低氧促進Th17細胞浸潤于肺組織并與肺血管改建相關*

崔宇，官立彬，李曉栩，楊誠忠，譚小玲，高鈺琪，黃瑊△

(第三軍醫大學高原軍事醫學系1高原生理學與高原生物學教研室，2高原特需藥品與裝備研究室，高原醫學教育部重點實驗室，全軍高原醫學重點實驗室，重慶 400038)

低氧促進Th17細胞浸潤于肺組織并與肺血管改建相關*

崔宇1，官立彬1，李曉栩1，楊誠忠1，譚小玲1，高鈺琪2，黃瑊1△

(第三軍醫大學高原軍事醫學系1高原生理學與高原生物學教研室，2高原特需藥品與裝備研究室，高原醫學教育部重點實驗室，全軍高原醫學重點實驗室，重慶 400038)

目的:觀察低壓低氧時肺組織中維甲酸相關孤兒受體(ROR)γt的mRNA表達水平及白細胞介素17(IL－17)水平的變化，探討Th17細胞與缺氧肺血管改建的關系。方法:50只雄性BALB/c小鼠按低氧時間隨機分為0 d、3 d、7 d、14 d和28 d組，每組10只。低壓低氧組小鼠均置入模擬海拔6 000 m的低壓艙內飼養3 d、7 d、14 d和28 d。常氧組置常壓常氧環境下飼養(即0 d組)。于相應時點通過心導管檢測右室收縮壓，隨后快速處死取材，測量右心室重量指數，用流式細胞術檢測脾臟組織Th17細胞(CD4+IL－17+RORγt+)的比例，用ELISA法檢測血清中IL－4、IL－6、IL－17水平及肺組織中IL－17水平，采用real－time PCR法檢測肺組織RORγt的mRNA表達水平。結果:與對照組(0 d組)相比，低壓低氧7 d、14 d和28 d組小鼠右心室收縮壓力、右心肥厚指數和血清IL－17含量均升高，其差異有統計學意義(P＜0.05);脾臟組織中IL－17+RORγt+CD4+T細胞的百分比隨缺氧時間延長呈上升趨勢，14 d和28 d組與對照組相比差異顯著(P＜0.01);7 d、14 d和28 d組肺組織中RORγt的mRNA表達與對照組相比顯著升高，差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01);14 d和28 d組肺組織中IL－17水平與對照組相比顯著升高(P＜0.01)。肺組織中RORγt的mRNA表達水平、IL－17表達量與心室收縮壓、右室肥厚指數呈顯著正相關。結論:低壓低氧促進脾臟T0細胞向Th17細胞分化，肺組織中RORγt的mRNA表達水平及IL－17水平顯著升高，提示Th17細胞可能參與缺氧性肺動脈高壓及肺血管改建的發生。

Th17細胞;維甲酸相關孤兒受體γt;白細胞介素17;缺氧性肺動脈高壓

低氧是一種常見的應激和損傷因素，可誘發體內多系統功能改變，引起多種疾病，威脅人體健康。缺氧性肺動脈高壓(hypoxia pulmonary hypertension，HPH)是由低氧引起的以持續肺動脈壓力增高、肺血管結構改建，并伴有右心室肥大的慢性進行性疾病，是肺源性心臟病、高原心臟病等發病的中心環節。HPH的發生機制十分復雜，炎癥免疫反應在其中發揮著重要作用［1－5］。缺氧誘導因子(hypoxia－inducible factors，HIFs)是介導缺氧性肺血管改建等多種低氧反應的氧感知信號途徑中的關鍵分子［6］。Dang等［7］在體外培養的細胞模型研究發現，HIF－1上調與激活可促進Th0細胞向Th17細胞分化，抑制其向調節性T細胞(regulatory T cells，Treg)分化。HIF－1可直接激活Th17細胞的特異性轉錄因子維甲酸相關孤兒受體γt(retinoid－related orphan receptor γt，RORγt)，并可與RORγt協同調控Th17的功能。Th17細胞是一種擁有獨立分化機制的新型CD4+效應T細胞［8］，在慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases，COPD)、哮喘等慢性炎癥性疾病和多種自身免疫性疾病中發揮重要作用［9－10］。有關Th17細胞在低氧性肺血管改建及HPH發生中的作用及機制，目前尚未見報道。本研究旨在探討低壓低氧暴露后Th17細胞的變化特點及其與肺血管改建之間的關系，以深入揭示HPH的發病機制，并為尋求有效的防治靶點提供線索和依據。

