腸侵襲性大腸桿菌DPO-PCR檢測方法的建立與應用

李丹丹，徐義剛，邱索平，王 昱，高會江，高慎陽

腸侵襲性大腸桿菌DPO-PCR檢測方法的建立與應用

李丹丹1，徐義剛2，邱索平3，王 昱4，高會江5，高慎陽6

目的 為建立腸侵襲性大腸桿菌(EIEC)的DPO-PCR快速檢測方法。方法 本研究以EIECipaH基因為靶基因設計了一對雙啟動寡核苷酸(DPO)引物，建立了EIEC DPO-PCR檢測方法。結果 退火溫度范圍在47℃～67℃內都能有效地擴增出目的基因，表明該檢測方法對退火溫度不敏感；該DPO引物僅與EIEC的擴增反應呈陽性，而與其他菌株無非特異性擴增反應，表明該方法特異性強；該方法的靈敏度為1.17×102cfu/mL。利用該檢測方法對采集的230份樣品進行檢測，共計檢出3份EIEC陽性樣品，與國標法(GB 4789.6-2003)檢測結果一致，顯示了良好的實用性。結論 該DPO-PCR 方法設計簡單、特異性強，具有良好的實用性。

腸侵襲性大腸桿菌；ipaH基因；DPO-PCR

腸侵襲性大腸桿菌(EnteroinvasiveE.coli, EIEC) 是致瀉性大腸桿菌中的一種致病類型，能夠引起人和動物胃腸感染性疾病的重要病原菌[1-3]，是一種重要的人畜共患病致病菌，此外EIEC還是國際公認的食物中毒病原菌，其引發(fā)的食源性疾病已成為當前全球面臨的公共衛(wèi)生問題之一[4-6]。因此，建立快速并且準確的檢測方法對防止EIEC的感染和提高EIEC的檢測效率具有重要意義。

雙啟動寡核苷酸引物(dual-priming oligonucleotide，DPO)設計簡單，不需要對退火溫度進行優(yōu)化及對引物進行篩選，簡化了常規(guī)PCR方法引物設計的步驟[7-10]；另外，DPO引物比常規(guī)PCR引物的特異性更強，堿基錯配發(fā)生3個或以上，擴增就會停止[11-12]，所以檢測結果要比常規(guī)PCR方法檢測結果更為精確。本研究利用該技術，建立了EIEC DPO-PCR快速檢測方法，為有效檢測EIEC提供技術支持。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及臨床樣品 空腸彎曲菌、腸出血性大腸埃希菌O157∶H7、單核細胞增生李斯特菌、沙門氏菌、變形桿菌、阪崎腸桿菌、粘質沙雷菌、大腸埃希菌、志賀菌、金黃色葡萄球菌、產(chǎn)腸毒素大腸桿菌、小腸結腸炎耶爾森氏菌、副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌、腸致病性大腸桿菌和腸侵襲性大腸桿菌等標準菌株購自于美國典型菌種保藏中心；腸侵襲性大腸桿菌分離株由本中心實驗室分離保存。230份臨床樣品采自畜禽飼養(yǎng)場和市場流通食品，包括牛肉、雞肉、豬肉、生牛奶、蔬菜、水果、牛肉制品、豬肉制品及牛奶制品等。

1.1.2 主要試劑 細菌培養(yǎng)基和增菌培養(yǎng)基BPW均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；細菌基因組DNA抽提試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司；TaqDNA聚合酶、dNTP、MgCl2均購自寶生物工程大連有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 根據(jù)GenBank 公布的EIECipaH基因序列(JQ638638.1) 中的保守序列，設計常規(guī)引物和DPO引物各一對，擴增片段大小均約為210 bp，兩對引物均由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

常規(guī)引物基因序列：

ipaH-CGF 5′-TTTCGATAATGATACCGGCGCTCTGCTCTCCCTG-3′

ipaH-CGR 5′-GTCACTCCCGACACGCCATAGAAACGCATTTCC-3′

DPO引物基因序列：

ipaH-DPOF 5′-TTTCGATAATGATACCGGCGCIIIIITCTCCCTG-3′

ipaH-DPOR 5′-GTCACTCCCGACACGCCATIIIIICGCATTTCC-3′

1.2.2 DNA模板的制備 將1.1.1節(jié)中的菌株分別接種到5 mL增菌培養(yǎng)基BPW中，增菌培養(yǎng)12 h后，取1 mL菌液按照試劑盒說明書提取細菌基因組DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩ＥR床樣品的檢測采用煮沸法提取細菌DNA。

