酪酸梭菌預(yù)防小鼠幽門結(jié)扎型胃潰瘍的機(jī)制研究*

林刻智，趙　娜，孔咪咪，章　壯，曾靜靜，黃玨偉，王蕾蕾，徐昌隆，王方巖(溫州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，第一臨床學(xué)院，檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，第二臨床學(xué)院，附屬第二醫(yī)院，浙江溫州000)

酪酸梭菌預(yù)防小鼠幽門結(jié)扎型胃潰瘍的機(jī)制研究*

林刻智1▲，趙娜2▲，孔咪咪3，章壯3，曾靜靜3，黃玨偉2，王蕾蕾4，徐昌隆5，王方巖1△
(溫州醫(yī)科大學(xué)1基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2第一臨床學(xué)院，3檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，4第二臨床學(xué)院，5附屬第二醫(yī)院，浙江溫州325000)

［摘要］目的:建立小鼠幽門結(jié)扎型胃潰瘍( gastric ulcer，GU)模型，觀測酪酸梭菌( C.butyricum)對GU的預(yù)防作用并探討其機(jī)制。方法:將40只ICR小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、奧美拉唑預(yù)防給藥組和C.butyricum預(yù)防給藥組。采用小鼠胃幽門結(jié)扎的方法建立GU模型，測量各組胃游離黏液量、胃液的pH、胃蛋白酶活性，并做常規(guī)HE染色觀察胃組織的病理形態(tài)學(xué)變化，糖原( PAS)染色法觀察胃組織糖原含量的變化，采用免疫組化檢測胃黏膜組織中Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果: HE及PAS染色結(jié)果表明，C.butyricum預(yù)防能夠顯著減輕胃粘膜的損傷，其效果與奧美拉唑相當(dāng)。與模型組相比，C.butyricum組胃液的pH顯著升高( P＜0.01) ;胃蛋白酶活性下降( P＜0.05)，但其效果不如奧美拉唑組( P＜0.01) ;胃游離黏液量升高( P＜0.01)，糖原染色加深，與奧美拉唑組相比明顯增多; Bax蛋白表達(dá)量降低( P＜0.01)但Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)( P＜0.01)。結(jié)論: C.butyricum對小鼠幽門結(jié)扎型GU具有較好的預(yù)防作用，其機(jī)制可能與抑制胃酸分泌、胃蛋白酶活化，尤其是增加胃游離黏液的產(chǎn)生以及誘導(dǎo)bcl-2、抑制bax基因表達(dá)有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］酪酸梭菌;幽門結(jié)扎;胃潰瘍模型; Bax; Bcl-2

▲并列第1作者

胃潰瘍( gastric ulcer，GU)屬于最常見的一種消化性潰瘍。世界上約有10%的人在一生中的某一階段會患此病，約1%可轉(zhuǎn)化為胃癌［1］，故活動期的GU 被WHO列入癌前病變，嚴(yán)重威脅人類健康。因此，如何選擇GU的治療方法及預(yù)防措施至關(guān)重要。

GU形成的機(jī)制自1910年Schwartz提出“無酸無潰瘍”學(xué)說開始到現(xiàn)在涌現(xiàn)了一些學(xué)說，但目前普遍被接受的是由Mark等［2］提出的攻擊因子與防御因子失衡學(xué)說。其中，攻擊因子主要指胃酸、胃蛋白酶等，防御因子主要指黏液-碳酸氫鹽屏障、黏膜屏障等，但在潰瘍發(fā)生中起主要作用的仍認(rèn)為是胃酸。同時(shí)臨床研究表明，GU患者普遍存在慢性幽門螺桿菌感染( helicobacter pylori，Hp)和非甾體抗炎藥物( nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)長期使用的情況［3］。根據(jù)上述GU的發(fā)病機(jī)理，目前臨床上治療GU的藥物主要包括抑酸藥、黏膜保護(hù)劑和抗Hp感染藥物。但是，由于Hp耐藥性的增強(qiáng)［4-5］、質(zhì)子泵抑制劑的不良反應(yīng)如肝損害、自身免疫性疾病［6-7］的逐漸發(fā)現(xiàn)及GU復(fù)發(fā)率的升高［8］，使GU的治療越來越困難。

