γ射線聯合2450MHz電磁輻射對C3H10T1/2細胞生長和惡性轉化的影響

西安交通大學第一附屬醫院(西安 710061)

劉慧娟▲ 劉 佳▲ 車 宇▲ 張曉智△

γ射線聯合2450MHz電磁輻射對C3H10T1/2細胞生長和惡性轉化的影響

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目的：觀察γ射線和2450 MHz電磁聯合輻射對C3H10T1/2小鼠胚芽細胞增殖能力、惡性轉化、細胞周期和細胞凋亡的影響。方法：將C3H10T1/2細胞按電磁輻射強度隨機分為對照組(0mW/m2)、電磁輻射低劑量組(15mW/m2)、中劑量組(30mW/m2)和高劑量組(50mW/m2)，聯合組同時給予6Gy的γ射線照射。檢測C3H10T1/2小鼠胚芽細胞轉化、細胞周期和凋亡情況；用免疫組化和圖像分析技術檢測細胞Bax蛋白表達。結果：與對照組相比，單純電磁輻射處理的細胞存活率和細胞轉化未發生改變， γ射線與高劑量電磁輻射聯合組存在惡性轉化。γ射線組和復合組于輻射后3h S期細胞顯著減少，G0/G1期細胞比例明顯升高，電磁輻射組細胞凋亡率輕度增高，而γ射線組和復合組則升高較為顯著，且復合組引起細胞的凋亡率升高較單純γ射線組更明顯，照射后Bax表達增強。結論：γ射線與電磁輻射復合照射后C3H10T1/2細胞發生惡性轉化、細胞周期和凋亡，2450MHz電磁輻射可進一步加強γ射線對細胞惡性轉化、細胞周期及凋亡的誘導作用。Bax在γ射線和2450MHZ電磁聯合輻射導致C3H10T1/2細胞發生凋亡且較單純組加重方面起重要作用。

γ射線和2450MHz電磁輻射是生活和工作環境中兩種典型的輻射影響因素，其生物效應和對健康的影響一直倍受關注。但往往在進行健康危險程度評價時，都簡單地假定處于某一種危害因素之中，所致的健康損害效應也是單獨的。但在一些特殊職業環境如腫瘤放射治療臨床實踐中，卻可能存在著電離輻射和電磁輻射復合照射的情況[1]。從目前研究來看，報道不同類型輻射間的聯合毒效應相對較少。本實驗觀察γ射線和2450MHz電磁輻射復合照射后C3H10T1/2小鼠胚芽細胞增殖能力、細胞周期、細胞凋亡和惡性轉化的變化，并探討兩者之間可能的聯合效應。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 BME培養基(Gibco公司)，胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、二甲基亞砜 (DMSO)、青霉素、鏈霉素等(上海生工)，培養皿、96孔培養板(Coming公司)、Annexin V-FITC 凋亡檢測試劑盒(Biopec)，60Coγ射線放射源(由輻照中心提供)，微波功率場強儀(Narda公司)，流式細胞儀(Becton Dickinson公司)。

2 電磁輻射系統 2450MHz電磁輻照暴露裝置由信號發生器、電磁信號功率放大器和輻照屏蔽室組成。電磁信號發生器發出的信號由功率放大器放大并輸入輻照屏蔽室內，經過發射端產生電磁場。內部的電磁場功率密度由探頭接收后經電腦讀出。

3 方 法

3.1 細胞培養與照射分組：8克隆的C3H10T1/2小鼠胚芽細胞在含4mmol/L左旋谷酰胺和10%胎牛血清(整個實驗都用同一批號的血清)Eagle氏基礎培養基中(Eagle’s basal medium, BME)培養,培養箱溫度保持在37℃內含5%CO2，0.05%EDTA-Trypsin消化傳代。每次實驗復蘇一管同代凍存細胞。

將細胞隨機分為對照組、15、30和50mW/m2暴露組。第2天細胞貼壁后采用60Co輻照γ射線照射，劑量率為1Gy/min(由本院輻照中心提供)，γ射線照射后放入電磁輻射輻照系統內進行輻照，2h/d，連照7d后第8天分為電磁輻射組和聯合組，聯合組接受6Gy的γ射線照射。細胞分組為M0組(0Gy，0mW/m2)、M1組(0Gy，15mW/m2)、M3組(0Gy，30mW/m2)、M5組(0 Gy，50mW/m2)、IM0組(6Gy，0mW/m2)、IM1組(6Gy，15mW/m2)、IM3組(6Gy，30mW/m2)、IM5組(6Gy，50mW/m2)。

