血液病毒核酸檢測單獨陽性標本研究

田耘博，黃霞，秦偉斐，李維，毛偉，廖紅文，段恒英，何濤

(重慶市血液中心，重慶 400015)

獻血樣本的病毒核酸檢測 （nucleic acid testing，NAT）可有效地降低輸血相關傳染病病毒的傳播風險，在采供血機構正廣泛普及[1]。運用NAT不僅能檢測出很多在酶聯免疫吸附檢測 （enzymelinked immuno sorbent assay，ELISA）窗口期（window period，WP） 的乙型肝炎病毒 （HBV）、 艾滋病毒（HIV）和丙型肝炎病毒（HCV）感染，還能避免因病毒變異，免疫靜默性感染等導致的常規ELISA的漏檢[2]。對于體現NAT優勢的NAT單獨陽性獻血樣本，其真正的陽性率和不同NAT檢測系統結果的差異，我們進行了一些研究和探討。

1 材料與方法

1.1 標本來源 重慶市血液中心2011年3月-12月經體檢和血液快檢合格的無償獻血者血液標本47004例。分別用含分離膠的 “非可替”抗凝真空NAT專用采血管（含EDTA-K2噴霧干粉）采集6~8 ml全血用于NAT檢測；“BD”抗凝真空采血管（含EDTA-K2噴霧干粉）采集4~5ml全血用于ELISA檢測。采集后的標本管置于4℃保存，在采集4~6h內1800g離心10min，檢測前置于4℃保存。

1.2 主要儀器 RSP150/200型全自動加樣儀 （瑞士TECA公司）和FAME 2420/30全自動酶免分析儀（瑞士HAMILTON公司）、Procleix TIGRIS全自動核酸檢測分析系統 （美國諾華公司）及配套的PRI(試劑準備溫育器，美國Chiron公司)、MAGCOR核酸全自動提取儀（臺灣MAGCORE公司）、ABI7500熒光定量PCR儀（美國ABI公司）、RT3100洗板機（深圳雷杜公司）、EXL808酶標儀 （美國BIO-TEK公司）、L535R離心機（湖南湘儀公司）。

1.3 主要試劑 ⑴ELISA檢測試劑：HBsAg為乙型肝炎病毒表面抗原診斷試劑盒 （北京萬泰，批號：350277、350279；法國生物梅里埃，批號： BM4732、BM3328）、丙型肝炎病毒抗體診斷試劑盒（上?？迫A，批號：201105432、201105443；美國強生，批號：GH5809、GH5897）、HIV（1+2）P24 抗原及抗體診斷試劑盒 （法國生物梅里埃，批號：BV32876、HG33287）、HIV抗體診斷試劑盒（上?？迫A，批號：201101234、201103213）。⑵核酸檢測試劑：Procleix Ultro核酸檢測試劑盒 （美國諾華公司，批號：613254），該試劑可同時定性檢測人類血漿中的HIV-1 RNA、HCV RNA和HBV DNA，試劑盒內含有配套的Procleix HIV-1/HBV/HCV鑒別試劑；血液核酸篩查試劑盒 （上?？迫A公司，批號：20119325）。⑶乙肝血清學標志物檢測試劑和HB-sAg中和確證試劑：乙型肝炎診斷試劑盒（HBsAb、HBeAg、HBeAb 和 HBcAb）（上 海 科 華 ， 批 號 ：201103025、201102016、201105109、20110615）、Hepanostika HBsAg Ultra Confirmatory中和確證試劑盒（法國生物梅里埃，批號：B12NA）。

1.4 檢測過程

1.4.1 ELISA 對47004例無償獻血標本的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV及HIV P24Ag用2種ELISA試劑在FAME 2420/30上平行檢測，相關的操作嚴格按照試劑盒說明書和儀器說明書進行。當標本OD值/Cut off值（S/CO值）≥0.8判為反應性，標本S/CO值<0.8時，判定為無反應性。2種試劑均為反應性判定為ELISA檢測陽性，均為無反應性判定為ELISA陰性；單試劑反應性用同一試劑做雙孔復試，雙孔復試中有1孔及以上為反應性則判定為ELISA檢測陽性，雙孔復試均為無反應性判定為ELISA陰性。

