肥大細胞轉化生長因子β在人慢性根尖周病組織中的表達*

尹小萍，陳　柯，謝錦強，黃世光△(暨南大學醫學院口腔醫學系，廣東廣州5063;廣州市婦女兒童醫療中心口腔科，廣東廣州5063)

肥大細胞轉化生長因子β在人慢性根尖周病組織中的表達*

尹小萍1，陳柯2，謝錦強1，黃世光1△
(1暨南大學醫學院口腔醫學系，廣東廣州510632;2廣州市婦女兒童醫療中心口腔科，廣東廣州510623)

［摘要］目的:本研究旨在觀察不同類型慢性根尖周病組織中肥大細胞( mast cells，MCs)的分布，分析轉化生長因子β( transforming growth factor-β，TGF-β)在MCs上的表達情況，探討類胰蛋白酶( tryptase) -TGF-β雙陽性MCs在慢性根尖周病免疫病理中的作用。方法:共收集78例樣本，分為3組: ( 1)根尖肉芽腫組25例; ( 2)根尖囊腫組25例; ( 3)正常對照組28例。組織標本經4%甲醛固定48 h以上。石蠟包埋、制備組織連續切片。HE染色，觀察其組織學改變;采用甲苯胺藍染色法觀察各組標本組織中MCs的數量及MCs脫顆粒情況;采用免疫熒光雙染色法，在熒光顯微鏡下觀察各組標本組織中tryptase-TGF-β雙陽性MCs的數量。結果: ( 1)與正常對照組相比，兩組慢性根尖周病組織中tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度顯著增多( P＜0. 01) ; ( 2)根尖囊腫組tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組( P＜0. 01) ; ( 3)與甲苯胺藍染色法相比，tryptase-TGF-β免疫熒光雙染色法結果中各組標本組織的MCs密度顯著增多( P＜0. 01)。結論:慢性根尖周病組織，尤其是根尖囊腫組織中tryptase-TGF-β雙陽性細胞明顯增多，提示tryptase-TGF-β雙陽性MCs可能在慢性根尖周病中的致病過程，尤其在根尖周囊腫纖維組織形成中發揮作用。Tryptase免疫熒光染色法比傳統鑒別肥大細胞的甲苯胺藍染色法更靈敏。

［關鍵詞］慢性根尖周病;肥大細胞;類胰蛋白酶;轉化生長因子β

根尖周病是由來源于感染根管的細菌及其代謝產物經根尖孔擴散至根尖周組織所致。機體的免疫防御機制無法完全消除根尖周的感染，因而形成伴隨根尖周骨組織吸收破壞的慢性病損［1］。轉化生長因子β( transforming growth factor-β，TGF-β)是細胞生長的雙重調節劑，在炎癥、組織修復、胚胎發育、細胞的生長、分化和免疫功能方面都有重要的調節作用，與腫瘤發生發展、自身免疫和纖維化疾病等均有密切關系［2］。考慮到肥大細胞( mast cells，MCs)在過敏性和炎癥性疾病中的作用及TGF-β對免疫細胞的抑制作用，TGF-β可能具有通過旁分泌或自分泌方式抑制MCs活性的功能［2］。我們前期研究已經表明MCs的募集和脫顆粒［3］、MCs干細胞因子( stem cell factor，SCF)與根尖周病免疫病理密切相關［4］，提示MCs及其相關細胞因子在根尖周病的發病及病理過程中起重要作用。目前，有關參與根尖周病MCs 的TGF-β表達情況還未見報道。因此，本研究分別采用甲苯胺藍染色法和免疫熒光雙染色法，觀察不同類型慢性根尖周病組織中MCs的分布，分析TGF-β在MCs上的表達情況，探討類胰蛋白酶( tryptase) -TGF-β雙陽性MCs在慢性根尖周病免疫病理中的作用。

