miR-134調控人肺腺癌細胞順鉑耐藥*

俞萬鈞，汪一萍，李紀鵬，王華英△(寧波市鄞州人民醫院呼吸與重癥醫學科，檢驗科，浙江寧波35040)

miR-134調控人肺腺癌細胞順鉑耐藥*

俞萬鈞1，汪一萍2，李紀鵬2，王華英1△
(寧波市鄞州人民醫院1呼吸與重癥醫學科，2檢驗科，浙江寧波315040)

［摘要］目的:探討微小RNA-134( miR-134)在人肺腺癌細胞順鉑耐藥中的作用及機制。方法:采用miRNA芯片篩選A549/CDDP和A549細胞差異表達miRNA，應用real-time PCR驗證miR-134的表達。將miR-134模擬物和抑制物分別轉染A549/CDDP和A549細胞，應用MTT法檢測肺癌細胞對順鉑的敏感性。Western blot技術檢測miR-134對叉頭框蛋白M1( FOXM1)和多藥耐藥相關蛋白1( MRP1)表達的影響。結果: miRNA芯片顯示，13 種miRNAs在A549/CDDP和A549細胞中呈顯著表達;其中，miR-134下調最顯著。miR-134模擬物轉染組A549/ CDDP細胞對順鉑的敏感性較陰性對照組顯著提高( P＜0. 01)，而miR-134抑制物轉染組A549細胞對順鉑的敏感性較陰性對照組顯著降低( P＜0. 01)。FOXM1 siRNA能夠有效抑制FOXM1蛋白表達，si-FOXM1轉染組A549/CDDP細胞對順鉑的敏感性較陰性對照組顯著提高( P＜0. 01)。此外，Western blot結果顯示miR-134能夠抑制MRP1蛋白表達。結論: miR-134能夠增加肺腺癌細胞對順鉑的敏感性，其機制可能與調控FOXM1和MRP1表達有關。

［關鍵詞］微小RNA-134;肺腺癌;順鉑耐藥;叉頭框蛋白M1;多藥耐藥相關蛋白1

微小RNA( microRNA，miRNA)是一類非編碼小分子RNA，普遍存在于原核和真核生物中。越來越多的研究表明miRNA與人類多種腫瘤的發生發展、侵襲轉移及化療耐藥密切相關［1-3］。miR-134基因定位于14q32，發揮抑癌基因功能，多在腫瘤中表達下調［4-6］。但是miR-134在腫瘤細胞化療耐藥中的作用及可能的調節機制尚不清楚。本研究中，我們通過miRNA芯片篩選了肺癌順鉑( cisplatin，CDDP)耐藥細胞A549/CDDP和A549親本細胞間的表達差異，并對差異表達的miR-134在肺癌順鉑耐藥中的作用及機制進行了探討，以期為臨床個體化治療肺腺癌提供有價值的化療耐藥分子標記物，并為逆轉其化療耐藥尋找新的分子治療靶點。

材料和方法

1細胞和主要試劑

人肺腺癌細胞系A549和順鉑耐藥細胞系A549/CDDP均為本室保存。

RPMI-1640培養基和胎牛血清為Gibco產品; Lipofectamine 2000轉染試劑和Trizol試劑為Invitrogen產品; miR-134模擬物( miR-134)及其陰性對照( negative control，NC)、miR-134抑制物( anti-miR-134)及其陰性對照( anti-NC)和叉頭框蛋白M1( forkhead box protein M1，FOXM1)干擾RNA( si-FOXM1)均為上海吉瑪公司產品;順鉑和MTT試劑為Sigma產品; FOXM1、多藥耐藥相關蛋白1 ( multidrug-associated protein 1，MRP1)和β-actin抗體為Santa Cruz產品; TaqMan miRNA分析試劑盒和實時熒光定量PCR分析儀為ABI產品。