1.4.2 NAT所有標本均采用單人份檢測。⑴TMA檢測：對47007例獻血標本進行ELISA的同時，進行 NAT。 用諾華 Procleix Ultro Assay的 HIV-1、HBV和HCV三項聯合核酸檢測試劑，基于轉錄介導 的 擴 增 （transcription mediated amplification，TMA）技術在Procleix TIGRIS上進行檢測。對聯檢反應性的標本，再用Procleix HIV-1/HBV/HCV Discriminatory Assay鑒別試劑在同一臺儀器上進行鑒別檢測，以確定具體的感染病毒類型。⑵交替NAT：對TMA試劑聯檢陽性而ELISA檢測陰性的標本，采用科華血液核酸篩查試劑盒利用聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)技術進行交替NAT，MAGCORE全自動核酸提取系統進行核酸提取，用科華的血液核酸篩查試劑在ABI7500熒光定量PCR儀上進行擴增檢測，所有操作均按相應的儀器和試劑盒說明書進行。

1.4.3 乙肝兩對半檢測和HBsAg中和確證檢測 對NAT聯檢陽性的標本用科華乙型肝炎診斷試劑盒，采用手工法在洗板機和酶標儀上進行檢測。按相應的儀器和試劑盒說明操作，由酶標儀配套軟件判定結果。判定標準：當標本S/CO值≥1判為陽性，標本S/CO值<1時，判定為陰性。選取余量足夠，狀態較好的部分剩余標本，做HBsAg中和確證檢測，按相應的儀器和試劑盒說明書操作，由HBsAg確證試劑說明書的方法計算并判定結果。

1.4.4 數據統計和分析 將NAT、ELISA、乙肝血清學標志物檢測和HBsAg中和確證檢測的結果數據輸入電腦，采用Microsoft Excel 2003軟件進行匯總和分類統計，對2種NAT檢測方法的結果和乙肝血清學標志物檢測的陽性標本數構成比在SAS 8.0軟件上采用配對四格表資料的χ2檢驗進行統計學比較；對所含例數較少的項目間比較，采用Fisher確切概率法檢驗。

2 結果

2.1 常規NAT總體情況 在47007例獻血標本中，檢測出ELISA陰性而NAT(TMA)聯檢陽性的標本108例。通過對這108例標本進行NAT(TMA)鑒別檢測，檢出HBV DNA陽性40例（鑒別陽性率37.0%），未檢出HIV RNA陽性和HCV RNA陽性者。

2.2 聯檢陽性鑒別陽性標本的分析檢測 在鑒別為HBV的40例標本中選出了余量足的13例，進行PCR、HBsAg中和抗體確證實驗和乙肝血清學標志物ELISA檢測，其結果見表1。PCR能檢測出其中的9例含HBV DNA （檢測陽性重合率為69.2%），HBsAg結果均為不確定；乙肝血清學標志物中，均沒有抗原存在，不同種類抗體陽性組合呈多樣性。

2.3 聯檢陽性鑒別陰性標本的分析檢測 對NAT(TMA)聯檢陽性但鑒別陰性的68例標本，選出余量足的30例，進行PCR、HBsAg中和抗體確證實驗和乙肝血清學標志物檢測，其結果見表2。在NAT(TMA)聯檢陽性但鑒別陰性的68例標本中，PCR發現了2例含HBV DNA（檢測陰性重合率為93.3%）；HBsAg結果均為不確定；乙肝血清學標志物中，均沒有抗原存在，不同種類抗體陽性組合呈多樣性。

2.4 2種NAT方法的結果對比 選取的43例NAT（TMA）聯檢單陽性標本，包括NAT(TMA)鑒別陽性13例、陰性30例，均進行了PCR和乙肝血清學標志物檢測，TMA和PCR的檢測結果既有相同疊加，也有各自的單獨反應性。TMA鑒別檢測陽性和陰性標本之間，各項乙肝血清學標志物陽性率各不相同，具體結果見表3。

3 討論

NAT的優勢在于檢測出以往僅用ELISA不能發現的病毒感染[1]。在本項研究中共發現了108例ELISA陰性而NAT聯檢陽性的獻血標本，對其進行NAT鑒別檢測出37.0%(40/108)為HBV，其余63.0%(68/108)為陰性。本研究中HBV DNA的檢出率為0.85‰（40/47004），不僅與上海[3]、南京[4]等地區的報道基本相同，也與印度[5]報道的0.88‰接近。HBV在我國乃至世界范圍內依然是一個較大的公共衛生問題[6]，HBsAg檢測作為一種常規篩查手段，在采供血機構的應用有力地提高了血液安全性[7]。本研究對43例ELISA陰性而NAT聯檢陽的標本進行HBsAg中和確證實驗，沒有發現確證陽性，說明現有的HBsAg檢測特異性較好，但HBsAg陰性的血液仍然可能發生HBV的傳染[8]。HBsAg陰性血液導致輸血傳播HBV的殘余風險，一般發生在血清學轉化前的窗口期或者感染末期[6]。對于HBV，NAT不僅能有效的發現處于HBsAg ELISA的WP獻血者[9]，還能檢測出隱匿性乙肝感染（occult HBV infection，OBI）獻血者[10，11]。

