南京市2007-2013年H3N2流感HA分子進化特征分析

杜雪飛，丁 潔，喬夢凱，何 敏，石利民，雍 瑋，王 璇

南京市2007-2013年H3N2流感HA分子進化特征分析

杜雪飛，丁 潔，喬夢凱，何 敏，石利民，雍 瑋，王 璇

目的 分析2007—2013年南京市H3N2亞型流感HA基因分子學特征。方法 選擇2007—2013年59株H3N2亞型流感分離株，自行設計HA片段引物擴增分離毒株HA片段并測序, 利用DNAStar、MEGA等軟件對HA分子學特征進行分析；結果 發病時間存在明顯的季節性；進化樹分析2007—2013年分離株按年代分成3個分支；分離株較疫苗株及不同年份之間，發生多個抗原位點及受體結合位點氨基酸的替換；2007—2013年，我市H3N2亞型流感流行情況出現兩次波動，可能同基因的突變、重組有關。結論 抗原位點及受體結合位點氨基酸的突變，對流感的防控及疫苗的保護效果產生極大的挑戰。

H3N2；血凝素；進化

流感是由流感病毒引起的急性呼吸道傳染病，包括A、B、C 3種型別。甲型流感病毒常引起大范圍流感流行，其中H3N2亞型自1968年引起流感大流行以來一直是人群中流行的主要亞型之一。流感病毒以其表面抗原頻繁變異，每年引起新的流行。H3N2亞型流感病毒的血凝素基因(HA)編碼的血凝素是產生中和抗體的重要抗原，并在病毒的受體識別和復制中起重要作用。研究表明中和抗體所針對的抗原位點和受體結合位點(RBS)都位于HA蛋白分子的頭部重鏈區(HA1區)。HA1區序列的變異和流感的流行有密切關系，在流感的抗原性研究和疫苗選擇中有重要意義，研究其分子特征變異在流感的預防控制工作中十分重要。

1 實驗方法

哨點醫院收集流感樣病例(ILI)咽拭子， 4 ℃運送至實驗室，提取病毒RNA后，熒光定量PCR方法進行流感病毒型別鑒定。核酸檢測陽性標本，經MDCK 細胞培養擴增后，吸取上清液置于-80 ℃保存。應用Mag MAXTM-96 Viral Isolation Kit提取59株H3N2型流感病毒的RNA，SuperScript Ⅱ Reverse Transcriptase Kit將RNA逆轉錄為互補DNA(cDNA)。自行設計的HA引物PCR擴增HA基因片段，然后應用QIAGEN MinElute Gel Extraction Kit Protocol對PCR產物進行純化，BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit熒光標記，AB公司3500測序儀進行測序。

2 統計分析方法

登陸“中國疾病預防控制信息系統”，導出南京市2007年1月1日—2013年12月31日流感監測數據，應用SPSS軟件進行數據的統計分析。利用生物信息學軟件(DNAStar、Bioedit和MEGA)對所測的H3N2流感HA序列進行比對、拼接、構建進化樹，分析比較分離株HA蛋白特征性氨基酸位點的變化情況；通過BEAST v1.8.0 軟件進行BSP(Bayesian skyline plot)模型構建。

3 結 果

3.1 實驗室檢測結果 2007—2013年南京市流感網絡實驗室共監測流感樣病例標本14162份，監測陽性標本665份，平均檢測陽性率4.7%，其中季節性H3N2亞型356份，季節性H1N1亞型86份，H1N1(09pdm)亞型30份，B(Yamagata)型45份，B(Victoria)型148份。發病年齡以15歲以下年齡組居多，占到了42.1%，60歲以上組最少，占7.2%；發病人群中男、女分別占53.5%、46.5%；每年流感有2個發病高峰，第1個高峰是冬春季，第2個高峰是夏季。詳見圖1。

