氧化應激激活JNK-MAPK參與波動性高血糖誘導的大鼠肝細胞損傷*

李素娟，金可可，趙亞萍，王　鵬，趙文璽，高凱旋，楊文娟，王加林，吳德平△(中國人民解放軍第八十二醫院內分泌科，江蘇淮安300;溫州醫科大學病理生理學教研室，浙江溫州35035)

氧化應激激活JNK-MAPK參與波動性高血糖誘導的大鼠肝細胞損傷*

李素娟1，金可可2，趙亞萍1，王鵬1，趙文璽1，高凱旋1，楊文娟1，王加林1，吳德平1△
(1中國人民解放軍第八十二醫院內分泌科，江蘇淮安223001;2溫州醫科大學病理生理學教研室，浙江溫州325035)

［摘要］目的:探討波動性高血糖引起糖尿病大鼠肝細胞凋亡的機制。方法: SD大鼠隨機均分為4組:正常對照組、穩定高血糖組、波動高血糖組和胰島素組。采用鏈脲佐菌素65 mg/kg腹腔注射誘發糖尿病，波動高血糖組每天定時腹腔注射速效胰島素，并錯時給予葡萄糖，造成1 d中血糖濃度大幅度波動，12周內波動高血糖組每天血糖波動模式相似，且HbA1c與穩定高血糖組無顯著差異。12周后取血和肝臟組織，采用比色法檢測超氧化物歧化酶( SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶( GSH-Px)活性以及丙二醛( MDA)和一氧化氮( NO)含量，RT-PCR和Western blot檢測JNK、p-JNK、Bax和Bcl-2的含量。結果:與正常對照組比較，穩定高血糖組、胰島素組和波動高血糖組的食物量、飲水量和尿量增加，肝功能異常; MDA含量增多，SOD和GSH-Px活性降低，NO含量減少( P＜0. 05) ; JNK mRNA、p-JNK蛋白及Bax蛋白水平上調( P＜0. 05)，Bcl-2表達減少( P＜0. 01) ;且波動高血糖組的以上變化均較穩定高血糖和胰島素組更加明顯( P＜0. 05)。結論:波動性高血糖較穩定性高血糖更促進糖尿病肝細胞的凋亡，其機制與JNK-MAPK信號轉導通路激活有關。

［關鍵詞］肝細胞;血糖波動;氧化應激; JNK-MAPK信號通路

慢性持續高血糖和波動性高血糖對糖尿病的預后及慢性并發癥的發生和發展密切相關［1］，而且糖尿病患者血糖波動越大，慢性并發癥的發生率越高、預后就越差。我們前期研究也發現，糖尿病大鼠明顯血糖波動可加速腎小管上皮細胞凋亡［2-5］。研究表明，急性血糖波動要比持續的高血糖狀態更能促進氧化應激反應的發生，與JNK-MAPK通路密切相關［6-7］。因此，本研究旨在觀察氧化應激和JNKMAPK在波動性高糖誘導的肝細胞凋亡中的作用，以探討波動性高糖比穩定性高糖引起更嚴重的肝細胞凋亡的機制。

材料和方法

1動物

SPF級雄性Sprague-Dawley( SD)大鼠30只，體重( body weight，BW) 180～220 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物許可證號為SYXK(浙2010-0150)。

2主要試劑

鏈脲菌素( streptozotocin，STZ)及枸櫞酸鈉分析純購于Sigma;葡萄糖購于天津藥業集團新鄭股份有限公司;普通速效胰島素購于江蘇萬邦生化有限公司;強生穩步倍加血糖儀及配套的試紙購于Johnson;丙二醛( malondialdehyde，MDA)測定試劑盒、超氧化物歧化酶( superoxide dismutase，SOD)試劑盒及谷胱甘肽過氧化物酶( glutathione peroxidase，GSH-Px)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所;兔抗大鼠JNK、磷酸化JNK、Bax、Bcl-2和內參照GAPDH多克隆抗體均購自CST; TRIzol試劑購自Invitrogen;逆轉錄試劑盒購自MBI。

