GenoType MTBDRplus快速檢測耐多藥結核分枝桿菌復合群臨床分離株效果評價

魏淑貞，林淑芳，林 建，趙 永，梁慶福，林勇明

GenoType MTBDRplus快速檢測耐多藥結核分枝桿菌復合群臨床分離株效果評價

魏淑貞，林淑芳，林 建，趙 永，梁慶福，林勇明

目的 評價GenoType MTBDRplus快速檢測耐多藥結核分枝桿菌復合群(multi-drug resistantMycobacteriumtuberculosis Complex,MDR-MTBC)臨床分離株的應用效能。方法 隨機抽取福建省30個耐藥監測點的129株MTBC包括全敏感菌株50株和79株MDR菌株，應用MTBDRplus 檢測，同時擴增MDR菌株的rpoB,katG,inhA基因進行測序比對，并將檢測結果與比例法藥敏結果比較分析。結果 129株MTBC經MTBDRplus檢測，Tub條帶均陽性(100%)，50株全敏感株的檢測結果與比例法藥敏結果完全一致。79株MDR菌株經MTBDRplus檢出67株(84.81%)MDR，10株(12.66%)單耐RFP，2株(2.53%)單耐INH。經測序，77株MDR菌株的rpoB基因檢測出突變，71株的katG和/或inhA檢測出突變。以比例法藥敏結果為金標準，MTBDRplus檢測RFP、INH耐藥性及MDR的敏感度分別為97.47%(77/79), 87.34%(69/79), 84.81%(67/79)，MTBDRplus檢測RFP、INH耐藥性及MDR的特異度均為100%(50/50),一致率分別為98.45%(127/129),92.25%(119/129)，90.70%(117/129)。結論 MTBDRplus是一種快速、準確、操作簡便的技術，具有很好的應用前景，適用于耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株的快速檢測，但靈敏度有待進一步提高。

結核分枝桿菌；耐多藥；線性探針；基因突變；快速診斷

耐藥結核病，尤其是耐多藥結核病(MDR-TB)是全球結核病控制的重大威脅。我國是全球27個耐多藥結核病高負擔國家之一[1]。據調查顯示肺結核病人中耐多藥率為8.32%，其中初治肺結核耐多藥率為5.7%，估算我國每年大約新發11萬例MDR-TB患者[2]。MDR-TB的快速診斷有助于減少MDR-TB流行傳播。結核分枝桿菌不同藥物的相關基因(rpoB,katG,inhA)突變位點與耐藥性有一定相關性，因此可以通過檢測各突變位點的DNA片段來判斷結核分枝桿菌耐藥情況。GenoType MTBDRplus(Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)試驗以探針試條為基礎，基于多重PCR原理，將PCR、反向雜交、顯色合為一體。對純培養物或抗酸桿菌涂片陽性的痰標本進行檢測，通過檢測ropB基因突變判定對RFP的耐藥性，檢測katG基因判定對INH的高水平耐藥，而檢測inhA基因的啟動子區域判定對INH的低水平耐藥，因此可以快速檢測MDR-TB。為了評價該試劑盒用于福建省臨床分離的耐多藥結核分枝桿菌的檢測效能，對129株結核分枝桿菌復合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTBC)包含79株MDR和50株全敏感菌株進行GenoType MTBDRplus檢測。所有MDR菌株經rpoB,katG,inhA基因測序，并將檢測結果與測序結果比對分析和評價。

1 材料與方法

1.1 菌株來源 本研究79株MDR和隨機抽取的50株全敏感株均收集于2010年7月至2011年6月在福建省30個耐藥監測點。分離的菌株均獲得患者知情同意，并且已按照WHO推薦的比例法[1]完成藥物敏感性試驗(drug susceptibility test,DST)。結核分枝桿菌標準株H37Rv由國家結核病參比實驗室提供。

1.2 提取DNA 取常規L-J培養基培養2-3周齡、生長良好的結核菌一菌環菌落溶于400 μLTE(PH8.0)中，在旋渦振蕩器上震蕩至塊狀固體菌落均勻溶于TE中，在95 ℃水浴15 min后，3 000 r/min離心5 min，取上清。