材料和方法

1研究對象

1.1病例選擇選擇2011年9月～2013年6月期間在暨南大學荔灣口腔教學醫院臨床診斷為根尖囊腫和根尖肉芽腫接受根尖刮治手術并經病理檢查確診的病例50例，其中根尖肉芽腫25例［22～60歲，平均( 43. 2±11. 9)歲］，根尖囊腫25例［24～64歲，平均( 45. 9±11. 8)歲］。正常對照組28例［年齡18～23歲，平均( 20. 5±4. 3)歲］為正常牙周膜，來自2013年6～9月期間因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，所有這些前磨牙牙根發育完全并且沒有根尖周病。所有患者均沒有系統性疾病而且至少2個月前停止使用抗生素。樣本收集之前取得患者的書面知情同意書。

1.2分組及取材( 1)正常對照組:因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙牙周膜，共28例; ( 2)根尖肉芽腫組: X線顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區，直徑＜1 cm，邊界清楚，組織學檢查見明顯的炎癥細胞浸潤，并無鱗狀上皮襯里; ( 3)根尖囊腫組: X線顯示患牙根尖周有圓形或橢圓形密度降低區，直徑＞1 cm，邊界清楚有白色射阻線包繞，組織學檢查見根尖區組織存在部分或全部上皮覆蓋，囊腫表現為完整的囊腔，囊腔為一定厚度的復層鱗狀上皮覆蓋。上皮層可見明顯炎癥細胞浸潤，纖維組織層以膠原纖維為主，未見明顯的炎癥細胞浸潤。

2實驗方法

2.1組織標本采集、處理與觀察根尖肉芽腫和根尖囊腫標本是在進行根尖刮治手術時取得的根尖周病變組織。正常對照組標本取自因正畸需要拔除的牙周健康的前磨牙，用無菌刀片將牙周膜從牙根上刮取。標本立即固定于4%甲醛溶液中48 h以上，經脫水、透明、浸蠟、包埋，制備成5 μm厚度組織連續切片。由2名病理醫師盲法觀察各組標本的組織學改變。

2.2甲苯胺藍染色與觀察組織切片通過常規脫蠟、酒精復水，常溫下甲苯胺藍液染色過夜，最后中性樹膠封片。2名病理醫師于光學顯微鏡下觀察組織切片中MCs形態及脫顆粒情況并計數。在400倍視野下對每張切片中全部MCs計數，并記錄每張切片的組織面積大小。計算各組MCs及脫顆粒MCs密度。MCs密度( mm－2) =每張切片中MCs總數/每張切片的組織面積;脫顆粒MCs密度( mm－2) =每張切片中脫顆粒MCs總數/每張切片的組織面積。

2.3Tryptase-TGF-β雙陽性MCs免疫熒光雙染色

抗tryptase的I抗( Abcam)，稀釋濃度為1∶200;抗TGF-β的I抗( Santa Cruz)稀釋濃度為1∶100; II抗為山羊抗鼠IgG( H + L) Alex Flour 555( Cell Signaling)，山羊抗兔IgG( H + L) Alex Flour 488( Cell Signaling)，稀釋濃度為1∶200。組織切片通過常規脫蠟、乙醇復水，檸檬酸鹽緩沖液微波修復、山羊血清封閉，I抗孵育，避光條件下II抗孵育熒光染色后，抗熒光淬滅封片液封片，立即在熒光顯微鏡下觀察。2名病理醫師于免疫熒光顯微鏡下觀察到MCs均表達有TGF-β，從而對各組實驗標本中的tryptase-TGF-β雙陽性MCs計數并計算各組tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度。在400倍視野下對每張切片的tryptase-TGF-β雙陽性MCs計數，并記錄每張切片的組織面積大小。Tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度( mm－2) =每張切片中tryptase-TGF-β雙陽性MCs總數/每張切片的組織面積。

3統計學處理

所有數據以均數±標準差( mean±SD)表示，采用SPSS 13. 0統計軟件進行分析。不同組間甲苯胺藍染色MCs密度及每平方毫米tryptase-TGF-β雙陽性MCs數目的比較采用非參數檢驗——Kruskal-Wallis H檢驗; 3組之間存在差別則進行3個獨立樣本兩兩比較的Nemenyi法檢驗。不同組間甲苯胺藍染色法和免疫熒光雙染色法MCs密度的比較采用非參數檢驗——配對樣本比較的Wilcoxon符號秩檢驗。以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1組織學觀察