3主要方法

3.1動物模型制備及分組依據參考文獻方法建立糖尿病模型［8-9］，本實驗雄性SD大鼠24只隨機均分為4組，每組8只:正常對照( normal control，N)組，穩定性高血糖( stable high blood glucose，S)組，波動性高血糖( fluctuant high blood glucose，F)組，胰島素( insulin，I)組，S、F和I組均一次性腹腔內注射STZ 65 mg/kg，N組給予同劑量的枸櫞酸鈉緩沖液。72 h后，尾部取血，測空腹血糖和刺激大鼠膀胱測尿糖，如果血糖＞16. 7 mmol/L、尿糖+ + +，則造模成功; F組每天3次腹部皮下注射胰島素20 U/kg，第1次注射時間是每天7: 30，第2次注射時間是每天11 ∶:30，第3次注射時間是每天15: 30;并每天3次腹腔注射葡萄糖2. 5 g/kg，第1次注射時間是每天10: 00，第2次注射時間是每天14: 00，第3次注射時間是每天18: 00，造成血糖波動模型。F組大鼠每天給予胰島素時，I組給予同等劑量的胰島素，其它組給予等劑量的生理鹽水，F組給予葡萄糖時，N組、S組和F組均給予等劑量的生理鹽水。F組12周內每天血糖波動模式相似，且糖化血紅蛋白( glycosylated hemoglobin A1c，HbA1c)與S組無顯著差異，則說明波動性高血糖造模成功。12周后腹主動脈取血，用于生化指標檢測，取肝臟用于肝臟指數測定，并觀察肝臟組織JNK-MAPK蛋白和mRNA的表達。

3.2一般情況記錄大鼠體質量、飲水量、食物量和尿量。

3.3生化指標的檢測采用Johnson穩步倍加血糖儀測定血糖，親和層析-高效液相色譜法( HPLC)測定HbA1c的含量;采用雅培C8000生化分析儀檢測白蛋白( albumin，ALB)、白蛋白與球蛋白比值(白球比)、天冬氨酸氨基轉移酶( aspartate aminotransferase，AST)和丙氨酸氨基轉移酶( alanine aminotransferase，ALT)。

3.4肝指數的測定取出整個肝臟，濾紙吸干血跡后電子天平秤重得肝濕重，肝濕重與體重的比為肝指數。

3.5氧化應激指標的測定取肝臟組織均漿，化學比色法測定SOD和GSH-Px活性及MDA和NO含量，操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

3.6肝臟形態學的觀察取肝臟組織用4%多聚甲醛-PBS緩沖液固定，常規石蠟制片(厚度5 μm)，HE染色，光學顯微鏡觀察并拍照。另取肝臟組織行超微結構觀察，用冷刀片取肝臟( 0. 5～1) mm×1 mm ×1 mm大小的組織塊，迅速用2. 5%的冷戊二醛溶液固定。經過1% OsO4后固定、梯度丙酮脫水、環氧樹脂浸透、包埋、切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛染色，透射電鏡下觀察。

3.7Western blot檢測蛋白含量取肝臟組織( 100 mg)剪碎轉移至玻璃勻漿器中，加入含PMSF的裂解液1 mL，勻漿以充分裂解腎組織，12 000×g離心，取上清用BCA法測定蛋白質濃度。取100 μg蛋白上樣于12%聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉印至PVDF膜上，5%脫脂奶粉室溫封閉1. 5 h，分別加入1∶1 000稀釋的抗兔多克隆抗體p-JNK、JNK、Bax、Bcl-2和GAPDH抗體，4℃靜置孵育過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔II抗( 1∶3 000)，室溫孵育1. 5 h，膜于化學發光檢測試劑反應5 min，暗室中用X膠片感光、顯影1 min、定影15 min。掃描各種樣品的蛋白條帶的吸光度( A)，并分別算出與正常對照組A值的比值，以求出其活化倍數。