1.3 擴增rpoB,katG,inhA基因及測序檢測 從http://www.ncbi.nlm.nih.gov的Genebank中獲得結核分枝桿菌H37Rv的rpoB,katG,inhA基因序列。采用primer premier 5.0設計引物，引物序列見表1。PCR 反應體系為50 μL, 包括2ⅹTaq PCR Master Mix 25 μL、引物(10 μM)各2 μL, 模板5 μL，去離子水16 μL。PCR 擴增條件:94 ℃變性8 min;94 ℃ 30 s ,退火 30 s (退火溫度依引物而定，如表1)，72 ℃45 s,30個循環;再72 ℃延伸5 min。PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳驗證為單一的擴增條帶后，產物送上海生物工程公司測序。測序結果通過http://www.ncbi.nlm.nih.gov的BLAST與H37Rv 的相應基因序列進行比對分析。同時排除測序引起的誤差判斷測序結果。

表1 耐藥基因的擴增引物及產物長度

1.4 GenoType MTBDRplus 檢測 根據GenoType MTBDRplus assay試劑盒說明書進行操作。雜交與檢測是采用試劑盒的試劑，在一臺帶搖晃的半自動的TwinCubator(Hain Lifescience GmbH, Nehren, Germany)上根據廠家設定的步驟進行操作。先45 ℃雜交30 min,兩次漂洗，然后顯色，再清洗，最后將探針試條吸干粘貼在判讀表上。每個探針試條共有27個反應條帶:有5個質控帶，CC帶(標記物質控) 反映探針試條上標記物結合并與定位反應的有效性，AC帶( 擴增質控) 用于確認PCR擴增反應是否成功，3個基因位點質控帶(rpoB、katG和inhA)用于確認所檢測的相應基因位點反應的最佳敏感度。Tub帶用于確認結核分枝桿菌復合群，當Tub帶未出現就不能用本系統判讀結果。野生型探針的條帶標記有WT，突變探針的條帶標記有Mut。M 帶是color marker。當某一基因區所有的WT探針染色均為陽性，表示該基因區沒有發生可檢測的突變，試驗菌株對相應的藥物敏感。如果某1個基因區至少有1個野生型探針WT缺失或突變型探針Mut染色陽性，則表示試驗菌株對相應的藥物耐藥。rpoB野生型探針WT1 -WT8是針對熱點核心區;rpoB突變型探針(Mut1, Mut2A, Mut2B, Mut3)是分別檢測rpoB相應的密碼子突變(D516V, H526Y, H526D, S531L)。katG315密碼子野生型探針(WT);katG突變型探針(MUT1,MUT2)分別是檢測AGC-315-ACC(S315T1)和AGC-315-ACA(S315T2)。inhA野生型探針WT1檢測9-22,WT2檢測_1-12;inhA突變型探針Mut1,Mut2,Mut3A,Mut3B分別檢測_15C/T, _16A/G, _8T/C, and _8T/A。探針條帶結果判讀，如圖1。

注：Neg:陰性對照，Rv：H37Rv,中間為實驗菌株編號。

Note: Neg: Negative, Rv: H37Rv, others were tested strains

圖1 結核分枝桿菌GenoType MTBDRplus檢測結果

Fig.1 Detection patterns ofMycobacteriumtuberculosisby GenoType MTBDRplus

1.5 質量控制 每次GenoType MTBDRplus 檢測均有陽性對照H37Rv和陰性對照(水)進行質控。PCR測序與GenoType MTBDRplus檢測均在雙盲下操作。

1.6 數據整理與統計學分析 實驗數據用Excel進行整理，通過SPSS11.5進行統計學分析,運用χ2檢驗比較測序與MTBDRplus檢測結果之間的差異，P<0.05差異有統計學意義。

2 結 果

129株MTBC包括50株全敏感株及79株MDR經GenoType MTBDRplus檢測Tub條帶均陽性(100%)。50株全敏感株所有野生型探針均陽性，即MTBDRplus檢測結果與DST結果一致。79株MDR經MTBDRplus檢測出67株(84.81%)為MDR，10株(12.66%)單耐RFP，2株(2.53%)單耐INH。79株MDR菌株經測序，77株菌株的rpoB基因均檢測出突變，71株的katG和/或inhA檢測出突變，有2株經測序發現katG基因突變位于315之外，故MTBDRplus檢測顯示為INH敏感。

2.1 MTBDRplus檢測RFP耐藥性 79株MDR經檢測，rpoB基因區域出現至少1條野生型探針缺失或出現突變型探針的菌株有77株，占97.47%。有53株出現突變型探針(67.09%)，如表2所示，其中D516V 6株(7.60%)，H526Y 3株(1.27%)，H526D 5株(6.33%)，S531L 38株(48.10%)。有2株(2.53%)判定為RFP敏感，這兩株經測序，rpoB基因區未發現突變。

2.2 MTBDRplus檢測INH耐藥性 79株MDR經檢測，有69株(87.34%)能夠正確判出INH耐藥，如表3所示 ，這69株經測序發現katG315突變

表2 MTBDRplus檢測79株MDR菌株RFP耐藥性的結果與測序結果的比較

注：WT,野生型探針; mut, 突變型探針;r,耐藥;s,敏感; NM, 未突變; del, 缺失;△，缺失.