1.2.3 DPO-PCR反應條件的優(yōu)化及電泳分析 對DPO-PCR反應體系中的各項反應參數(shù)和循環(huán)參數(shù)進行優(yōu)化，篩選出DPO-PCR反應中最佳反應模式。

1.2.4 DPO-PCR退火溫度不敏感性檢測 將退火溫度范圍設為47 ℃～67 ℃，進行DPO-PCR和常規(guī)PCR擴增試驗，產(chǎn)物于1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.2.5 DPO-PCR特異性檢測 利用建立的DPO-PCR檢測方法對1.1.1節(jié)中的菌株進行擴增，產(chǎn)物于1.0 %瓊脂糖凝膠電泳分析，驗證方法的特異性。

1.2.6 DPO-PCR靈敏性檢測 提取EIEC基因組DNA并測定濃度，10倍倍比稀釋DNA，原液至10-1～10-6，根據(jù)試劑盒提取每級稀釋度細菌DNA，各取2 μL作為模板進行DPO-PCR擴增。

1.2.7 DPO-PCR檢測方法的初步應用 將采集來的230份臨床樣品(25份牛肉、30份雞肉、25份豬肉、20份生牛奶、40份蔬菜、35份水果、15份牛肉制品、20份豬肉制品、20份牛奶制品)經(jīng)過處理勻漿后，均用營養(yǎng)肉湯增菌培養(yǎng)6 h，增菌液煮沸法提取DNA 并進行DPO-PCR 擴增，所得檢測結果用國標法(GB 4789.6-2003)進行復檢，以驗證所建立的DPO-PCR方法的可靠性。

2 結 果

2.1 EIEC DPO-PCR檢測方法的確定 通過對DPO-PCR反應體系中各個反應參數(shù)和循環(huán)參數(shù)的優(yōu)化，最終確定了EIEC最佳DPO-PCR反應模式。在20 μL反應體系中含有：10×PCR 緩沖液2.0 μL，MgCl2(25 mmol/L)2.0 μL，dNTP混合物(2.5 mmol/L)2.0 μL，引物(20 μmol/L)各0.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，DNA模板2.0 μL，去離子水補充至20 μL。反應程序：95 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，58 ℃ 50 s，72 ℃ 50 s，25個循環(huán)；72 ℃ 10 min。對瓊脂糖凝膠電泳分析獲得了約210 bp的目的片段。(圖1)。

M：DNA marker 100 ladder；1～2：EIECipaH基因；3：水對照.

M：DNA marker 100 ladder；1-2：EIECipaHgene；3：Negative control.

圖1 EIECipaH基因DPO-PCR擴增結果

Fig.1 DPO-PCR products of EIECipaHgene

2.2 DPO-PCR退火溫度不敏感性 退火溫度設定在47 ℃～67 ℃范圍內，由圖2左邊1-10可以看出，DPO-PCR均能有效擴增出EIECipaH基因，說明DPO-PCR退火溫度范圍較寬并且對退火溫度不敏感，而常規(guī)PCR擴增效果較差，存在最佳的退火溫度(圖2右邊1-10)。

2.3 DPO-PCR和常規(guī)PCR方法特異性擴增結果 利用建立的DPO-PCR檢測方法和常規(guī)PCR方法對1.1.1節(jié)中的菌株進行擴增，結果顯示：以ipaH基因為靶基因進行擴增，只有EIEC及其分離株擴增出約210 bp特異性條帶，其它菌株均未出現(xiàn)任何擴增條帶(圖3)，由圖中可以看出DPO-PCR方法的檢測特異性要比常規(guī)PCR方法檢測特異性要強。

M：DNA marker 100 Ladder；1-10：46.9 ℃，48.6 ℃，50.4 ℃，52.8 ℃，55.4 ℃，58.1 ℃，60.7 ℃，63.1 ℃，65.1 ℃，67 ℃；左邊(1-10)DPO-PCRipaH基因擴增結果；右邊(1-10)為常規(guī)PCRipaH擴增結果.

M：DNA Marker100 ladder；1-10：Annealing temperature of 46.9 ℃，48.6 ℃，50.4 ℃，52.8 ℃，55.4 ℃，58.1 ℃，60.7 ℃，63.1 ℃，65.1 ℃，67 ℃，respectively；DPO-PCR products ofipaHgene，left (1-10)；PCR products ofipaHgene，right (1-10).