表1 2種NAT結果為HBV的標本乙肝血清學標志物和HBsAg確證結果比較

表2 TMA鑒別陰性標本的PCR結果及乙肝血清學標志物和HBsAg確證結果比較

表3 TMA聯檢單獨陽性標本的鑒別結果和PCR結果及乙肝血清學標志物綜合比較

一般將HBV DNA持續存在，而HBsAg為陰性的HBV感染稱為OBI[12]，OBI的發病機理尚不明確，但大多認為是感染者和諸多病毒因子的聯合作用，將HBV的病毒復制抑制在一個可控的低水平[13]。OBI在HBV感染的整個過程中，HBsAg都呈陰性[14]。OBI中的HBsAb的陽性率約為50.0%[3]，在本研究中TMA鑒別陽性和陰性標本中HBsAb的陽性率都在50.0%左右，之間并無顯著性統計學差異（P>0.05）。很多情況下，OBI的唯一血清標志物就是HBcAb[15]，包括鑒別陽性和陰性在內的43個聯檢單陽性標本，其乙肝血清學標志物中HBcAb陽性比例都最高，分別為84.6%和73.3%且差異無統計學意義（P>0.05）。NAT聯檢和鑒別均為陽性的13例標本中有85.0%（11例）為HBcAb陽性，因此該類型標本大部分為OBI。

在TMA聯檢單獨陽性的標本中，出現了63.0%（30例）的鑒別檢測陰性，其中用PCR發現2例HBV，可認為是真陽性[16]。這種聯檢和鑒別檢測結果不一致的原因，現在還不完全清楚，可能和檢測低載量病毒的隨機取樣差異和鑒別檢測的靈敏度有關。當血液中病毒載量處于很低水平時，可能出現DNA和HBsAb等標志物檢測的不確定性，也就是這一次能檢測到，而下一次可能檢測不到[2]，鑒別檢測陰性的標本在聯檢時所呈的反應性未必是假陽性[16]。因此NAT鑒別陰性的這部分標本中，可能有HBV ELISA的WP或OBI。

本研究還發現TMA和PCR這2種病毒核酸檢測體系對NAT單陽性的標本檢測能力沒有顯著性的差別（P>0.05），均能較好地勝任日常的檢測工作[17]。但究竟用哪一種能更好的檢測OBI，現在尚不清楚[18]。但它們有各自單獨發現的HBV DNA，這2種NAT方法結果不一致的主要原因可能是OBI者的血液中含低水平的HBV DNA，而NAT檢測假陰性的原因就在于病毒在血漿中含量極少，呈泊松分布型的不均勻分布[13]。我國獻血者HBV DNA單獨陽性中，大多（近80.0%）為OBI，且這些血液中的HBV DNA載量都較低，約在178IU/ml以內，中位數為14IU/ml[19]，而本研究中采用的Procleix Ultro檢測HBV DNA靈敏度為30IU/ml[20]，加上病毒顆粒在血漿中呈不均勻分布導致每次檢測的取樣誤差造成了檢測結果的不確定[4]。

對HBV血清學標志物5項中不同反應性項目的組合，其不同的結果有不同的解釋[21]。可一旦伴隨HBV DNA的檢出就表示處于病毒攜帶狀態。因此對獻血標本進行NAT，可有效地減少窗口期、OBI導致的輸血傳播HBV[22]。本研究發現NAT聯檢單獨陽性的標本中有37.0%鑒別為HBV，余下的63.0%鑒別陰性中存在少量的假陰性標本[23]。NAT的單陽性標本無論鑒別反應性還是陰性，其乙肝血清學標志物中的HBcAb陽性比例最高，OBI的可能性也就最大，由于OBI的HBV DNA載量低，導致了TMA和PCR方法的NAT結果具有一定的差異。

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