Journal of Controlled Release,2012,158(2):182-193.

[5]Francioso A,Mastromarino P,Masci A,et al. Chemistry,stability and bioavailability of resveratrol[J]. Journal of Medicinal Chemistry,2014,10(3):237-245.

[6]Wen J Y,Du Y,Li D H,et al. Development of water-in-oil microemulsions with the potential of prolonged release for oral delivery of L-glutathione[J]. Pharmaceutical Development and Technology,2013,18(6):1424-1429.

[7]Bhatia G,Zhou Y C,Banga A K. Adapalene microemulsion for transfollicular drug delivery[J]. Journal of Pharmaceutical Science,2013,102(8):2622-2631.

[8]孫紅武,歐陽(yáng)五慶. 鹽酸黃連素納米微乳的制備及其體外抗菌活性研究[J]. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2007,35(1):54-58.

[9]孟憲軍,商紅軍,李斌,等. 紫杉醇-五味子乙素微乳抗腫瘤作用的研究[J]. 食品工業(yè)科技,2012,33(20):125-128.

[10]國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典藥典[S]. 北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010.

[11]Tejwani R W,Joshi H N,Varia S A,et al. Study of phase behavior of poly(ethylene glycol)-polysorbate 80 and poly(ethylene glycol)-polysorbate 80-water mixtures[J]. Journal of Pharmaceutical Sciences,2000,89(7):946-950.

[12]Wang F,Shao L L,Zhang X,et al. Comparison study on the interaction mechanisms of B. amyloliquefaciens amylase with PEG-400 and TEPA and the properties of enzyme[J]. Journal of Molecular Structure,2015,1081:457-465.

[13]余東升,姚昶,潘立群. 黃芪注射液濃縮液微乳的制備及其體外釋放實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)研究[J]. 山東中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),31(2):148-151.

Effect of pH and microemulsion excipients on the stability of resveratrol

YAO Qian,YAN Jun,HE Gang,LIANG Li,DAI Tian-yang,ZENG Cong,GOU Xiao-jun*

(Key Laboratory of Medicinal and Edible Plant Resources Development of Sichuan Education Department,Chengdu University,Chengdu 610106,China)

In this study,the effect of pH and microemulsion excipients on the stability of resveratrol were examined. First,solutions containing equivalent resveratrol with various pH were prepared. Then resveratrol-excipient solutions were formulated,in which resveratrol was either mixed with oil phase,emulsifier,and co-solvent,separately,or blended with them together. The test solutions were placed under 40 ℃ and assayed at specific intervals. Curves of concentration versus time were fitted by sorts of dynamic equations,respectively,from which constants of degradation rate were calculated. The results showed that stable pH range of resveratrol was 3.6 to 5.0. Though microemulsion excipients accelerated degradation of resveratrol when they were mingled with the ingredient separately,the mixture could make resveratrol decomposition slower. Some excipient mixture even improved resveratrol stability. The appropriate emulsifier and co-solvent for resveratrol microemusion were cremophor EL and polyethylene glycol 400,respectively.

resveratrol microemulsion;pH;excipients;stability

2015-01-28

姚倩(1971-),女,博士,教授,研究方向:藥食同源植物有效部位的篩選與產(chǎn)品開(kāi)發(fā),E-mail:yaoqiancd@hotmail.com。

*通訊作者:茍小軍(1974-)，男，博士，教授，研究方向：食品化學(xué)，E-mail:cddxzyhx@hotmail.com。

教育部留學(xué)回國(guó)人員科研啟動(dòng)基金(20131792)。

TS202.3

A

1002-0306(2015)21-0098-04

10.13386/j.issn1002-0306.2015.21.011