材料和方法

1 實驗動物及分組

12周齡雄性BALB/c小鼠50只由第三軍醫大學實驗動物中心提供，按體質量采用隨機數字法隨機分為5組，分別在低氧環境暴露不同的時間:0 d (平原組)、3 d、7 d、14 d和28 d組，各組10只小鼠。平原組常壓常氧下飼養，低壓低氧組置于低壓艙內(模擬海拔6 000 m)飼養3 d、7 d、14 d和28 d。動物常規分籠飼養，實驗前12 h禁食，自由飲水。

2 檢測方法

2.1 小鼠心功能及血流動力學指標的測定以10%氨基甲酸乙酯(烏拉坦，1 mL/100 g)腹腔麻醉，動物仰臥固定于手術臺上，經右頸外靜脈插入心導管至右心室，用PowerLab/8SP多導生理記錄儀(AD)檢測右心室收縮壓(right ventricular systolic pressure，RVSP)等心功能及血流動力學指標。

2.2 右心肥厚指數測定檢測完血流動力學指標后處死小鼠，完整取出心臟，剪去心房組織，沿室間隔邊緣剪下右心室，用生理鹽水將血沖洗干凈后，用濾紙吸干水分，稱取右心室(right ventricle，RV)、左心室(left ventricle，LV)和室間膈(interventricular septum，S)重量，并計算RV/(LV+S)比值，即右室肥厚指數(right ventricular hypertrophy index，RVHI)。2.3細胞因子檢測眼球取血法取血，制備血清，采用ELISA法測定血清IL－4、IL－6和IL－17細胞因子含量(IL－4和IL－6 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物有限公司，IL－17 ELISA試劑盒購自Raybiotech)。2.4實時熒光定量PCR(real－time PCR)提取脾臟組織總RNA(Omega總RNA提取試劑盒)，用逆轉錄試劑盒(TaKaRa)反轉錄RNA，PCR使用SYBR Green real－time PCR試劑盒(TaKaRa)，RORγt的上游引物為5’－TGA GAA GGA CAG GGA GCC AA－3’，下游引物為5’－CCA CAG ATT TTG CAA GGG ATC A－3’;內參照β－actin的上游引物為5’－GCC CTA GAC TTC GAG C－3’，下游引物為5’－CTT TAC GGA TGT CAA CGT－3’。

2.5 流式細胞術將動物脾臟放置在70 μm尼龍網(Corning)上碾磨后加入4 mL紅細胞裂解液，制備脾臟單細胞懸液。將單細胞懸液移至15 mL離心管，加入RPMI 1640培養基至15 mL后，1 800 r/min離心6 min，棄上清。加入flow cytometry staining buffer(BD)5 mL，300×g離心6 min，每mL加入cell stimulation cooktail(Ebioscience)2 μL，37℃孵育4 h。加入小鼠CD4 PE－Cy5抗體，冰上避光孵育30min，后加入Foxp3 Fixation/Permeabilization(BD)1 mL破膜/固定，室溫孵育60 min，加2 mL 1×permeabilization buffer，400×g離心5 min，棄上清。100 μL 1×permeabilization buffer重懸后加入2 μL小鼠血清室溫孵育15 min，不清洗，加入IL－17 APCCy7和RORγt PE抗體，冰上孵育30 min。每孔加入2 mL 1×permeabilization buffer，400×g離心5 min，棄上清，用適量flow cytometry staining buffer重懸，上機檢測。

3 統計學處理

采用SPSS 13.0軟件進行統計分析。計量資料采用均數±標準差(mean±SD)表示，應用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計學意義。

結果

1 右心室收縮壓及右心室肥厚指數的變化

肺血流動力學指標測定結果表明，7 d、14 d和28 d組小鼠RVSP和右心肥厚指數明顯高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖1。

Figure 1.Hemodynamic changes of the mice under hypoxia.Mean±SD.n=10.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖1 缺氧對小鼠血流動力學指標的影響

2 低壓低氧后小鼠血清細胞因子的變化

ELISA檢測結果顯示，低壓低氧后各組小鼠血清IL－4水平較對照組明顯升高，差異有統計學意義(P＜0.05)。低壓低氧7 d、14 d和28 d組血清的IL－17水平與對照組相比顯著升高(P＜0.01)，見圖2。