2方法

2.1細胞培養和轉染人肺腺癌細胞系A549用含10%胎牛血清、青霉素1×105U/L、鏈霉素100 mg/L 的RPMI-1640培養液培養，A549/CDDP細胞系另加終濃度為40 μmol/L的順鉑以維持其耐藥性。2種細胞均于37℃、5% CO2條件下常規培養。在轉染前1 d，取生長狀態良好的細胞，用胰酶消化，細胞計數后，均勻鋪于細胞板。12～16 h后時進行轉染，轉染按照Lipofectamine 2000轉染試劑說明書進行。

2.2基因芯片篩選A549/CDDP和A549細胞差異表達的miRNA采用Trizol試劑提取細胞總RNA，應用分光光度計檢測RNA的純度和濃度，并用1. 5%凝膠電泳檢測RNA的完整性，確定A260/A280值在1. 8～2. 1之間并且完整性好的總RNA交由杭州聯川生物公司進行miRNA芯片分析。

2.3RNA提取和real-time PCR采用Trizol試劑提取細胞總RNA，應用TaqMan miRNA反轉錄試劑盒反轉錄合成cDNA。應用TaqMan miRNA檢測試劑盒分析miR-134的表達水平，以U6作為內參照，實驗重復3次。

2.4MTT法檢測細胞對順鉑的敏感性取對數生長期的A549細胞和A549/CDDP細胞，接種于96孔板，每孔2×103個細胞。分別轉染anti-NC、anti-miR-134、NC和miR-134，每組設置5個復孔。于轉染24 h后分別加入不同終濃度的順鉑。藥物共培養48 h后，每孔加入2 g/L的MTT 50 μL，置37℃、5% CO2溫箱中4 h，翻板棄培養液，每孔加入DMSO 150 μL，置37℃、5% CO2溫箱中30 min，酶標儀570 nm波長測各孔的吸光度( A)，計算半數抑制濃度( IC50)。

2.5Western blot法檢測蛋白的表達水平收集細胞，運用總蛋白提取試劑盒提取總蛋白，經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉膜，將膜置于含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液中，37℃封閉2 h。分別加入FOXM1和MRP1單克隆抗體，在4℃下孵育過夜。1×TBST緩沖液洗膜，加辣根過氧化物酶標記的Ⅱ抗，置于37℃孵育2 h。1×BST緩沖液洗膜，采用化學發光法檢測目的蛋白條帶。以β-actin作為內參照。

3統計學處理

采用SPSS 13. 0統計軟件進行數據分析，數據結果以均數±標準差( mean±SD)表示，組間比較采用獨立樣本t檢驗或單因素方差分析，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1 miRNA在A549/CDDP和A549細胞間的表達差異

利用高通量miRNA芯片技術檢測發現A549/CDDP細胞中有13條miRNAs與A549親本細胞呈顯著差異，其中7種miRNA(包括miR-134、miR-200b、miR-495、miR-379、miR-194、miR-376a和miR-127)在A549/CDDP中表達下調，6種miRNA(包括miR-125a、miR-324、miR-100、miR-99a和miR-27a)表達上調，見表1。應用realtime PCR的方法對芯片中下調最顯著的miR-134進行驗證，結果顯示miR-134在A549/CDDP細胞中下調了( 15.40±0.56)倍( P＜0.01)，提示miR-134可能與肺腺癌順鉑耐藥相關。

表1　在A549/CDDP和A549細胞系中差異表達的miRNATable 1.miRNAs differentially expressed in A549/CDDP and A549 cell lines ( Mean±SD.n =3)

2 miR-134的表達影響肺腺癌細胞對順鉑的敏感性

A549/CDDP細胞轉染miR-134模擬物后其對順鉑的半數抑制量較陰性對照組顯著下降( P＜0. 01)。A549細胞轉染miR-134抑制物后其對順鉑的半數抑制量較陰性對照組顯著增高( P＜0. 01)，見圖1。