圖2 退火溫度對PCR擴增的影響

Fig.2 Effect of annealing temperature on PCR amplification

A：DPO-PCR特異性試驗檢測結果；B：常規(guī)PCR特異性試驗檢測結果. M：DNA marker 100 ladder；1：EIEC；2：EIEC分離株；3：腸出血性大腸桿菌O157:H7；4：腸致病性大腸桿菌；5：產(chǎn)腸毒素大腸桿菌；6：粘質沙雷菌；7：沙門氏菌；8：金黃色葡萄球菌；9：志賀氏菌；10：空腸彎曲菌；11：小腸結腸炎耶爾森氏菌；12：單核細胞增生李斯特氏菌；13：變形桿菌；14：大腸埃希菌；15：阪崎腸桿菌；16：霍亂弧菌；17：創(chuàng)傷弧菌.

A：Specificity of DPO-PCR detection of EIEC；B：Specificity of PCR detection of EIEC；M：DNA marker 100 Ladder；1：EIEC；2：EIEC isolate；3：EscherichiacoliO157:H7；4：EnteropathogenicE.coli；5：EnterotoxigenicE.coli；6：Serratiamarcescens；7：Salmonella；8：Staphylococcusaureus；9：Shigella； 10：Campylobacterjejuni；11：Yersiniaenteroxolitica；12：Listeriamonocytogenes；13：Proteusbacillusvulgaris；14：Escherichiacoli；15：Enterobactersakazakii；16：Vibriocholerae；17：Vibriovulnificus.

圖3 EIEC DPO-PCR和PCR特異性試驗檢測結果

Fig.3 Specificity of DPO-PCR and PCR detection of EIEC

2.4 DPO-PCR方法檢測的靈敏度 10倍系列稀釋菌液按試劑盒提取每級稀釋度細菌DNA，按2.1優(yōu)化出的DPO-PCR反應條件進行檢測，結果表明在20 μL反應體系中，模板DNA加入2 μL，菌體濃度自1.17×108cfu/mL至1.17×102cfu/mL均可擴增出清晰條帶，菌體濃度為1.17×101未擴增出條帶(圖4)，表明本實驗建立的DPO-PCR方法檢測EIEC靈敏度為1.17×102cfu/mL。

M：DNA marker 100 Ladder；1-9：DPO-PCR擴增片段(菌液稀釋:依次為1.17×108-1.17×100cfu/mL.)

M：DNA marker 100 Ladder；1-9：amplified fragments of DPO-PCR (EIEC serially diluted from 1.17×108-1.17×100cfu/mL) .

圖4 EIEC菌液稀釋法DPO-PCR敏感度檢測結果

Fig.4 Sensitivity of DPO-PCR for detection of EIEC dilution

2.5 DPO-PCR檢測臨床樣品的實驗結果 利用建立的EIEC DPO-PCR檢測方法對采集的230份臨床樣品進行檢測，檢測出3份陽性樣本，所得檢測結果用國標法(GB 4789.6-2003)進行復檢，兩者檢測結果的一致率為100%，顯示該方法具有很好的可靠性。

3 討 論

目前，包括我國在內的絕大多數(shù)國家針對食源性致病菌的檢測仍主要依靠傳統(tǒng)細菌分離鑒定的方法，即首先利用選擇性培養(yǎng)基增菌，進而結合生化及血清學方法進行鑒定。傳統(tǒng)檢測方法存在檢測效率低、靈敏度低且耗時長、操作繁瑣等不足。通常情況下，鑒定一種細菌需要5～7 d，而針對一些生化特性復雜的細菌，如單增李斯特氏菌的檢測周期可長達20 d之久，嚴重影響了檢測鑒定的周期，很難適應現(xiàn)代化食品安全快速檢測的需要[13-14]。PCR技術具有快速、特異性強和靈敏度高等特點，是目前食源性致病菌檢測主要采用的檢測技術之一。在此基礎之上，又相繼發(fā)展了DNA探針技術、實時熒光PCR技術以及PCR結合變性高效液相色譜(DHPLC)技術等，雖然能夠滿足快速檢測的需求，但是對引物設計的要求很高，不僅需要對引物進行篩選，而且需要優(yōu)化退火溫度，增加了試驗操作步驟，費時又費力。在本研究中，引入了新型的DPO引物設計方法，建立了EIEC DPO-PCR檢測方法。