3.2 細胞存活和轉化分析：細胞暴露后隨機分為兩份:一份接種200個細胞于10cm培養皿中，共5個樣本用于檢測細胞毒性；另一份接種2000個細胞于10cm培養皿中，用于檢測細胞轉化。用含10%血清的培養液(BME-10)每周換液2次，1周左右用于檢測細胞毒性的5個樣本皿細胞先用PBS洗2遍，再用含10%甲醛的姬姆薩染料染色固定計數克隆。大約3～4周待細胞轉化組細胞匯合，此后更換5%血清的培養液(BME-5)培養，每周換液1次，6～7周左右細胞轉化組細胞用PBS洗2遍，再用含10%甲醛的姬姆薩染料染色固定計數轉化灶。計算每103存活細胞轉化灶的發生頻率，計算公式如下:

體外細胞轉化(In vitro cell transformation)是指在體外培養條件下，細胞的生長、增殖和分化等特性發生失控的變化，以及由此而導致的贅生物表象和裸鼠體內成瘤。轉化灶的定義使用Reznikoff等的經典定義。每組實驗至少重復3次，實驗數據用鄧奈特(氏)檢驗方差分析計算。

3.3 細胞周期測定：照射后，在每個時間點，細胞(1×106)經消化液消化后，離心，70%乙醇固定，然后PI染色，在流式細胞儀上檢測細胞周期分布(應用軟件名稱為MedFit LT)。

3.4 蛋白雜交：各實驗組細胞首先用4C的PBS緩沖液沖洗1次，接著用橡皮擦將細胞刮落于1 ml PBS中，離心得到沉淀，細胞沉淀經冷凍-解凍-冷凍幾次后，在沸水中煮沸3min，最后加樣于12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中。電泳后，蛋白被電轉移至Hybond-ECL硝化纖維素膜。膜上的非特異性部位用免疫雜交液4℃過夜進行封閉。所用抗體如下：小鼠抗Bax單克隆抗體,抗小鼠IgG辣根過樣化物酶。雜交后的條帶用ECL試劑盒進行顯色。

3.5 流式細胞儀的凋亡測定：各實驗組細胞用流式細胞儀進行細胞凋亡檢測，試劑盒為Annexin-V-FLUOS。實驗過程遵試劑盒說明。

結 果

1 2450MHz電磁輻射、γ射線射線單獨及聯合照射對細胞集落形成率的影響：與對照組M0比較，單獨電磁輻射照射組M5細胞的增殖活性下降;聯合組中與單獨電離IM0相比，IM3和IM5組細胞的增殖活性明顯下降，其中IM5組細胞的增殖活性下降尤為顯著。各組細胞的增殖百分率，見表1。

2 2450MHz電磁輻射、γ射線單獨及聯合照射對細胞惡性轉化的影響：與對照組M0比較，單獨電磁輻射照射組、單獨γ射線組、聯合組中IM1組細胞的惡性轉化改變較低，聯合組中IM3和IM5組細胞的有細胞惡性轉化與與對照組M0比較惡性轉化增加(P﹤0.01)。各實驗組細胞的惡性轉化結果，見表1。

3 2450MHz電磁輻射、γ射線單獨及聯合照射對細胞周期分布的影響：如表2所示，未發現單獨2450MHz電磁輻射暴露改變C3H10T1/2細胞的細胞周期分布。γ射線聯合2450MHz電電磁輻射聯合加強細胞周期阻滯于G1期和G2期效應。電磁輻射波聯合γ射線照射后3 h，細胞輕微堆積于G0/G1期，G0/G1期細胞的百分比從對照組的71%增加87%。增加的幅度在照射后6h變得更明顯。24h G0/G1期細胞周期恢復。微波暴露對于在24h范圍內γ射線誘導的G1和G2期阻滯沒有影響。

表1 2450MHz電磁輻射波、γ射線射線單獨及聯合照射對細胞集落形成率和細胞惡性轉化的影響±s)

注：PE=集落形成率;Fi=有轉化灶;Fo=無轉化灶; TII= II型轉化灶; TIII= III型轉化灶;TII+III=II型轉化灶+ III型轉化灶;SE=標準誤；與M0組或IM0組比較， *P<0.01

表2 2450MHz電磁輻射、γ射線射線單獨及聯合照射對細胞周期分布的影響±s，%)

注：與M0組或IM0組比較，*P<0.01

4 2450MHz電磁輻射、γ射線單獨及聯合照射對細胞凋亡的影響：如圖1所示，單獨電磁輻射作用不能誘導C3H10T1/2細胞凋亡。6Gyγ射線照射后24 h和72 h，只有少量細胞發生了凋亡(約占細胞總數的2%～3%)。值得注意的是，電離輻射后電磁輻射暴露24h顯著促進了γ射線誘導的凋亡，凋亡細胞從約3%升至0.4%。但在72h時間點電磁輻射對凋亡的促進作用消失。

