不同濃度葡萄糖對脂肪細胞因子mRNA表達的影響*

西安市中心醫院內分泌科(西安 710003)

王麗萍 劉曉霞 武金娥▲ 周 鑫▲ 劉 萍Δ

不同濃度葡萄糖對脂肪細胞因子mRNA表達的影響*

西安市中心醫院內分泌科(西安 710003)

王麗萍 劉曉霞 武金娥▲周 鑫▲劉 萍Δ

目的：研究不同濃度葡萄糖對脂肪細胞因子表達的影響。方法：對體外培養、誘導小鼠3T3-L1細胞，分別給予25mmol/L、40mmol/L及70mmol/L濃度的葡萄糖作用24h，提取細胞RNA，通過反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)，檢測脂肪細胞因子Vaspin、IL-6及脂聯素(Adiponectin，APN)mRNA表達情況。結果：隨葡萄糖濃度的增高，Vaspin、IL-6 mRNA的表達增高，APNmRNA的表達減低。結論：培養液中葡萄糖濃度的變化是影響脂肪細胞Vaspin、IL-6及APNmRNA表達的因素。

多種脂肪因子在2型糖尿病的發病機制中所起的作用越來越受到關注。本研究通過對3T3-L1細胞予以不同濃度葡萄糖培養，了解葡萄糖對脂肪細胞因子表達的影響。

材料和方法

1 材 料

1.1 細胞株：3T3-L1脂肪前體細胞由中國醫學科學院基礎醫學研究所北京協和醫學院細胞資源中心提供。

1.2 試劑：DMEM培養基(購自GIBCO公司)，胎牛血清(購自杭州四季青生物制品公司)，3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutal-1-methylxan-thine，購自Sigma公司)，胰島素(Insulin，購自Sigma公司)，Trizol(購自Gibco BRL公司)，Prime Script RT reagent Kit(大連寶生物工程)，SYBR?Premix Ex TaqTMII(大連寶生物工程)。

1.3 儀器：CO2細胞孵育箱(購自Thermo Scientific)，倒置顯微鏡XD-202(購自江南光學儀器廠)，CFX96熒光定量PCR儀(購自美國Biorad公司)。

2 方 法

2.1 細胞培養： 用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)培養3T3-L1前脂肪細胞，置于37℃、5%二氧化碳(CO2)、飽和濕度孵箱中孵育。待細胞狀態良好時按一定密度接種于六孔細胞培養板中。細胞融合2d后，再給予0.5mmol/L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、1mg/L胰島素、0.25μmol/L地塞米松及DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)繼續培養48h，繼而換用含1mg/L Insulin的培養基中再培養48h，隨后再用DMEM高糖培養基(含10%胎牛血清)繼續培養，培養液每2d換1次。誘導分化8～10d，當3T3-L1細胞90%以上呈現脂肪細胞表型時，給予不同濃度葡萄糖作用24h，Trizol法提取RNA。

2.2 細胞鑒定： 誘導前后使用油紅O染色鑒定，證明是成熟脂肪細胞(油紅O是一種可以特異地和細胞內三酰甘油結合的紅色染料，與未分化細胞和細胞外脂質不結合)。吸棄培養板里的分化培養基；1×PBS沖洗細胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸鹽緩沖液4 ml/孔，室溫固定1 h；吸棄固定液；加入油紅O溶液，室溫染色3 h；吸棄染色劑；無菌三蒸水沖洗2次，洗去未著色染料；顯微鏡下觀察，照相。

2.3 反轉錄實時熒光定量聚合酶鏈反應(RT-qPCR)通過檢測反應液中 SYBR Green I 的熒光強度，達到監控 PCR 產物擴增量的目的。SYBR?Green I與雙鏈DNA結合后發出熒光，所以可以通過檢測反應體系中的SYBRTMGreen I熒光強度，達到檢測PCR產物擴增量的目的。Vaspin上游引物序列：5'-CTT CCT ATC CCC ACT GAG-3' ，下游引物序列：5'-CTT TGT GTC CTC CGT CTC-3' ；APN上游引物序列：5'-GCA GAG ATG GCA CTC CTG GA -3' ，下游引物序列：5'-CAG GGA AGC CTC TTT CTC CT-3' ；IL-6上游引物序列：5'-AGC CAG AGTCCT TCA GAG -3'，下游引物序列5'-GTC CTT AGC CAC TCC TTC-3'; 內參為甘油醛-3-磷酸脫氫酶( glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，gapdh )上游序列5'-GCT GAG TAT GTC GTG GAG T -3' ，下游引物序列 5'-GTT CAC ACC CAT CAC AAA C -3' 。

2.4 統計學方法：采用SPSS l6.0統計學軟件，計量資料比較采用t檢驗，數據以Mean±sd表示。P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 成功誘導分化成熟脂肪細胞(圖1)。

圖1 誘導分化3T3-L1細胞

2 各組脂肪因子表達情況： 25mmol/L、40mmol/L、及70mmol/L葡萄糖作用3T3-L1細胞24h，Vaspin/gapdh比值分別為1.27±0.26、2.29±0.16及3.00±0.52，IL-6/gapdh比值分別為1.07±0.06、1.58±0.11及2.27±0.11，APN/gapdh比值分別為1.17±0.16、0.61±0.04及0.42±0.04。隨著培養液中的葡萄糖濃度的增加，脂肪細胞Vaspin及IL-6 mRNA的表達升高，APN mRNA的表達減低，除Vaspin/gapdh比值在40mmol/L及70mmol/L組間比較差異無統計學意義外(P>0.05)，其余組間均具有統計學差異(P<0.01)(圖2)。