酪酸梭菌( Clostridium butyricum，C.butyricum)是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，廣泛存在于人和動物的腸道與糞便、奶酪及天然酸奶中。它的生化反應(yīng)活潑，抵抗力強(qiáng)，可耐胃酸的腐蝕、膽汁酸和消化液的消化。這些特性使它在腹瀉、腸道其它疾病的預(yù)防或治療中都得到廣泛的應(yīng)用。但是，C.butyricum在GU方面的研究較少。在2000年，Takahashi m等［9］證實(shí)了C.butyricum能拮抗Hp。這為我們研究C.butyricum對GU的預(yù)防作用提供了有利的理論基礎(chǔ)。現(xiàn)在普遍認(rèn)為導(dǎo)致GU的主要原因是胃酸的增多，所以本研究采用的是小鼠幽門結(jié)扎型GU模型，觀察C.butyricum對小鼠胃黏膜的影響并檢測相關(guān)的指標(biāo)，以探討C.butyricum對幽門結(jié)扎型GU的防治作用及其機(jī)制，為開發(fā)C.butyricum新的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

材料和方法

1動物

健康雄性ICR鼠( SPF級)，體重25～30 g，由溫州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。

2藥品與試劑

C.butyricum(本實(shí)驗(yàn)室保藏菌株CGMCC No.

8808) ; TPY液體培養(yǎng)基(青島海博生物技術(shù)) ;注射用奧美拉唑鈉(江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司) ;阿利新藍(lán)(上海化學(xué)試劑公司分裝) ;伊紅Y(上海索萊寶生物科技有限公司) ;糖原( PAS)染液試劑盒(南京建成生物工程研究所) ; Bcl-2抗體( Bioworld) ; Bax抗體( Biovision) ;山羊抗兔Ⅱ抗、Harris蘇木素染液和DAB顯色液(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)。

3方法與步驟

3.1動物分組及模型復(fù)制將40只ICR雄性小鼠隨機(jī)平均分為4組，即假手術(shù)組、模型組(培養(yǎng)基每只0.4 mL)、奧美拉唑組( 13 mg/kg)和C.butyricum 組(每只5×108cfu)。采用Shay’s幽門結(jié)扎法，每日灌胃給藥1次，連續(xù)5 d，在末次給藥后饑餓24 h，開始造模。麻醉小鼠，自劍突沿腹中線切開腹壁，切口約2～3 cm，在左側(cè)肋緣部位，用手指輕輕往上推，使胃暴露在切口處，小心避開血管，在幽門下穿線將幽門結(jié)扎，剪線后送回，逐層縫合切口，消毒后，將小鼠放入37℃恒溫箱里，直至小鼠蘇醒后，將小鼠放回飼養(yǎng)籠，禁食禁水20 h。

3.2標(biāo)本采集造模后取小鼠的胃，收集胃液于離心管中，以3 000 r/min離心10 min，取得上清液置于儲存管中用于后續(xù)胃游離黏液量、pH值及胃蛋白酶活性的測定。小鼠的胃用冰生理鹽水洗凈后，浸入4%多聚甲醛中固定，制作石蠟切片，用于常規(guī)的病理染色與免疫組化。

3.3胃游離黏液量、胃液pH值和胃蛋白酶活性的檢測在0.2 mL的胃液上清液中加入0.02 mL 10 g/L的阿利新藍(lán)溶液和0.66 mL pH5.8的檸檬酸-磷酸二氫鈉緩沖液，再加蒸餾水至1.0 mL，混勻后室溫下靜置24 h，2 500 r/min離心10 min，取上清液測量波長為615 nm處的吸光度( A)值。利用公式計(jì)算出游離黏液量:游離黏液量( g/L) = 1.0－樣品管A 值/標(biāo)準(zhǔn)管A值［10］。取0.5 mL的胃液，用蒸餾水稀釋成5 mL，用pH計(jì)測量其pH值，胃液的pH值為測得的pH值減1。使用Mett毛細(xì)玻管法［10］測定胃蛋白酶活性。精密量取胃液1 mL，置于50 mL三角燒瓶中，并加入0.05 mol/L鹽酸溶液15 mL搖勻，放入長2 cm的蛋白管2根，密閉燒瓶口，37℃孵育。24 h后，測量蛋白管兩端透明部分的長度( mm)，求四端之值的平均值，按公式:蛋白酶的單位=平均值2×16，計(jì)算胃蛋白酶活性。