Note: WT, wild probe; mut, mutated probe; r, resistance;s, sensitive; NM, no mutation; del, deletion;△，dleltion.

表3 MTBDRplus檢測79株MDR菌株INH耐藥性的結果與測序結果的比較

注：WT,野生型探針; mut, 突變型探針;r,耐藥;s,敏感; NM, 未突變;△，缺失.

Note: WT, wild probe; mut, mutated probe;r, resistance;s, sensitive; NM, no mutation;△，dleltion.

或inhA基因突變，另有2株測序檢測出katG315密碼子之外的突變而MTBDRplus檢測顯示為陰性。64株katG基因區域出現315野生型探針缺失或出現突變型探針，即INH高水平耐藥占81.01%,其中58株(占73.42%)S315T1和1株S315T2，這59株突變型探針陽性的菌株經測序均檢測出315密碼子氨基酸改變。另測序結果為S315N的3株菌株和S315T的2株顯示為野生型探針缺失。有9株inhA基因區域出現野生型探針缺失或出現突變型探針，占11.39%。這9株inhA的突變均為C15T，其中4株在katG基因區域也出現突變型探針S315T1(AGC315ACC)，與測序結果完全一致。

2.3 MTBDRplus的檢測效能 若以傳統DST為金標準，MTBDRplus檢測RFP耐藥性的敏感度為97.47%(77/79), 檢測INH耐藥性的敏感度為87.34%(69/79), 檢測MDR的敏感度為84.81%(67/79)，MTBDRplus檢測RFP、INH耐藥性及MDR的特異度均為100%(50/50),一致率分別為98.45%(127/129),92.25%(119/129)和90.70%(117/129)。MTBDRplu檢測與測序方法檢測MDR菌株突變特征之間的差異經χ2檢驗，χ2=63.93，P<0.05，差異有統計學意義。

3 討 論

結果顯示 MTBDRplus能夠用于純培養物MTBC的RFP和INH耐藥性的快速檢測，具有高的敏感度，且操作簡便。MTBDRplus檢測RFP耐藥性的敏感度為97.47%，與國外報道[3]相一致,高于國內報道的88.48%[4]，這與本文采用結核分枝桿菌純培養物進行檢測有關。77株(占97.47%)rpoB野生型探針缺失或出現突變型探針，其中出現突變型探針的特征與對福建省MDR菌株rpoB基因的突變特征報道相符[5]。且在測序中均被檢測出。測序檢測出的rpoB基因核心區頻率低突變如L511P,L533P，S531W,H526C,H526L及聯合突變如E510H+H526R，L511P+D516A，D516G+N518D及del516-517，在MTBDRplus檢測時顯示為相應密碼子野生型缺失。本研究發現rpoB基因野生型探針WT8缺失的菌株發生突變為S531W或L533P，而關于rpoB基因533密碼子突變與RFP耐藥性的關系存在一定爭議，有報道533密碼子突變與RFP耐藥相關[6]，也有認為533密碼子突變與RPF耐藥無關[3]，本研究結果經測序核實，認為533密碼子突變與RFP耐藥有一定關系。另2株MTBDRplus檢測RFP敏感的菌株經測序未發現突變，經RFP耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(Xpert MTB/RIF)[7]檢測，也為RFP敏感,這種“假敏感”現象可能由于這兩株菌株rpoB基因突變發生在核心區之外，而測序和MTBDRplus及Xpert MTB/RIF只針對核心區域，故檢測不出突變；或存在其他的耐藥機制。