Figure 1.Effects of miR-134 on A549/CDDP and A549 cells sensitivity to cisplatin.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs NC;##P＜0. 01 vs anti-NC.圖1　miR-134對A549/CDDP和A549細胞順鉑敏感性的影響

3 miR-134抑制FOXM1蛋白表達

Western blot結果顯示，FOXM1在A549/CDDP中表達顯著升高，轉染miR-134模擬物后FOXM1表達受到抑制，而在A549細胞中轉染miR-134抑制物后FOXM1蛋白的表達升高，見圖2。

Figure 2.miR-134 regulated FOXM1 protein expression.Mean±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs A549;##P＜0. 01 vs NC;△△P＜0. 01 vs anti-NC.圖2　miR-134調控FOXM1蛋白表達

4 FOXM1基因沉默影響肺腺癌細胞對順鉑的敏感性

FOXM1 siRNA轉染A549/CDDP后FOXM1蛋白的表達顯著下調，細胞對順鉑的半數抑制量較陰性對照組顯著下降( P＜0. 01)，見圖3。

5 miR-134抑制MRP1的表達

Western blot結果顯示，A549/CDDP細胞轉染miR-134模擬物后MRP1蛋白的表達顯著下調，而在A549細胞中轉染miR-134抑制物后MRP1蛋白的表達升高，見圖4。

Figure 3.FOXM1 knockdown increased sensitivity of A549/ CDDP cells to cisplatin.Mean±SD.n = 3.＊＊P＜0. 01 vs NC.圖3　FOXM1基因沉默增加A549/CDDP細胞對順鉑的敏感性

Figure 4.miR-134 suppressed MRP1 protein expression.Mean ±SD.n =3.＊＊P＜0. 01 vs NC;##P＜0. 01 vs anti-NC.圖4　miR-134抑制MRP1蛋白表達

討論

miRNA主要是通過抑制靶基因的翻譯或介導靶基因mRNA的降解在轉錄后調控過程中發揮作用。隨著對miRNA分子調控網絡研究的不斷深入，miRNA在肺癌中的作用及機制已有相關文獻報道。Raponi等［7］發現miR-155的表達水平與非小細胞肺癌病人的生存期有顯著相關性，是非小細胞肺癌預后判斷的一個重要的miRNA因子。Fei等［8］報道miR-21、miR-181a和miR-16在肺癌細胞A549的增殖過程中發揮著聯合作用，利用反義核酸技術抑制3種miRNAs的表達可以通過誘導凋亡發生和細胞周期阻滯從而顯著抑制A549細胞的增殖。另外，Zhang等［9］研究發現miR-513a-3p在肺癌細胞系中過表達能增加腫瘤細胞的化療敏感性，提示miRNA是一個有前途的腫瘤治療藥物，但miRNA在肺癌化療耐藥中的作用及機制仍不完全清楚。因此，深入研究miRNA在肺癌耐藥中的分子機制，為逆轉肺癌化療耐藥尋找新的分子治療靶點顯得尤為重要。

本研究中，我們利用高通量miRNA芯片技術對A549/CDDP細胞與A549親本細胞之間miRNA差異表達譜進行了分析，發現其中有13條miRNAs呈顯著差異表達，其中miR-134在A549/CDDP中表達水平顯著下調了( 15. 40±0. 56)倍，提示miR-134可能與肺癌的化療耐藥相關。已有的研究顯示miR-134在腫瘤中多發揮抑癌基因功能，如miR-134通過靶向調控ITGB1抑制肝癌細胞轉移［5］; miR-134能夠抑制子宮內膜癌干細胞增殖和侵襲［6］。但miR-134與肺腺癌化療耐藥的關系尚不清楚。本研究中，我們將miR-134模擬物轉染A549/CDDP細胞后其對順鉑的半數抑制量顯著下降，而A549細胞轉染miR-134抑制物后其對順鉑的半數抑制量顯著升高。表明miR-134能夠增加肺腺癌細胞對順鉑的敏感性。