3.4HE和PAS染色取胃竇部胃組織固定后石蠟包埋后制作0.5 μm的切片，做常規(guī)的HE染色，光鏡下觀察各組胃黏膜及整體的改變。糖原染色即過碘酸雪夫氏染色，具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。顯紫紅色即為PAS染色陽性。

3.5免疫組化實(shí)驗(yàn)將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、梯度乙醇復(fù)水、經(jīng)H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶、抗原修復(fù)、羊血清封閉等步驟，然后滴加I抗工作液4℃靜置過夜，最后滴加山羊抗兔Ⅱ抗、DAB顯色、蘇木素復(fù)染、脫水、透明、封片，于光學(xué)顯微鏡下觀察目的蛋白的表達(dá)情況。

4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

各組的數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0處理，數(shù)據(jù)結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差( mean±SD)表示。方差齊性者采用LSD法分析，不齊者采用Tamhane’s T2分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。采用SigmaPlot 12.3進(jìn)行作圖分析。

結(jié)果

1 C.butyricum對胃的病理變化的影響

1.1HE染色假手術(shù)組的胃壁結(jié)構(gòu)完整，腺體排列整齊，胃組織內(nèi)未見異常的脫落細(xì)胞;模型組胃壁的4層結(jié)構(gòu)被破壞，但損傷最嚴(yán)重的是胃黏膜層，黏膜層細(xì)胞脫落，上皮出現(xiàn)缺損及裂縫，有炎細(xì)胞的浸潤，同時(shí)腺體被破壞，腺腔內(nèi)出現(xiàn)壞死的上皮細(xì)胞碎片，黏膜細(xì)胞也發(fā)生了變化，胞漿染色異常;奧美拉唑組的胃壁結(jié)構(gòu)基本完整，胃黏膜層尤其是上皮損傷較小，較完整，腺體排列較為整齊，總體損傷的程度低于模型組; C.butyricum組胃壁的結(jié)構(gòu)基本完整，同奧美拉唑組相比，胃黏膜層的上皮損傷更小，腺體排列整齊，胃黏膜的損傷程度明顯低于模型組，見圖1。

Figure 1.Pathological changes of the gastric mucosa ( HE staining).S: sham operation group; M: model group; C: C.butyricum group; O: omeprazole group.圖1　HE染色顯示的胃黏膜的病理變化

1.2糖原染色與模型組相比，奧美拉唑組胃黏膜糖原的含量明顯增多，而C.butyricum組胃黏膜糖原含量顯著高于模型組，較奧美拉唑組的效果略好，見圖2。結(jié)果表明，C.butyricum可能通過分泌胃游離黏液保護(hù)胃黏膜。

Figure 2.Pathological changes of gastric mucosa ( PAS staining).S: sham operation group; M: model group; C: C.butyricum group; O: omeprazole group.圖2　糖原染色顯示的胃黏膜的病理變化

2 C.butyricum對胃游離黏液量、胃液pH值及胃蛋白酶活性的影響

由表1可以看出，C.butyricum預(yù)處理后，胃液的pH值、胃游離黏液量較模型組明顯升高而胃蛋白酶活性則顯著降低( P＜0.01)。奧美拉唑組的各項(xiàng)指標(biāo)較模型組也有顯著改善( P＜0.05)，尤其是pH值提高顯著。與奧美拉唑組比，C.butyricum組的pH值更低而胃蛋白酶活性更高，但游離黏液卻升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P＜0.01)。

表1　C.butyricum對幽門結(jié)扎型GU胃液pH值、游離黏液量及胃蛋白酶活性的影響Table 1.The effect of C.butyricum on the gastric juice pH，the content of free mucus and the activity of pepsin in pylorus ligated gastric ulcer ( Mean±SD.n =10)

3 C.butyricum對小鼠胃黏膜Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

3.1Bax蛋白的表達(dá)情況免疫組化染色可見假手術(shù)組Bax呈陰性表達(dá)，模型組胃黏膜固有層細(xì)胞胞漿可見高表達(dá)的Bax蛋白，呈深棕色。與模型組相比，奧美拉唑組的Bax蛋白的表達(dá)明顯降低( P＜0. 01)，C.butyricum組Bax蛋白的表達(dá)量也明顯下降( P＜0.01)，且下降程度強(qiáng)于奧美拉唑組( P＜0. 01)，見圖3。