正常對照組未見明顯炎癥細胞浸潤;根尖肉芽腫組可見大量炎癥細胞浸潤，主要為單核細胞、淋巴細胞和漿細胞呈灶性浸潤，其中巨噬細胞樣細胞和中性粒細胞呈散在浸潤;根尖囊腫組上皮層表現為細胞間水腫，上皮下見大量以中性粒細胞為主的炎癥細胞浸潤;纖維組織層以膠原纖維為主，未見明顯的炎癥細胞浸潤，見圖1。

Figure 1.The histological changes of the specimens (×400).A: healthy control; B: periapical granuloma; C: the epithelial layer of periapical cyst; D: the fibrous tissue area of periapical cyst.圖1　各組標本組織學觀察

2甲苯胺藍染色

正常對照組的健康牙周膜組織中可見正常寄居的MCs，數量極少;根尖肉芽腫組與正常對照組相比，MCs的數量有所增加，MCs呈圓形或卵圓形，細胞邊緣整齊光滑，胞質顆粒均勻，部分MCs呈輕度、中度脫顆粒;根尖囊腫組可見大量MCs定位于囊性上皮稍下方、結締組織和上皮內區域，染色較深，形態多樣，MCs呈明顯脫顆粒現象，部分MCs崩解，異染性顆粒散落在細胞外，見圖2。

各組標本組織中甲苯胺藍染色MCs及脫顆粒MCs密度比較見圖3。與正常對照組相比，兩組慢性根尖周病組織中MCs密度顯著上升( P＜0. 01)，且根尖囊腫組的MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組( P＜0. 05) ;與正常對照組相比，兩組慢性根尖周病組織中脫顆粒MCs密度顯著上升( P＜0. 01)，且根尖囊腫組的脫顆粒MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組( P＜0. 05)。

3Tryptase-TGF-β雙陽性MCs免疫熒光雙染色結果

各組標本組織中MCs均表達有TGF-β。正常對照組的健康牙周膜組織中僅可見少量散在分布的tryptase-TGF-β雙陽性MCs;根尖肉芽腫組的根尖周病變組織中tryptase-TGF-β雙陽性MCs數目明顯增多;根尖囊腫組的根尖周病變組織囊性上皮稍下方、結締組織和上皮內tryptase-TGF-β雙陽性MCs數目顯著增多，見圖4。

Figure 2.Representative photomicrographs of MC infiltration with toluidine blue staining.圖2　各組標本甲苯胺藍染色觀察

Figure 3.The densities of MCs and degranulated MCs with toluidine blue staining.Mean±SD.n = 25～28.＊＊P＜0. 01 vs healthy control;△P＜0. 05 vs periapical granuloma.圖3　各組標本組織中甲苯胺藍染色MCs及脫顆粒MCs密度

各組標本組織中的tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度( mm－2)見圖5，結果顯示3組標本組織中的tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度不同( P＜0. 01)，其中根尖囊腫組tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度最高。Nemenyi檢驗分析結果顯示:正常對照組與根尖肉芽腫組的tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度之間存在顯著差異( P＜0. 01) ;正常對照組與根尖囊腫組的tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度之間有顯著差異( P＜0. 01) ;根尖囊腫組的tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組( P＜0. 01)。

4甲苯胺藍染色與免疫熒光雙染色MCs密度的比較

各組標本甲苯胺藍染色與免疫熒光雙染色MCs密度的比較見圖6。結果顯示與甲苯胺藍染色結果相比，免疫熒光雙染色法結果中各組標本組織的MCs密度顯著增多( P＜0. 01)。這提示trypatse免疫熒光染色法比傳統鑒別肥大細胞的甲苯胺藍染色法靈敏度更高。