Figure 2.The changes of the serum cytokine levels in BALB/c mice after hypobaric hypoxia exposure.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖2 低壓低氧后小鼠血清細胞因子的變化

3 脾臟Th17細胞比例的變化

流式細胞術結果顯示，在低氧誘導下，脾臟組織中IL－17+RORγt+CD+T細胞百分比隨缺氧時間的增長呈上升趨勢，14 d和28 d組與對照組比較差異顯著(P＜0.01)，見圖3。

Figure 3.The change of spleen Th17 cell proportion in BALB/c mice after hypobaric hypoxia exposure.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖3 低壓低氧對小鼠脾臟Th17細胞的影響

4 肺組織RORγt的mRNA水平

Real－time PCR結果顯示，在低氧誘導下，肺組織中RORγt的mRNA表達明顯升高，7 d、14 d和28 d組與對照組相比差異有統計學意義(P＜0.05)，見圖4。

Figure 4.The mRNA expression of RORγt in the lung tissue of BALB/c mice after hypobaric hypoxia exposure.Mean±SD.n=5.*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖4 低壓低氧對小鼠肺組織RORγt mRNA表達的影響

5 肺組織IL-17水平

ELISA結果顯示，14 d和28 d組肺組織中IL－17水平與對照組相比顯著升高(P＜0.01)，見圖5。

Figure 5.The levels of IL－17 in the lung tissue of BALB/c mice after hypobaric hypoxia exposure.Mean±SD.n=5.＊＊P＜0.01 vs 0 d.圖5 低壓低氧對小鼠肺組織IL-17水平的影響

6 相關性分析

在低壓缺氧7 d時，RVSP與血清IL－17水平呈正相關;在低壓缺氧14 d時，RVSP與肺組織IL－17水平呈正相關，RV/(LV+S)與肺組織IL－17水平呈正相關;此外，在低壓缺氧7 d及14 d時肺組織RORγt mRNA水平與RVSP有相關性，且呈正相關，見表1。

表1 Th17濃度與RVSP、RVHI、RORγt之間的相關系數Table 1.The correlation coefficients between serum Th17 concentration and RVSP，RVHI and RORγt

討論

HPH是高原心臟病發病的關鍵環節，而高原心臟病是高原上的常見疾病，是慢性高原病患者重要的死亡原因。由于對HPH的發病機制尚不十分清楚，迄今尚缺乏有效的防治措施。以往研究顯示，炎癥免疫反應在HPH的發生中具有重要作用，但具體機制尚不清楚。HPH的病理生理學特征是持續的肺血管收縮與肺血管機構改建，進而引起右心后負荷增加，右心室肥大。本研究采用低壓低氧暴露復制小鼠HPH模型，結果顯示，低氧各組小鼠右心室收縮壓和右心室肥厚指數均顯著高于常氧組，表明模型復制成功。利用該動物模型，我們進而研究了Th17細胞在HPH發生發展中的作用。

低氧可以通過多種途徑導致肺血管舒縮平衡失調、內膜增厚、中層平滑肌增生肥大并向遠端小血管延伸、中層與外膜層間質細胞與細胞外基質增多，同時肺小血管肌化程度增強、非肌型動脈肌型化以及細胞外基質沉淀增多等，最終導致血管重構(vascular remodeling)和肺動脈高壓［11］。這些病理變化與單核巨噬細胞、纖維細胞等炎癥細胞的浸潤有關［12］。

Th17細胞在炎癥發生發展中發揮十分重要的作用。Th17細胞的發育與功能不同于Th1和Th2細胞系，RORγt是Th17細胞系的特異性轉錄因子，誘導Th0細胞分化成熟為Th17細胞，促進IL－17、IL－17F和IL－23R的產生。此外Th17細胞還能夠分泌產生IL－6等促炎因子，IL－17作為其主要的效應因子，能募集及活化中性粒細胞［13］，促進T細胞活化及刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞產生細胞因子，從而介導組織炎癥反應［14－15］。聶穎等［16］研究發現PI3K信號通路對于調控Th17細胞的分化有重要作用。肝癌患者瘤內Th17細胞百分比與微血管密度呈正相關［17］，IL－17還能促進新生血管的生成［18－19］。Semik等［20］研究發現IL－17與COPD患者氣道平滑肌增生程度呈正相關，進一步研究發現IL－17能通過增加膠原蛋白沉積，刺激纖維細胞與成纖維細胞增殖［21］。