與M0組或IM0組比較，*P<0.01

圖1 2450MHz電磁輻射、γ射線單獨及聯合照射對細胞凋亡的影響

5 2450MHz 電磁輻射、γ射線單獨及聯合照射對Bax的表達的影響：為了探討電磁輻射促進γ射線誘導的細胞凋亡水平的機制，我們檢測了凋亡調節蛋白Bax的表達。同凋亡的結果一致，電磁輻射暴露促進了γ射線照射后24 h Bax的表達。輻照后72 h，Bax的表達恢復到對照水平，電磁輻射暴露在72 h時間點對Bax的表達沒有影響。同樣，單獨電磁輻射暴露對Bax的表達也沒有影響(圖2)。

圖2 2450MHz 電磁輻射、γ射線單獨 及聯合照射對Bax表達的影響

討 論

C3H10T1/2細胞是從C3H小鼠分離建立的間充質干細胞株，可分化為骨、軟骨、脂肪、肌和內皮細胞，是研究細胞惡性轉化的標準細胞模型，故本次實驗選用此細胞系。目前有關電磁輻射和電離輻射的復合效應的報道較少，且存在不一致的結果。有學者認為，電磁輻射和電離輻射的復合效應與這兩種輻射照射的條件密切相關，包括照射時間的長短及照射的先后次序等方面，在電離輻射照射后的急性作用期施加電磁輻射，可增加電離輻射效應。賈永峰等[2]研究結果顯示，5.5Gy的γ射線和50 mW/cm2電磁輻射復合照射可較單純γ射線增加小鼠的死亡率。王中和等發現[3]利用γ射線和高功率毫米波聯合照射人舌癌細胞能明顯抑制該細胞的克隆能力，且明顯高于單純電磁輻射和γ射線組。張衛研究顯示[4]，單獨電磁輻射和γ射線均能抑制SHG44細胞的生長，且電磁輻射能增強γ射線的作用。陸敏霞研究表明[5]，電磁輻射有降低細胞活力的作用，且有一定劑量相關性；高劑量微波(6mW/cm2)聯合γ射線照射能降低SHG44 細胞的存活率，且損傷效應在細胞受到電離輻射后能被放大。但也有研究顯示電磁輻射不僅能減輕γ射線所造成的小鼠的輻射損傷，而且能夠促進放射損傷后的恢復。

電磁輻射可能的致癌效應是其生物學效應研究中的熱點，近年來電磁致癌效應方面的研究越來越多，但至今仍存在分歧。Elizabeth等[6]進行過與本實驗相似的實驗研究，他們的研究同樣選用C3H10T1/2細胞系，分別暴露于三種不同強度2450MHz電磁輻射，時間為24h，X射線為致瘤性轉化激動因子，TPA為致瘤性轉化促進因子，共26種不同的暴露條件，結果顯示只有在TPA出現時電磁輻射會引起C3H10T1/2細胞轉化頻率隨SAR增加而增加的劑量-效應關系。

本實驗發現，γ射線和電磁輻射復合照射可誘導C3H10T1/2細胞的生長改變及惡性轉化，同時還發現，在γ射線照射后即刻給予50mW/m2的2450MHz微波照射，能夠進一步增強C3H10T1/2細胞的凋亡。

細胞生長和細胞凋亡密切相關。細胞生長或凋亡失控都可能通過干擾細胞更新平衡從而導致惡性腫瘤發生率的增加。本次實驗結果表明單獨電磁輻射(2450MHz，15、30和50mW/m2)暴露不會引起C3H10T1/2細胞的生長改變及惡性轉化發生，而且單純電磁輻射暴露也未對細胞周期分布產生影響。雖然我們的實驗結果與其他大多數的研究支持電磁輻射暴露不影響細胞生長的觀點，但也有相反的研究報道。

有研究顯示，電磁輻射暴露能夠影響γ射線或一些化學物質[6]誘導的細胞的凋亡程度，但詳細機制尚不明確。有資料顯示這種現象可能是由于電磁輻射參與了細胞鈣離子內流的調節[7]。如果細胞通過凋亡通路清除DNA損傷細胞的能力受到破壞而導致大量受損細胞在體內存留，就會增加腫瘤發生的危險度。因此，我們觀察了2450MHz電磁輻射對C3H10T1/2細胞γ射線誘導的凋亡水平的影響。雖然6Gyγ射線只誘導少量細胞發生了凋亡，但電磁輻射暴露仍會導致γ射線照射后24h細胞的凋亡水平升高，照后72 h的細胞凋亡水平恢復正常，這表明電磁輻射的暴露對γ射線的照射誘導的凋亡水平的協同效應是短暫的。