3.8RT-PCR檢測mRNA表達各取約60～100 μg肝臟組織，采用Trizol試劑盒提取總RNA，再使用分光光度計在260/280 nm處檢測總RNA的質量和純度之后，使用cDNA合成試劑盒將mRNA反轉錄為cDNA，cDNA采用相應特異性引物進行PCR擴增，引物由Invitrogen上海合成分部合成。PCR引物序列如下: JNK的上游引物為5’-AAC GAC CTT CTA CGA CGA TG-3’，下游引物為5’-GCA GCG TAT TCT GGC TAT GC-3’，擴增產物為367 bp［10-11］;β-actin的上游引物為5’-GAG ACC TTC AAC ACC CCA GCC-3’，下游引物為5’-TCG GGG GAT CGG AAC CGC TCA-3’，擴增產物為400 bp。行JNK和β-actin共擴增，PCR反應過程參數如下: 94℃5 min; 98℃10 s，54℃20 s，72℃50 s，共32個循環。取PCR反應產物8 μL，在20 g/L瓊脂糖凝膠上電泳45 min，圖像分析儀采集圖像，以內參照β-actin為基準，作半定量分析。目的基因相對表達量為目的基因條帶光密度與內參照基因條帶光密度的比值。

4統計學處理

用SPSS 16. 0統計軟件進行分析。數據均采用均數±標準差( mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析( one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著性差異法( LSD)法，以P＜0. 05為差異有統計學意義。

結果

1各組大鼠的體重及造模成功率

N組大鼠體型適中，精神狀況良好，動作自如，反應靈敏，毛發平伏有光澤，12周末各組大鼠的體重為( 521. 67±44. 71) g，造模成功率為100%。S組、I組和F組大鼠消瘦，精神萎靡，反應遲鈍，毛豎無光澤，動作遲緩，弓背蜷體。S組體重為( 361. 00± 106. 68) g，造模成功率為80%; I組體重為( 341. 00± 65. 70) g，造模成功率為70%; F組體重為( 254. 17± 67. 69) g，造模成功率為60%。

2各組大鼠血糖濃度及HbA1c的范圍

N組血糖為5.40～6.25 mmol/L，S組為19.15～23.65 mmol/L，F組為6.17～30.33 mmol/L，I組血糖為12.17～23.83 mmol/L;波動性高血糖組大鼠1 d中的血糖濃度出現明顯的波動，穩定性高血糖組大鼠1 d中的血糖濃度基本處于高水平狀態。HbA1c在N組為( 5.10 ±0.32) %，S組為( 10.50±0.69) %，F組為( 10.13± 0.96) %，I組為( 10.30±0.56) %，S組與F組比較無顯著差異( P＞0.05)，見圖1。

Figure 1.Blood glucose variation curve of different groups.Mean ±SD.n = 8.＊＊P＜0. 01 vs N group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs S group;P＜0.05，P＜0.01 vs F group.圖1　各組大鼠血糖濃度的變化曲線

34組大鼠飲食量、飲水量、尿量每日的變化情況

與N組比較，S組、F組和I組的飲食量、飲水量、尿量的每日變化都明顯增加( P＜0. 05)，與S組比較，F組的變化最明顯( P＜0. 05)，見表1～3。

表1　各組大鼠飲食量的變化Table 1.The changes of the food intake in the rats with different treatments ( g·g－1·d－1.Mean±SD.n =8)

表2　各組大鼠飲水量的變化Table 2.The changes of the drinking volume in the rats with different treatments ( ml·g－1·d－1.Mean±SD.n =8)

表3　各組大鼠尿量的變化Table 3.The volumes of the urinary output in the rats with different treatments ( ml·g·－1·d－1.Mean±SD.n =8)

44組大鼠生化指標及肝臟指數的的比較

與N組比較，S組、F組和I組的ALT、AST、 ALB、白球比及肝臟指數增高;與S組比較，F組和I組的數值較高，見表4。

表4　各組大鼠ALT、AST、ALB、白球比和肝臟指數的比較Table 4.The changes of ALT，AST，ALB，A/G and liver function in the rats with different treatments ( Mean±SD.n =8)

5波動性高血糖對肝臟組織氧化應激的影響

與N組比較，其它各組的SOD和GSH-Px活性及NO含量明顯降低，且F組更低于S組和I組( P＜ 0. 05) ; S組、F組和I組的MDA含量明顯升高，且F組高于S組和I組( P＜0. 05)，見表5。

表5　波動性高血糖對肝臟組織SOD和GSH-Px活性以及MDA和NO含量的影響Table 5.The effects of glucose fluctuation on SOD and GSH-Px activity，and MDA and NO content in the liver of the rats with different treatments ( Mean±SD.n =8)