Figure 4.Representative photomicrographs of MC infiltration with tryptase-TGF-β immunofluorescence double staining (×400).圖4　各組標本組織中tryptase-TGF-β陽性MCs

Figure 5.The density of tryptase-TGF-β positive MCs.Mean± SD.n =25～28.＊＊P＜0. 01 vs healthy control;△P ＜0. 05 vs periapical granuloma.圖5　各組標本組織中tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度

Figure 6.The comparison of the MC densities determined by toluidine blue ( TB) staining and double immunofluorescence ( IF) staining.Mean±SD.n = 25～28.＊＊P＜0. 01 vs MCs-TB.圖6　各組標本甲苯胺藍染色與免疫熒光雙染色MCs密度比較

討論

來源于感染根管的微生物是導致根尖周疾病的主要因素，細菌及其毒性產物經根管系統擴散至根尖周組織，啟動機體免疫防御機制，導致各種炎癥細胞及破骨細胞浸潤，并產生多種CKs，導致根尖周組織的破壞和骨吸收［5］。感染根管中的革蘭氏陰性菌的細胞壁成分脂多糖( lipopolysaccharide，LPS)能刺激中性粒細胞、巨噬細胞和MCs等釋放多種促炎細胞因子，如IL-1、TNF-α、TGF-β和PGE2等，同時能激活破骨細胞，導致根尖周牙骨質和牙槽骨的吸收［6］。

傳統觀點認為，MCs主要參與I型超敏反應，抗原性物質與MCs表面的IgE結合后可導致MCs膜結構變化，發生脫顆粒釋放組胺、白三烯等一系列生物活性肽，介導速發型過敏反應，從而導致或加劇根尖周組織水腫、疼痛、患牙伸長感、咬合痛等臨床癥狀［7］。在根尖周肉芽腫和囊腫浸潤的炎癥細胞中，觀察到一定數量的MCs，提示MCs參與根尖周病的致病機制［8］。然而，也有學者并不支持MCs介導的速發型過敏反應在根尖周病中發揮作用［9-10］。因此，有關MCs在根尖周疾病中的作用，目前尚無一致的看法。

研究顯示MCs和巨噬細胞參與根尖囊腫的發病機制［11］。Márton等［12］觀察到根尖周病變的纖維囊中存在大量的MCs，而在根尖肉芽腫中沒有發現MCs。de等［13］在根尖囊腫的炎癥病變區觀察到MCs數量增多，同時在病變的深層組織中出現明顯的脫顆粒現象，提示MCs與牙源性病變的炎癥反應和囊性病變有關。Drazic等［14］觀察到根尖囊腫的MCs數量比肉芽腫多，且MCs主要出現在根尖周病變組織的炎性浸潤和成纖維細胞區域。Ledesma-Montes等［15］觀察到MCs在有上皮增生的肉芽腫和炎癥浸潤區數量增加，并出現明顯的脫顆粒，提示MCs與根尖周炎癥進程的發生、發展和持續存在密切關系。本研究，我們采用甲苯胺藍染色法對25例根尖肉芽腫、25例根尖囊腫和28例正常牙周膜進行檢測，結果顯示兩組慢性根尖周病組織中MCs和脫顆粒MCs數量較正常對照組明顯增多，且根尖囊腫組MCs和脫顆粒MCs數量均明顯高于根尖肉芽腫。我們的研究結果與多數研究者的結果一致，提示MCs參與根尖周病變過程。