圖1 陽性病例數日期分布圖

3.2 進化樹 HA進化樹顯示：59株H3N2分離株及2007-2013年WHO推薦疫苗株按年份分成了3個分支，2007—2008年分離毒株位于Group 3，2007年分離毒株同疫苗株A/Wisconsin/672005 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為：97.8%～99.0%和97.0%～98.1%；2008年分離株同疫苗株A/Brisbane/10/2007 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為98.7%～99.3%和98.7%～99.1%；2009—2010年分離毒株位于Group 2，2009年分離株疫苗株A/Brisbane/10/2007 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為： 98.3%～98.9%和97.4%～98.3%，2010年分離毒株同疫苗株A/Peth/16/2009 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為:99.1%～99.3%和99.1%；2011-2013年分離株位于Group 1,2011分離株同疫苗株A/Peth/16/2009HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為：98.3%和97.8%；2012—2013年分離株同疫苗株A/Victoria/361/2011 HA基因核苷酸和氨基酸同源性分別為98.5%～99.3%和97.6%～98.7%，見圖2。

●：疫苗株；分支處的數字是Bootstrap 檢驗的可信度; 標尺值0.001 代表單位長度內核苷酸差異水平.

●--Vaccine virus; The numbers in each branch are the credibility of Bootstrap test. Ruler values 0.001 represent the level of number of difference.

圖2 HA基因進化樹示意圖

Fig.2 Phylogenetic tree for the HA gene

3.3 HA1氨基酸位點變化 A/Nanjing/F116/2007等5株2007年分離株同疫苗株A/Wisconsin/67/2005相比，發生G50E、D122N、S138A、K140I、Q156H、V186G、I223V， A/Nanjing/F31/2007、A/Nanjing/F35/2007同疫苗株相比發生了D122N、S138A、R142G、N144D、Q156H、K173N、 V186G、I223V；2008年分離株同疫苗株A/Brisbane/10/2007相比發生K173Q、R269K；2009年毒株同疫苗株A/Brisbane/10/2007相比發生E62K、N144K、K156N、N189K、V213A；2010年毒株同疫苗株A/Peth/16/2009相比P162S、S214I、I260M、R261Q；A/Nanjing/1481/2011同疫苗株A/Peth/16/2009相比發生33、45、48等11個位點的氨基酸變化；2012—2013年分離株同疫苗株A/Victoria/361/2011相比發生33、145、156、186、190、219、270等位點氨基酸的變化；2011—2013年毒株同2007—2010年相比，發生33、45、48、198、212、278、312等位點氨基酸的變化。具體氨基酸位點的變化，詳見表1。

表1 分離株同疫苗株相比氨基酸位點的變化

表1(續)

注：A、B、C、D、E為抗原位點，*為受體結合位點，黑色標記為疫苗株

Note: A, B, C, D, E are Antigenic sites,* represent Receptor-binding sites, Vaccine virus are marked by the black color.

3.4 進化動力學分析 BSP(The Bayesian skyline plot)模型可以來估計隨著時間的推移甲型流感病毒流行及病毒基因進化動力學的變化[1-2]。本研究通過BSP建立模型，對2007—2013年甲型H3N2流感流行及HA基因動態進化情況進行估算。如圖2所示，H3N2亞型流感有效的種群數量經歷了一段時間的平穩的時期，從2005年持續到2008年上半年；緊隨其后的是以一個顯著上升的速度擴散，一直延續到2009年上半年；然后出現顯著下降趨勢；在2011年下半年再次出現一個顯著上升的速度傳播并一直處于較高的水平，延續到2013年。

4 討 論

圖3 H3N2流感流行動態圖

本研究通過對2007—2013年南京市流感樣病例監測結果分析發現，我市流感流行具有明顯的季節性，每年有兩個流行高峰，冬春季及夏季，這同我國北方只存在冬春季一個流行高峰有一定的差異，同南方省份流感的流行高峰一致[3-4]；眾所周知冬天由于氣候等原因，容易導致流感的流行；夏季可能是人們廣泛使用空調，室內外溫差較大，容易引起流感的發生。發病年齡主要分布在15歲以下年齡段，同李偉等的研究結果一致[5]，符合流感發病的人群分布[6]。