6各組大鼠肝臟形態觀察

HE染色光鏡(×40)觀察可見N組大鼠肝臟切片的肝小葉結構清晰完整，肝索排列整齊，肝細胞呈多邊形，胞漿豐富，核圓位于中央，肝細胞內無脂肪空泡; F組大鼠肝板結構破壞，細胞排列紊亂、增大、核大小不等，細胞內有明顯脂肪變性，胞漿內可見大小不等、數量不一的脂肪空泡，有的較小為脂滴樣散布于核周，有的較大位于整個胞漿，嚴重者胞核被脂滴擠向一側，成印戒樣改變; S組和I組雖然也存在空泡和炎癥細胞，但較N組明顯減少，見圖2。

透射電鏡觀察超微結構可見N組的肝細胞核規則，線粒體有完整的膜和嵴，內質網排列整齊; S組和I組的肝細胞核不規則，線粒體模糊，內質網增生，破裂，毛細膽管擴張有淤膽現象，少量的儲脂細胞，有少量的顆粒沉積; F組肝細胞核不規則，線粒體腫脹、結構不清，粗面內質網豐富、脫顆粒，滑面內質網擴張，毛細膽管明顯擴張，管壁增粗，腔內可見非定形物質，儲脂細胞明顯增生，脂質顆粒沉積，毛細膽管增生，結構紊亂，見圖2。

7波動性高血糖對糖尿病大鼠臟臟Bcl-2和Bax表達的影響

Western blot結果表明，與N組比較，各組大鼠肝臟組織Bax蛋白的表達水平上調( P＜0. 01)，Bcl-2蛋白下降( P＜0. 01)，其中，F組比S組表達明顯( P＜0. 05)，見圖3。

Figure 3.The protein levels of Bax and Bcl-2 in rat liver tissues detected by Western blot.Mean±SD.n = 8.*P＜0. 05 vs N group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs S group;P＜0. 05，P＜0. 01 vs F group.圖3　Western blot檢測大鼠肝臟組織中Bax和Bcl-2蛋白的表達

8波動性高血糖對糖尿病大鼠肝臟p-JNK蛋白水平的影響

與N組比較，各組大鼠肝臟組織p-JNK蛋白水平上調( P＜0. 01)，其中F組高于S組( P＜0. 05)，比I組高( P＜0. 01)，見圖4。

9波動性高血糖對糖尿病大鼠肝臟JNK mRNA表達的影響

與N組比較，各組大鼠肝臟組織JNK mRNA表達均上調( P＜0. 01)，其中F組高于S組( P＜0. 05)，比I組高( P＜0. 01)，見圖5。

Figure 4.The protein level of p-JNK in rat liver tissues detected by Western blot.Mean±SD.n =8.*P＜0. 05，＊＊P ＜0. 01 vs N group;#P＜0. 05，##P＜0. 01 vs S group;P＜0. 05 vs F group.圖4　Western blot檢測大鼠肝臟組織p-JNK蛋白的表達

Figure 5.The mRNA expression of JNK in the rat liver tissues.Mean±SD.n = 8.*P＜0. 05，＊＊P＜0. 01 vs N group;#P＜0. 05 vs S group;P＜0. 01 vs F group.圖5　肝臟組織JNK mRNA的表達

討論

近年來研究表明，在HbA1c水平相同的情況下，血糖波動較大者慢性并發癥的風險大大增加［12］，且由于胰島B細胞功能障礙，胰島素抵抗，飲食控制不佳，用藥的不合理等各種因素的存在，臨床上糖尿病患者的血糖波動往往較大［13］;故本研究采用臨床實際的波動性高血糖大鼠模型與穩定性高血糖進行對比，以期進一步深入探討糖尿病肝病的發病機制。在動物模型中，各組造模成功率不同，特別是波動性高血糖組造模成功率僅為60%，其它組在80～100%之間，對于造模成功率低的原因，分析主要為低血糖造成的昏迷死亡，高血糖、感染等影響因素也會導致死亡。在造模成功的大鼠中，進一步實驗研究發現，鏈脲佐菌素誘導的糖尿病大鼠12周病程時出現了肝功能損害，同時伴有氧化應激水平升高。而最近發現糖尿病發生的急性血糖波動是觸發氧化應激反應的一個額外因素［14］，即血糖波動更容易引發氧化應激［15］。氧化應激在糖尿病及其并發癥的發生發展過程中有著重要的作用［16-17］。本研究發現，穩定性高血糖、波動性高血糖誘導的肝細胞凋亡過程中均伴有SOD和GSH-Px活性及NO含量降低，MDA含量增加，且波動性高血糖組的上述改變更加明顯，說明波動性高血糖引發的肝細胞氧化應激反應較穩定性高血糖增強。