3.2Bcl-2蛋白的表達(dá)情況假手術(shù)組Bcl-2呈陰性，模型組可見低表達(dá)的Bcl-2蛋白，主要位于破損的黏膜上層細(xì)胞胞漿，呈棕色;同樣，奧美拉唑組Bcl-2蛋白也低，與模型組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而C.butyricum組Bcl-2蛋白的表達(dá)水平同模型組和奧美拉唑組相比顯著升高( P＜0.01)，見圖4。

Figure 3.The protein expression of Bax in the gastric mucosa detected by immunohistochemical staining.S: sham operation group; M: model group; C: C.butyricum group; O: omeprazole group.Mean±SD.n =10.＊＊P＜0.01 vs model group;##P＜0.01 vs omeprazole group.圖3　免疫組化分析胃黏膜Bax蛋白的表達(dá)

討論

幽門結(jié)扎型GU，通過胃的幽門部結(jié)扎，致使胃酸與胃蛋白酶在胃內(nèi)潴留，胃的攻擊因子作用加強(qiáng)而防御機(jī)制減弱，易被胃酸腐蝕、胃蛋白酶消化，最終導(dǎo)致潰瘍的形成［11］。本實(shí)驗(yàn)通過HE染色和PAS染色對胃黏膜的損傷進(jìn)行評價(jià)，發(fā)現(xiàn)C.butyricum對小鼠幽門結(jié)扎型GU有明顯的保護(hù)作用。我們通過對胃液中的pH、胃蛋白酶活性測定發(fā)現(xiàn)，C.butyricum能夠抑制胃酸、胃蛋白酶的分泌，但其活性顯著弱于奧美拉唑。該結(jié)果提示C.butyricum的胃黏膜保護(hù)作用，不同于奧美拉唑等抑酸劑。為了深入探究該菌的抗GU機(jī)制，我們檢測了胃液內(nèi)的游離黏液含量，發(fā)現(xiàn)較奧美拉唑相比，C.butyricum能夠更明顯地促進(jìn)胃游離黏液的生成。游離黏液的量能夠提示胃黏膜細(xì)胞的功能，間接反應(yīng)胃黏膜屏障的功能。該結(jié)果提示增強(qiáng)胃黏膜的屏障功能是C.butyricum預(yù)防效應(yīng)的重要機(jī)制。目前臨床上，在胃黏膜損傷防治方面過度地依賴抑酸劑，而加強(qiáng)屏障功能方面較為薄弱，能夠促進(jìn)黏膜屏障功能修復(fù)的手段更少。C.butyricum在增強(qiáng)黏膜屏障方面的作用正是臨床上急需的。

Figure 4.The protein expression of Bcl-2 in the gastric mucosa detected by immunohistochemical staining.S: sham operation group; M: model group; C: C.butyricum group; O: omeprazole group.Mean±SD.n =10.＊＊P＜0.01 vs model group;##P＜0.01 vs omeprazole group.圖4　免疫組化分析胃黏膜Bcl-2蛋白的表達(dá)

bcl-2與bax是最具代表性的細(xì)胞凋亡相關(guān)基因，多項(xiàng)研究證實(shí)，bcl-2基因的產(chǎn)物Bcl-2蛋白是一種重要的抗凋亡蛋白，bax基因的產(chǎn)物Bax蛋白是一種重要的促凋亡蛋白。2種蛋白在GU的發(fā)生與愈合過程中的表達(dá)水平會發(fā)生變化。在GU發(fā)生時(shí)，Bax蛋白表達(dá)量增加，Bcl-2與Bax蛋白的比值下降;而潰瘍愈合時(shí)，Bcl-2蛋白表達(dá)水平升高，Bcl-2與Bax蛋白的比值則上升［12］。為更深入地研究C.butyricum的黏膜屏障保護(hù)機(jī)制，本研究檢測了胃黏膜bcl-2和bax基因的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奧美拉唑組的Bax表達(dá)量較低，表明奧美拉唑的抗損傷作用，而Bcl-2的量較正常組則未有大的改變，該結(jié)果說明奧美拉唑?qū)cl-2的表達(dá)沒有調(diào)控作用，而這與奧美拉唑的通過抑酸發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制相匹配。與模型組相比，C.butyricum組的Bax蛋白的表達(dá)量較模型組顯著降低，而Bcl-2蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)。該結(jié)果說明C.butyricum可能通過激活bcl-2基因的表達(dá)，抑制bax基因的表達(dá)，調(diào)控Bcl-2與Bax蛋白的比值，從而抑制胃黏膜細(xì)胞凋亡。C.butyricum作為益生菌能夠通過多重的機(jī)制發(fā)揮保護(hù)效應(yīng)，是一種非常有趣而具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值的GU防治手段。我們分析C.butyricum可能通過最主要的代謝產(chǎn)物丁酸實(shí)現(xiàn)對GU的預(yù)防作用。丁酸是一種具有強(qiáng)大組蛋白去乙酰化酶抑制功能的短鏈脂肪酸［13］，能夠調(diào)控蛋白的表達(dá)。該菌對Bcl-2和Bax表達(dá)的調(diào)控可能與丁酸有關(guān)，但仍需實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