已有的研究表明，流感病毒HA基因的抗原變異和分子遺傳進化最為活躍，且抗原變異主要發生在HA1區域[7-8]，該區域包括抗原位點、受體結合位點、潛在糖基化位點，因此該區域的氨基酸若發生變化，可能會對病毒的抗原特性、受體結合特性產生影響。H3N2亞型流感HA1蛋白的329個氨基酸位點，131個位于5個抗原決定簇(A、B、C、D、E)內或者附近[9]。本次研究結果發現，分離株與相對應的疫苗株相比，均發生多個抗原位點的變化，其中2011年同疫苗株相比發生10個位點的氨基酸的變化，9個是抗原位點；不同年份之間同樣存在抗原位點的氨基酸變化，從進化樹不同年份分離株的分支情況也能說明這一點。H3N2亞型流感病毒的受體結合位點由6個殘基(98Y、153W、190E、194L、183H、155T)組成口袋的表面，134-138殘基和224-228殘基構成了口袋的右壁和左壁。甲型流感病毒血凝素蛋白與唾液酸細胞受體的結合在病毒感染過程中起到至關重要的作用[10], 且血凝素蛋白的受體結合特性是流感病毒宿主限制性的重要的決定因素[11-12]。血凝素蛋白結合的特異性與其受體結合位點上的一些氨基酸性質密切相關, 若這些氨基酸發生改變，將會直接影響流感病毒的受體結合特性，從而逃避宿主攻擊[13]。本次研究結果發現兩個受體結合位點的氨基酸變化。以上抗原位點及受體結合位點的氨基酸變化一方面呈現出流感病毒的進化速度之快，另一方面這些位點的變化定會影響病毒的抗原性及受體結合特性，對病毒疫苗的保護效果及流感的防控提出了嚴峻的挑戰。

BSP結果顯示，自2007—2013年，我市H3N2亞型流感流行情況出現兩次波動，可能同基因的突變，重組有關。2009年出現一個下降趨勢，可能與當年H1N1(09pdm)亞型流感爆發流行有關，此時H1N1(09pdm)成為優勢毒株。2011年下半年又出現一個上升的趨勢。整體呈現2～3年一個波動周期，符合不同亞型流感交叉成為優勢毒株的規律。原因可能是前一年某亞型流感流行之后，人們體內普遍存在該亞型的抗體，再加上疫苗的接種，從而制約了該亞型流感的繼續流行。但隨著時間的推移，人們體內的抗體減少，流感病毒基因不斷的進化，又會引起新的一輪流行或爆發。

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Ding Jie, Email: yu2an2002@163.com

Molecular evolution characteristics of HA gene of H3N2 human influenza A viruses between 2007 and 2013 in Nanjing, Jiangsu Province, China

DU Xue-fei,DING Jie,QIAO Meng-kai,HE Min,SHI Li-min,YONG Wei,WANG Xuan

(DepartmentofMicrobiology,NanjingMunicipalCenterforDiseaseControlandPrevention,Nanjing210003,China)

We conducted analysis on the molecular characteristics of haemagglutinin of influenza A (H3N2) from 2007 to 2013 in Nanjing. Influenza A virus were isolated and cultured in MDCK cells, and then PCR amplifications and sequencing of the HA genes were carried out. Data were analyzed by DNAStar, MEGA software. Results showed that the incidence of crowd were under 15 years old. The onset time showed obviously seasonal. The phylogenetic tree of isolates strains from 2007 to 2013 could be divided into three branches; there are some antigen sites and receptor binding sites of amino acid substitutions between isolate strains and vaccine strains; the difference also occurred between isolate strains in different years. There are two waves appear of influenza A (H3N2) virus infection during 2007 to 2013 in Nanjing city, maybe result from genetic mutation and recombination. In conclusions, the amino acid mutations of antigen sites and receptor binding sites could make great challenges for influenza prevention and control and the protection effect of vaccine.

H3N2; haemagglutinin; evolution

10.3969/j.issn.1002-2694.2015.09.013

丁潔，Email：yu2an2002@163.com

南京市疾病預防控制中心微生物檢驗科，南京 210009

Supported by the special Fund for the development of medical technology of Nanjing(No.YKK10129)

R373.1

A

1002-2694(2015)09-0845-05

2015-01-13；

2015-07-17

南京市醫學科技發展專項資金(No.YKK10129)