體外實驗均證實，氧化應激能導致JNK激活，JNK又是細胞凋亡發生過程中的重要調控者。一般認為，JNK被磷酸化激活后，能通過轉錄依賴或轉錄非依賴機制調控下游靶基因的表達或靶蛋白的活性而介導細胞凋亡。研究發現，JNK激活后可從胞質中轉位入核，通過磷酸化激活c-Jun、c-Fos等轉錄因子而調節凋亡相關靶基因的轉錄表達。活化的JNK也可留在胞質內，催化Bcl-2家族的激活，調節細胞的凋亡［18］。本研究發現，與正常對照組比較，穩定高血糖組、胰島素組和波動高血糖組肝臟JNK mRNA上調，p-JNK蛋白水平上調，Bax蛋白表達升高，Bcl-2蛋白下降。波動組的變化更明顯。本研究發現糖尿病持續性高血糖組和波動性高血糖組肝臟組織中JNK蛋白的磷酸化水平均明顯高于正常對照組，且波動性高血糖組較持續性高血糖組變化更為明顯，這與其氧化應激水平和凋亡程度增加的趨勢一致，提示血糖波動可能作為一種刺激信號，會引發較單純高血糖更加嚴重的氧化應激反應，通過激活JNK，進而促進細胞凋亡。

［參考文獻］

［1］王先令，陸菊明.血糖波動對糖尿病預后及其慢性并發癥發生發展的影響［J］.國外醫學:內分泌學分冊，2005，25( 3) : 169-171.

［2］金可可，林艷紅，王萬鐵，等.血糖波動對糖尿病大鼠腎小球內皮細胞和腎小管上皮細胞凋亡的影響［J］.中國病理生理雜志，2007，23( 3) : 570-573.

［3］李素娟，李劍敏，金可可，等.氧化應激和P53參與波動性高血糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡［J］.中國病理生理雜志，2011，27( 12) : 2302-2306.

［4］許益笑，李素娟，金可可，等.血糖波動對糖尿病大鼠腎臟氧化應激與凋亡的影響［J］.中華內分泌代謝雜志，2012，28( 4) : 325-329.

［5］郝卯林，戴雍月，李素娟，等.JNK在血糖波動的糖尿病大鼠腎小管上皮細胞凋亡中的作用［J］.中國應用生理學雜志，2012，28( 4) : 309-312.

［6］Monnier L，Mas E，Ginet C，et al.Activation of oxidative stress by acute glucose fluctuations compared with sustained chronic hyperglycemia in patients with type 2 diabetes［J］.JAMA，2006，295( 14) : 1681-1687.

［7］Ge QM，Dong Y，Zhang HM，et al.Effects of intermittent high glucose on oxidative stress in endothelial cells［J］.Acta Diabetol，2010，47( Suppl 1) : 97-103.

［8］Azuma K，Kawamori R，Toyofuku Y，et al.Repetitive fluctuations in blood glucose enhance monocyte adhesion to the endothelium of rat thoracic aorta［J］.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2006，26( 10) : 2275-2280.

［9］Watada H，Azuma K，Kawamori R.Glucose fluctuation on the progression of diabetic macroangiopathy: new findings from monocyte adhesion to endothelial cells［J］.Diabetes Res Clin Pract，2007，77( Suppl 1) : S58-S61.

［10］鄭昌健，胡涵，曹紅，等.JNK / MCP-1信號通路在姜黃素抗糖尿病神經病理性疼痛中的作用［J］.中國病理生理雜志，2014，30( 11) : 1941-1945.

［11］Guido L，Manrique C.The expanding role of oxidative stress，renin angiotensin system，and β-cell dysfunction in the cardiometabolic syndrome and type 2 diabetes mellitus ［J］.Antioxi Redox Signal，2007，9( 7) : 943-954.