TGF-β超家族由結構相關的多肽生長因子組成，是一組調節細胞增殖和分化的蛋白質家族。TGF-β在炎癥、組織修復、胚胎發育、細胞生長、分化和免疫功能方面均有重要調節作用，參與自身免疫性疾病、動脈粥樣硬化、纖維性病變和腫瘤等的病變過程［2］。TGF-β對多種細胞的生長、分化具有雙重調節性，根據細胞的類型及其分化狀態或試驗條件不同，起抑制或激活作用。考慮到MCs在過敏性和炎癥性疾病中的作用及TGF-β對免疫細胞的抑制作用，TGF-β可能具有通過旁分泌或自分泌方式抑制MCs活性的功能［2］。研究表明，TGF-β可以根據MCs的亞型、成熟或激活狀態，對MCs釋放介質產生上調或減弱的作用［16］。研究表明，由MCs或其它細胞產生的TGF-β1參與炎癥級聯反應，延遲并可逆性抑制IgE介導的MCs過敏反應［17］。TGF-β被認為在慢性腎病( chronic kidney disease，CKD)中通過誘導腎結構纖維化發揮重要作用［18］。TGF-β1能控制腎臟的炎癥反應，同時也能促進腎臟纖維化的發展，是減少或干預慢性腎病惡化的一個潛在藥物學目標［19］。

目前關于MCs細胞因子參與根尖周病的致病機制不詳，對參與根尖周病MCs的TGF-β表達還未見報道。因此，本研究我們采用免疫熒光雙染色法，分析TGF-β在MCs上的表達情況。結果顯示:與正常對照組相比，慢性根尖周病組織中的tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度明顯升高;根尖囊腫組的tryptase-TGF-β雙陽性MCs密度明顯高于根尖肉芽腫組，結果提示tryptase-TGF-β雙陽性MCs可能在慢性根尖周病的致病機制，尤其在根尖周囊腫的纖維組織形成中發揮作用。因此，我們可以推斷TGF-β是主要的抗炎因子之一，它在MCs中表達的生物學意義可能是穩定炎癥反應，修復受損組織。在根尖周疾病中，TGF-β能對抗促炎癥因子IL-1和TNF-α，是巨噬細胞的滅活劑。研究結果對于闡明TGF-β陽性MCs在根尖周病的發病機制，尤其在根尖周囊腫中的作用具有理論意義和臨床指導價值。控制TGF-β陽性的MCs或調節MCs的功能可能成為阻止根尖周病發展的一個治療目標。從而，為根尖周病的治療提供新的靶點，為臨床治療根尖周病提供更有效的治療方向。

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Expression of transforming growth factor-β on mast cells in human chronic periapical diseases

YIN Xiao-ping1，CHEN Ke2，XIE Jin-qiang1，HUANG Shi-guang1
(1Faculty of Dentistry，School of Medicine，Jinan University，Guangzhou 510632，China;2Department of Stomatology，Guangzhou Women and Children Medical Centre，Guangzhou 510623，China.E-mail: thshg@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the distribution of mast cells ( MCs) and the expression of transforming growth factor-β( TGF-β) on tryptase positive MCs in different types of human periapical diseases.METHODS: Total 78 cases of specimens were involved in this study，including healthy control，periapical cyst and periapical granuloma.The tissue samples were fixed in 10% formalin for at least 48 h，stained with hematoxylin and eosin for histopathological examination，stained with toluidine blue staining for identifying MCs and MCs degranulation，and stained with double immunofluorescence for identification of tryptase-TGF-β double positive MCs.RESULTS: The density of tryptase-TGF-β double positive MCs in the periapical lesions was significantly higher than that in the healthy controls ( P＜0. 01).The number of TGF-β positive MCs in the periapical cyst was significantly higher than that in the periapical granuloma ( P＜0. 01).Compared with toluidine blue staining，the number of MCs with double immunofluorescence staining significantly increased ( P＜0. 01).CONCLUSION: The TGF-β positive MCs may play an important role in the pathogenesis of human chronic periapical diseases，particularly in the formation of fibrous tissue in periapical cyst.Double immunofluorescence staining is more sensitive than the traditional toluidine blue staining for identifying MCs.

［KEY WORDS］Chronic periapical diseases; Mast cells; Tryptase; Transforming growth factor-β

通訊作者△Tel: 020-85221165; E-mail: thshg@126. com

*［基金項目］廣東省社會發展領域科技計劃( No. 2013B021800043)

［收稿日期］2015-01-16［修回日期］2015-03-25

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1247-06

［中圖分類號］R781. 34; R392. 3

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.017