我們曾報道過miR-134能夠通過靶基因FOXM1抑制非小細胞肺癌上皮間質轉化［4］。FOXM1是叉頭框轉錄因子家族中的一員，FOXM1在很多的人類腫瘤中(包括人肺癌、原發性胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌、肝癌等)表達量上調，目前已確認FOXM1參與了多種致癌信號途徑的調控［10］。為研究FOXM1在miR-134調控順鉑耐藥中的作用，我們通過Western blot技術檢測FOXM1蛋白表達，結果顯示FOXM1 在A549/CDDP細胞中表達顯著升高，miR-134能夠抑制FOXM1蛋白表達。應用干擾RNA沉默FOXM1后，A549/CDDP細胞對順鉑的敏感性增加。表明FOXM1參與了miR-134誘導的順鉑耐藥。

MRP1屬于ATP-binding cassette ( ABC)超家族跨膜轉運蛋白，已有研究顯示其在順鉑耐藥的肺腺癌細胞中過表達，是導致肺癌化療耐藥的重要機制［11-13］。因此有必要檢測MRP1是否受miR-134調控。Western blot結果顯示，miR-134能夠抑制MRP1蛋白的表達。

綜上所述，miR-134在肺腺癌順鉑耐藥細胞系中表達下調，過表達miR-134能夠提高肺腺癌細胞對順鉑的敏感性，其作用可能是通過調控FOXM1和MRP1基因表達實現。

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miR-134 regulates cisplatin resistance of human lung adenocarcinoma cells

YU Wan-jun1，WANG Yi-ping2，LI Ji-peng2，WANG Hua-ying1
(1Department of Respiratory and Critical Care Medicine，2Department of Laboratory Medicine，Yinzhou People’s Hospital，Ningbo 315040，China.E-mail: yingmeire@163.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the roles of microRNA-134 ( miR-134) in the cisplatin resistance of lung adenocarcinoma cells.METHODS: miRNA microarray was applied to compare the miRNA expression profile between A549/ CDDP and A549 cells.Real-time PCR was used to confirm the expression of miR-134.miR-134 mimics and inhibitors were transfected into A549/CDDP and A549 cells，respectively.MTT assay was used to detect the sensitivity of lung cancer cells to cisplatin.Western blot was applied to test whether miR-134 regulated forkhead box protein M1 ( FOXM1) and multidrug-associated protein 1 ( MRP1) expression.RESULTS: Based on the data of miRNA microarray，13 miRNAs were found to be differentially expressed in A549/CDDP cells compared with A549 cells，among which miR-134 was the most significantly down-regulated one.Compared with control group，A549/CDDP cells transfected with miR-134 mimics showed greatly enhanced sensitivity to cisplatin as indicated by IC(50)values ( P＜0. 01).In contrast，suppression of the miR-134 level in the A549 cells resulted in a decreased sensitivity to cisplatin ( P＜0. 01).FOXM1 siRNA down-regulated the protein levels of FOXM1.A549/CDDP cells transfected with si-FOXM1 showed enhanced sensitivity to cisplatin ( P＜0. 01).In addition，the result of Western blot showed that miR-134 repressed MRP1 protein expression.CONCLUSION: miR-134 effectively increases the sensitivity of lung adenocarcinoma cells to cisplatin，and this effect of miR-134 may be partly due to its regulation of FOXM1 and MRP1 expression.

［KEY WORDS］MicroRNA-134; Lung adenocarcinoma; Cisplatin resistance; Forkhead box protein M1; Multidrug-associated protein 1

通訊作者△Tel: 0574-87016828; E-mail: yingmeire@163.com

*［基金項目］浙江省自然科學基金資助項目( No.LY14H160002) ;浙江省醫藥衛生科技項目( No.2014KYB248)

［收稿日期］2015-01-26［修回日期］2015-03-26

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1214-05

［中圖分類號］R730. 23

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.011