圖2 不同濃度葡萄糖對脂肪細胞因子Vaspin、IL-6及APN mRNA表達的影響(**P<0.01) 討 論

目前認為，脂肪組織除了是脂肪存儲和代謝的場所外，還是一個重要的內分泌器官。脂肪組織能釋放多種細胞因子，對機體的糖代謝、脂代謝及能量代謝起著重要的調控作用。這些脂肪細胞因子通過多種途徑影響胰島素的生物學效應,參與胰島素抵抗(IR)。因此，在2型糖尿病、代謝綜合征(MS)及肥胖的發生、發展及發病機制中起著重要作用。

脂聯素(Adiponectin ，APN)是脂肪組織特異性分泌的脂肪細胞因子。研究顯示，血漿APN濃度與高血糖、高胰島素血癥及胰島素抵抗呈負性相關。多元線性回歸模型研究結果顯示，與APN相關的眾多因素中，腰臀比(WHR)、M-rate(胰島素刺激葡萄糖攝取率)和空腹胰島素水平是血漿APN的獨立影響因素[1]。因此可以看出，與血糖、體脂含量比較，胰島素的敏感性及空腹胰島素濃度與血漿APN的關系則更為密切。俞利紅[2]研究顯示葡萄糖濃度變化不是影響3T3-L1細胞APN mRNA表達的主要因素。本研究顯示隨著不同濃度葡萄糖作用3T3-L1細胞24h，APN mRNA的表達呈遞減，且各濃度間均有統計學差異。因此，血糖是否直接影響APN仍有待進一步研究。

IL-6是具有多種生物活性的細胞因子，它是由人IL-6基因所編碼的一種生物活性的糖蛋白。IL-6主要是由單核-巨噬細胞、T淋巴細胞和纖維母細胞合成，脂肪和肌肉組織能產生少量IL-6。IL-6與內分泌激素、神經遞質及某些效應物質等組成重要的網絡系統，參與機體的各種病理生理過程，尤其廣泛而精細地調節胰島β細胞的分化、生長和分泌功能[3]。高血糖促進IL-6的生成，且IL-6的濃度與血糖濃度呈正相關。抗氧化劑谷胱甘肽阻止高血糖誘發的血漿細胞因子的升高，說明炎性因子的釋放可能與高血糖誘發的氧化應激有關[4]。

Vaspin是一種脂肪細胞因子，由Hida等利用差異篩選基因方法，在腹型肥胖2型糖尿病動物模型OLETF大鼠的內臟脂肪組織中分離到一種新基因OL-64[5]，屬于絲氨酸蛋白酶抑制劑家族成員，具有胰島素增敏作用。研究發現Vaspin表達受多種因素的影響，如性別、年齡、飲食、運動，藥物及激素等。并與肥胖、2型糖尿病、多囊卵巢綜合征、心血管疾病和非酒精性脂肪肝等疾病有密切的關系。Tan等[6]研究發現,人體網膜脂肪組織Vaspin mRNA 表達和血清Vaspin水平均與血糖水平呈顯著正相關。Gulcelik NE等[7]發現在糖尿病患者中，血清Vaspin水平與HbA1c正相關，與胰島素水平負相關。本研究顯示Vaspin的表達隨葡萄糖濃度的升高而升高，但更高濃度的葡萄糖70mmol/L與40mmol/L間無統計學差異，提示在一定范圍內，血糖的升高可以促進Vaspin表達。

[1] Mathias F,Johannes K，Susanne N，etal．Adiponectin gene expresion is inhibited by B-adrenergic stimulation via protein Kinase A in 3T3-L1 adipocyte[J]．FEBS Letters，2001，507：142．

[2] 俞利紅，谷 衛. 不同葡萄糖濃度對3T3-L1細胞脂聯素mRNA表達的影響[J].浙江醫學，2005,27(12)：901-903.

[3] Miesinger M Y,Serge H,Stefan W,etal. Development of an IL-6 inhibitor based on the functional analysis of murine IL-6 Ra[J].Chem and Biol,2009,16(7):783-794.

[4] Goyal R,Singhai M,Faizy A F. Glutathione peroxidase activity in obese and nonobese diabetic patients and role of hyperglycemia in oxidative stress[J]. Midlife Health,2011,2(2):72-76.

[5] Hida K, Wada J , Zhang H ,etal. Identification of genes specifically expressed in the accumulated visceral adipose tissue of OLETF rats[J]. J Lipid Res , 2000 , 41 : 1615-1622.

[6] Tan BK, Heutling D, Chen J,etal. Metformin decreases the adipokine vaspin in overweight women with polycystic ovary syndrome concomitant with improvement in insulin sensitivity and a decrease in insulin resistance[J]. Diabetes,2008,57: 1501-1507.

[7] Gulcelik NE, Karakaya J, Gedik A,etal. Serum vaspin levels in type 2 diabetic women in relation to microvascular complications[J].Eur J Endocrinol,2009,160:65-70.

(收稿：2014-12-02)

*陜西省自然科學基礎研究計劃資助項目(2013JM4048)

葡萄糖濃度 3T3-L1細胞 Vaspin IL-1 脂聯素

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000-7377.2015.03.006

▲西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科

△通訊作者