［12］Hirsch IB.Glycemic variability: it’s not just about A1C anymore!［J］.Diabetes Technol Ther，2005，7( 5) : 780-783.

［13］Aiello LP，Vignati L，Sheetz MJ，et al.Oral protein kinase C β inhibition using ruboxistaurin: efficacy，safety，and causes of vision loss among 813 patients ( 1，392 eyes) with diabetic retinopathy in the protein kinase C β inhibitor-diabetic retinopathy study and the protein kinase C β inhibitor-diabetic retinopathy study 2［J］.Retina，2011，31( 10) : 2084-2094.

［14］Yaqoob M，McClelland P，Patrick AW，et al.Evidence of oxidant injury and tubular damage in early diabetic nephropathy［J］.QJM，1994，87( 10) : 601-607.

［15］李金榮，王瑞英，張松筠.NADPH氧化酶在糖尿病腎病中的作用［J］.國際內科學雜志，2009，36( 2) : 93-97.

［16］Lapshina EA，Sudnikovich EJ，Maksimchik JZ.Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment［J］.Life Sci，2006，79( 19) : 1804-1811.

［17］牟忠卿，陳麗.糖尿病與氧化應激［J］.國外醫學:內分泌學分冊，2005，25( 6) : 393-395.

［18］Weston CR，Davis RJ.The JNK signal transduction pathway［J］.Curr Opin Cell Biol，2007，19( 2) : 142-149.

Oxidative stress-activated JNK-MAPK signaling pathway is involved in fluctuant high glucose-induced injury of hepatocytes

LI Su-juan1，JIN Ke-ke2，ZHAO Ya-ping1，WANG Peng1，ZHAO Wen-xi1，GAO Kaixuan1，YANG Wen-juan1，WANG Jia-lin1，WU De-ping1
(1Department of Endocrinology，The 82nd Hospital of PLA，Huaian 223001，China;2Department of Pathophysiology，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325035，China.E-mail: 13952329182@139.com)

［ABSTRACT］AIM: To explore the mechanisms of fluctuant high blood glucose-induced apoptosis of hepatocytes.METHODS: SD rats were randomly divided into normal control group ( N)，stable high blood glucose group ( S)，fluctuant high blood glucose group ( F) and insulin group ( I).Diabetic rats were induced by intraperitoneal injection of streptozotocin ( 65 mg/kg)，and the fluctuant high blood glucose animal model was induced by intraperitoneal injection of ordinary insulin and glucose at different time points every day.The blood glucose fluctuation patterns of the animals in F group within 12 weeks were similar every day and no significant difference of the HbA1c concentration was observed compared with S group，indicating that the fluctuant hyperglycemia was successfully established in F group.The activity of superoxide dismutase ( SOD) and glutathione peroxidase ( GSH-Px)，and the content of malondialdehyde ( MDA) and nitric oxide ( NO) in the homogenate of the liver tissues were detected by colorimetry.The mRNA and protein levels of JNK，p-JNK，Bax and Bcl-2 were examined by RT-PCR and Western blot.RESULTS: After 12 weeks，the increases in the intakes of food and water，the urine output，and the abnormal liver function were observed in S group，I group and F group.Compared with N group，the MDA level was increased，the content of NO and the activity of SOD and GSH-Px were decreased，and up-regulation of JNK mRNA and p-JNK and Bax proteins，and down-regulation of Bcl-2 were also found in S group，I group and F group.The above effects were more obviously showed in F group.CONCLUSION: Oxidative stress activates JNK-MAPK signaling pathway，which is involved in fluctuant high glucose-induced apoptosis of hepatocytes.

［KEY WORDS］Hepatocytes; Blood glucose fluctuation; Oxidative stress; JNK-MAPK signaling pathway

通訊作者△Tel: 0517-83568807; E-mail: 13952329182@139.com

*［基金項目］浙江省自然科學基金資助項目( No.Y207495) ;南京軍區科技創新課題項目( No.12MA026) ;淮安市內分泌代謝性疾病重點實驗平臺持續支持項目( No.HAP201273)

［收稿日期］2015-01-08［修回日期］2015-04-09

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1259-07

［中圖分類號］R587. 1; R363

［文獻標志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.019