Bax是Bcl-2家族引起細胞凋亡成員之一。Bcl-2/Bax比例在細胞命運中起重要作用。Bax二聚體形成可誘導細胞凋亡；但Bax表達降低或Bcl-2表達增加，Bax與Bcl-2就會形成異源二聚體抑制凋亡的發生。許多研究表明，電離輻射可調控Bcl-2家族基因的表達。有報道顯示C3H10T1/2細胞受到電離輻射暴露后可低水平表達Bax[8]。我們的實驗結果與此報道一致，照射后Bax的表達是對照水平的1.2倍。在本實驗中，我們發現2450MHz電磁輻射暴露增強了輻照后24h Bax的表達?？紤]到在同一個時間點電磁輻射也增加了γ射線誘導C3H10T1/2細胞凋亡水平，因此提示雖然單獨電磁輻射暴露對細胞生長影響較小，但它可以通過改變C3H10T1/2細胞Bax的表達途徑從而影響γ射線誘導的C3H10T1/2細胞凋亡水平。

總之，γ射線和2450MHz電磁輻射復合后C3H10T1/2細胞發生明顯生長改變、惡性轉化及凋亡，電磁輻射對γ射線誘導的C3H10T1/2細胞損傷有協同增強作用，Bax和Bcl-2蛋白在該協同作用中發揮重要作用，聯合照射后是否有其他凋亡調控基因及蛋白發揮調控作用具體途徑，有待進一步深入研究。

[1] 張 衛, 曹 毅, 童 建. 微波與γ射線聯合照射對細胞生長增殖的影響[J].中國職業醫學, 2008, 35(3):194-196.

[2] 賈永峰，王水明，陳建魁. γ射線與微波復合作用對小鼠造血系統功能及形態學的影響[J]. 解放軍醫學雜志，2006，31(8)：790-793.

[3] 王中和，唐友軍，周曉健. 放射聯合高功率密度毫米波對人舌鱗癌細胞的協同抗瘤效應[J]. 實用腫瘤雜志，2000，15(4)：226-229.

[4] 張 衛，曹 毅，孟謙謙. 微波與γ射線聯合照射對細胞生長增殖的影響[J]. 中國職業醫學，2008，35(3)：194-196.

[5] 陸敏霞，曹 毅，張 衛，等.微波及γ射線單獨或聯合輻射對人神經膠質瘤細胞HSP70 表達的影響[J].環境與職業醫學 2009,26(4)：144-147.

[6] Elizabeth K, Balcer K,George H H. Neoplastic transformation of C3H10T1/2 cell following exposure to 120 Hz modulated 2.45 GHz microwaves and phorbol ester tumor promoter[J]. Radiation Res, 1991, 126: 65-72.

[7] Ding G R, Yaguchi H, Yoshida M. Increase in X-ray-induced mutations by exposure to magnetic field (60 Hz, 5 mT) in NF-kappaB-inhibited cells[J]. Biochem Biophys Res Commun,1999,276(1): 238-43.

[8] Sakakura C, Sweeney E A, Shirahama T. Overexpression of bax sensitizes human breast cancer MCF-7 cells to radiation-induced apoptosis[J]. Int J Cancer,1996,67(1): 101-105.

(收稿：2014-11-12)

Effect of cell growth and malignant transformation induced by combination of γ-ray and microwave

First Affiliated Hospital of,Xi’an Jiaotong University (Xi’an 710061)

Liu Huijuan Liu Jia Che Yu et al

Objective：To investigate the interactive effects of 2450 MHz microwave and γ-rays radiation on C3H10T1/2 cells growth，malignant transformation ,Cell cycle and apoptosis．Methods：C3H10T1/2 cells were irradiated with 0，15，30，50mW/m22450 MHz microwave and 6Gy γ-ray radiation．this study was to investigate the possible effects of 2450 MHz microwave at different doses on γ-ray induced transformation in C3HlOT1/2 cells; Cell cycle and apoptosis was assessed by flow cytometry. Bax expression of cells were detected by immuocytochemical staining with image analysis．Results： Compared with control group, microwave radiation group of cell survival and cell transformation was not changed. there was a significant increase in malignant transformation at γ-ray plus microwave radiation group. cells S stages were significantly decreased，while cells in G0/G1stages were significantly increased at 3 h. Moreover，the amount of apoptosis cells in combined radiation group was more than that in γ-ray irradiation group．In the early days after irradiation，Bax protein expression was raised. Conclusion：γ-ray combined with microwave could induce malignant transformation and apoptosis of C3H10T1/2 cells，and microwave could enhance the effect of γ-ray．The expressions of Bax in harmony may play a role in apoptosis of C3H10T1/2 cell.

Gtamma rays Electromagnetic radiation Cell proliferation Cell transformation,neoplastic Apoptosis Mice

γ射線 電磁輻射 細胞增殖 細胞轉化，腫瘤 細胞凋亡 小鼠

R363.1

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.003

▲陜西省腫瘤醫院

△通訊作者