MTBDRplus檢測INH耐藥性的敏感度為87.34%,略高于國內報道的77.78%[5],略低于國外報道的92.0%[3]。本研究進一步表明MTBDRplus用于純培養物的RFP和INH耐藥性檢測的敏感度高于對涂陽痰標本的檢測。經MTBDRplus，本研究的79株MDR菌株katG主要以S315T(AGC315ACC )為主，占73.42%。另測序結果為S315N的3株菌株和S315T的2株顯示為野生型探針缺失。inhA基因突變主要是C15T,未檢出其他位置的突變。有4株在katG基因、inhA基因區域均出現突變型探針，經測序這4株菌株的這兩個基因均存在突變，進一步表明inhA基因突變常伴隨katG基因突變，對INH耐藥具有協同作用，這與文獻報道相仿[8-10]。MTBDRplus檢測MDR的敏感度為84.81%，主要受限于該方法檢測INH耐藥性的敏感度，若能提高檢測INH耐藥性敏感度，則檢測MDR敏感度也將進一步提高。MTBDRplus與測序方法檢測MDR菌株突變特征之間的差異(χ2檢驗，P<0.05)具有統計學意義。表明測序方法檢測MDR菌株的突變能力高于MTBDRplus，同時有些MDR菌株測序及MTBDRplus檢測結果均為敏感，主要與測序和MTBDRplus檢測探針只針對核心區域或突變率較高的位點有關。

MTBDRplus檢測耐藥性耗時比傳統分離培養和DST耗時大大縮短，僅需5～6 h,可早期發現患者，能直接用于檢測抗酸涂陽痰標本[4,11]，使患者耐藥性檢測成本明顯低于傳統的DST[11]。本研究79株MDR-MTBC和50株全敏感菌株均來自福建省30個耐藥監測點，樣本代表性良好。據報道該快速診斷技術可以用于地市級MDR-TB檢測[4]，從本結果來看MTBDRplus檢測技術非常適合用于MDR-TB快速檢測。因MTBDRplus僅檢測RFP和INH兩種藥物，故不能取代傳統培養和DST。這是因為痰培養和一線藥敏極其重要，它是進一步做其他藥物藥敏試驗的基礎；MTBDRplus檢測RFP和INH耐藥性僅針對于核心突變或突變率高的位點，有些被診斷為敏感的菌株仍然需要做RFP和INH耐藥性核實確認；再者福建省非結核分枝桿菌(NTM)的檢出率較高[12]，標本可能為NTM或混合性感染。

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Evaluation on the performance of GenoType MTBDRplus assay for rapid diagnosis MDRMycobacteriumtuberculosisisolates in Fujian Province, China

WEI Shu-zhen,LIN Shu-fang,ZHAO Yong,LIN Jin,LIANG Qing-fu,LIN Yong-ming

(FujianCenterforDiseaseControlandPrevention,Fuzhou350001,China)

We conducted evaluation on the performance of GenoType MTBDRplus assay for rapid detecting multi-drug resistantMycobacteriumtuberculosisComplex (MDR-MTBC) isolates in Fujian Province, China. The strains including 79 MDR and 50 pan-susceptible were chosen randomly from 30 survey sites. The MTBDRplus was applied to detect RFP and INH resistance of the strains, and the results were compared with the result of sequencing data aboutrpoB,katGandinhAmutation. The Tub control were positive in all strains (100%), the results showed the patterns of 50 pan-susceptible strains were concordant with DST. By the assay, 67 (84.81%) MDR strains of 79 were correctly identified, 10 strains (12.66%) were mono resistant to RFP, and 2 were mono resistant to INH. The mutation inrpoBgene of 77 MDR strains and inkatG/inhAgene of 71 MDR strains was detected by sequencing. Provided that conventional DST is the "gold standard," the sensitivity of the MTBDR assay were 97.47% for RFP resistance detection, 87.34% for INH resistance detection and 84.81% for MDR detection. And the assay had the specificity of 100% for the detection of RFP, INH and MDR. The concordance rate of detection for RFP, INH and MDR was 98.45% (127/129), 92.25% (119/129), 90.70% (117/129), respectively. Thus, the new GenoType MTBDRplus assay represents a rapid, reliable and easy tool for the detection of INH and RFP resistance in clinical strains of MDR in Fujian Province and the sensitivity needs to be improved.

Mycobacteriumtuberculosis; MDR; line probe; gene mutation; rapid diagnosis

梁慶福，Email:liangqingfu@hotmail.com; 林勇明，Email:lym3428425@126.com

福建省疾病預防控制中心，福州 350001

Supported by the Fujian Provincial Medical Innovation Project (No. 2014-CXB-8) and the Fujian Provincial Science Foundation Project (No. 2010J01116) Corresponding authors: Liang Qing-fu, Email: liangqingfu@hotmail.com; Lin Yong-ming, Email: lym3428425@126.com

R378

A

1002-2694(2015)08-0728-05

2015-02-09；

2015-05-31

福建省醫學創新課題(No.2014-CXB-8)和福建省自然科學基金課題(No.2010J01116)聯合資助