綜上，C.butyricum通過對胃酸、胃蛋白酶的抑制減輕損傷因素;通過促進(jìn)胃黏液分泌以及調(diào)控Bcl-2和Bax的表達(dá)，增強(qiáng)黏膜上皮的抗損傷能力，增加胃的黏膜屏障功能，實(shí)現(xiàn)對GU的預(yù)防作用。C.butyricum已廣泛用于臨床，如治療多種原因引起的腹瀉、腸道炎癥等疾病［14］。C.butyricum對幽門螺旋桿菌的抑制效應(yīng)結(jié)合本文發(fā)現(xiàn)的對幽門結(jié)扎型GU的預(yù)防效應(yīng)，將使得該菌在臨床上防治GU成為可能。

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Preventive effects of Clostridium butyricum on gastric ulceration induced by pylorus ligature in mice

LIN Ke-zhi1，ZHAO Na2，KONG Mi-mi3，ZHANG Zhuang3，ZENG Jing-jing3，HUANG Jue-wei2，WANG Lei-lei4，XU CHang-long5，WANG Fang-yan1
(1School of Basic Medical Sciences，2The First Clinical Medical College，3School of Medical Laboratory Science and Life Science，4The Second Clinical Medical College，5The Second Affiliated Hospital，Wenzhou Medical University，Wenzhou 325000，China.E-mail: wzyxywfy@126.com)

［ABSTRACT］AIM: To investigate the preventive effects of Clostridium butyricum ( C.butyricum) on the type of pylorus ligated gastric ulcer ( GU) in mice and the underlying mechanisms.METHODS: ICR mice were randomly divided into 4 groups: sham operation group，model group，C.butyricum pretreatment group and omeprazole pretreatment group.Gastric pyloric ligation was adopted to establish GU model in mice.The gastric juice was collected to measure the content of gastric free mucus，the pH of gastric juice and the activity of pepsin.The gastric tissues were collected for routine HE staining to observe the pathological changes.The content of glycogen was detected by PAS staining.The protein expression of Bax and Bcl-2 in the gastric mucosa was also assessed by immunohistochemical staining.RESULTS: The HE and PAS staining showed that the C.butyricum pretreatment obviously attenuated the mucosa lesion induced by ligation.Compared with model group，the pH of gastric juice was significantly raised.The activity of pepsin fell off in C.butyricum group，which was lower than that in omeprazole group.In comparison with model group，the content of gastric free mucus was dramatically increased and PAS staining showed a significant rise in C.butyricum group，but not in omeprazole group.The protein expression of Bax was decreased and the protein expression of Bcl-2 was upgraded in C.butyricum group than those in model group.CONCLUSION: C.butyricum protects gastric mucosa against the challenge of pylorus ligation in mice and its mechanism may be related to inhibiting gastric acid secretion and the activation of pepsin，increasing the production of gastric free mucus，strengthening the expression of bcl-2 gene and inhibiting the expression of bax gene.

［KEY WORDS］Clostridium butyricum; Pyloric ligation; Gastric ulcer model; Bax; Bcl-2

通訊作者△Tel: 0577-86689817; E-mail: wzyxywfy@126.com

*［基金項(xiàng)目］溫州市科技局( No.Y20130215; No.Y20110132) ;浙江省新苗計(jì)劃項(xiàng)目( No.2014R413032)

［收稿日期］2014-12-22［修回日期］2015-04-30

［文章編號］1000-4718( 2015)07-1309-06

［中圖分類號］R573. 1; R363. 2

［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］A

doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2015.07.028