在本研究DPO-PCR退火溫度不敏感性實驗中，實驗結果顯示，退火溫度設定在47 ℃～67 ℃范圍內， DPO-PCR均能有效擴增出目標基因，說明DPO-PCR退火溫度范圍較寬并且對退火溫度不敏感，而常規(guī)PCR擴增結果則受退火溫度變化的影響較大，存在最佳退火溫度；在DPO-PCR特異性實驗中顯示，建立的DPO-PCR能夠準確地擴增出目標菌，其它菌株均未出現(xiàn)任何擴增條帶，而常規(guī)PCR擴增效果的特異性相對較差，表明所建立的EIEC DPO-PCR檢測方法特異性更強。臨床樣品檢測結果表明，利用建立的EIEC DPO-PCR 檢測方法能夠對實際樣品中的EIEC進行準確檢測，與國標法(GB 4789.6-2003)的檢測結果一致，具有良好的實用性。

本研究建立的DPO-PCR檢測方法，DPO引物設計簡單，簡化了常規(guī)PCR引物設計步驟，提高了檢測效率；并且由于DPO引物結構特殊具有比常規(guī)PCR引物更強的特異性，其檢測結果要比常規(guī)PCR的檢測結果更為準確，DPO-PCR檢測方法的建立為EIEC快速精準的檢測提供了新方法、新手段。

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Xu Yi-gang, Email: 108074182@qq.com

Development and application of DPO-PCR method for the detection of enteroinvasiveEscherichiacoli

LI Dan-dan1,XU Yi-gang2,QIU Suo-ping3,WANG Yu4,GAO Hui-jiang5,GAO Shen-yang6

(1.TechnicalCenterofHainanEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Haikou570311,China; 2.TechnicalCenterofHeilongjiangEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Harbin150001,China; 3.ConghuaEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Conghua510900,China; 4.TechnicalCenterofChongqingEntry-exitInspectionandQuarantineBureau,Chongqing404100,China; 5.LaboratoryofBovineGeneticsandBreeding,InstituteofAnimalScience,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Beijing100193,China; 6.DepartmentofAnimalHusbandryandVeterinaryMedicine,LiaoningMedicalUniversity,Jinzhou121001,China)

To establish a rapid assay for enteroinvasiveEscherichiacoli(EIEC) detection, a dual-priming oligonucleotide (DPO)-based PCR method was developed using the DPO primers targetingipaHgene of EIEC. Results showed that annealing temperature range at 47-67 ℃ can effectively amplify the target gene, primers were designed to show that the annealing temperature was not sensitive; in addition, the DPO-PCR method had high specificity due to special structure of DPO primers, thus no non-specific amplifications were produced in reaction; sensitivity of the method was 1.17×102cfu/mL. Furthermore, a total 3 positive samples for EIEC were detected from 230 clinical samples by the DPO-PCR method, which was in accordance with the testing result by GB/T 4789.6-2003 standard detection protocol. Therefore, the DPO-PCR method provides a novel, simple, rapid and sensitive detection method for EIEC infection. Keywords: EIEC;ipaHgene; DPO-PCR

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.009

海南省社會發(fā)展科技專項(2015SF29)；國家質檢總局科技項目(2013IK031,2013IK051, 2015IK089)；重慶市科技計劃項目(cstc2014yykfA80017)；海南省應用技術研究與開發(fā)專項項目(ZDXM20130025)；廣東檢驗檢疫局科技計劃項目(2011GDK44，2013GDK04)

徐義剛，Email:108074182@qq.com

1.海南出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，海口 570311； 2.黑龍江出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，哈爾濱 150001； 3.從化出入境檢驗檢疫局，從化 510900； 4.重慶出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心，重慶 404100； 5.中國農(nóng)業(yè)科學院北京畜牧獸醫(yī)研究所牛遺傳育種研究室，北京 100193； 6.遼寧醫(yī)學院畜牧獸醫(yī)學院，錦州 121001

Supported by the Projects of Social Development Science and Technology in Hainan Province (No. 2015SF29), the Technology Projects of the State Quality Inspection Administration (Nos. 2013IK031, 2013IK051 and 2015IK089), the Program of Science and Technology in Chongqing Municipal (No. cstc2014yykfA80017), the Special Projects of Applied Technology Research and Development in Hainan Province (No. ZDXM20130025), the Technology Projects of Guangdong Quality Inspection Administration (Nos. 2011GDK44 and 2013GDK04)

S852.61

A

1002-2694(2015)09-0826-05

2015-02-27；

2015-07-20