RORγt可作為初始T細胞向Th17細胞分化的依據。我們的結果發現，脾臟組織中RORγt mRNA水平在低壓低氧3 d時顯著升高，RORγt與IL－17雙陽性細胞數也顯著增多。在低壓低氧7 d、14 d和28 d時小鼠外周血IL－17含量也顯著增高;可以說明在低氧早期就可以誘導Th0細胞向著Th17細胞分化，并導致血清IL－17含量增多。

本研究發現，低壓低氧各組肺組織中RORγt的mRNA水平均顯著高于常氧組，肺組織中IL－17水平與常氧組相比也顯著升高。結果表明，低壓低氧后，Th17細胞在肺組織中增多，導致肺組織IL－17水平增高，IL－17可以刺激上皮細胞、內皮細胞、成纖維細胞表達內皮細胞黏附分子1等黏附分子［22］，并能增強VEGF、bFGF等生長因子的促增殖作用［23］，共同參與肺血管改建。通過相關分析發現，肺組織中的RORγt mRNA、IL－17水平均與右室收縮壓、右心室肥厚指數顯著正相關，這一結果提示Th17細胞在肺血管與心肌結構改建中發揮重要作用。低壓低氧后肺部Th17數量增強除了與來自于脾臟分化成熟的Th17細胞之外，還可能與肺部某些細胞分化為Th17有關。

本研究結果提示，Th17細胞可能在低壓低氧肺血管改建中發揮重要作用。針對性適時控制Th17的分化、趨化、IL－17生成分泌等，控制Th17在炎癥反應中的作用，有望成為控制高原低氧引起的肺臟等器官的炎癥反應的新靶點，對于促進高原習服、防治缺氧性肺動脈高壓、防治高原心臟病有十分重要的意義。但Th17細胞進入肺組織如何作用于其它炎癥細胞或局部組織細胞等詳細胞機制尚不清楚，有待進一步深入研究。

［1］Li G，Xu YL，Ling F，et al.Angiotensin－converting enzyme 2 activation protects against pulmonary arterial hypertension through improving early endothelial function and mediating cytokines levels［J］.Chin Med J(Engl)，2012，125(8):1381－1388.

［2］Ramchandran R，Raghavan A，Geenen DL，et al.PKG1α leucine zipper domain defect increases pulmonary vascular tone:implications in hypoxic pulmonary hypertension［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2014，307(7): L537－L544.

［3］Yang Q，Lu Z，Ramchandran R，et al.Pulmonary artery smooth muscle cell proliferation and migration in fetal lambs acclimatized to high－altitude long－term hypoxia:role of histone acetylation［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2012，303(11):L1001－L1010.

［4］Dorfmuller P，Perros F，Balabanian K，et al.Inflammation in pulmonary arterial hypertension［J］.Eur Respir J，2003，22(2):358－363.

［5］Kherbeck N，Tamby MC，Bussone G，et al.The role of inflammation and autoimmunity in the pathophysiology of pulmonary arterial hypertension［J］.Clin Rev Allergy Immunol，2013，44(1):31－38.

［6］Brusselmans K，Compernolle V，Tjwa M，et al.Heterozygous deficiency of hypoxia－inducible factor－2alpha protects mice against pulmonary hypertension and right ventricular dysfunction during prolonged hypoxia［J］.J Clin Invest，2003，111(10):1519－1527.

［7］Dang EV，Barbi J，Yang HY，et al.Control of TH17/Tregbalance by hypoxia－inducible factor 1［J］.Cell，2011，146(5):772－784.

［8］Bettelli E，Korn T，Kuchroo VK.Th17:the third member of the effector T cell trilogy［J］.Curr Opin Immunol，2007，19(6):652－657.

［9］Eid RE，Rao DA，Zhou J，et al.Interleukin－17 and interferon－gamma are produced concomitantly by human coronary artery－infiltrating T cells and act synergistically on vascular smooth muscle cells［J］.Circulation，2009，119 (10):1424－1432.

［10］趙京霞，底婷婷，王燕，等.IL－23/IL－17炎癥軸在咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮膚損害中的作用［J］.中國病理生理雜志，2013，29(6):1086－1094.

［11］Yildiz P.Molecular mechanisms of pulmonary hypertension［J］.Clin Chim Acta，2009，403(1－2):9－16.

［12］Frid MG，Brunetti JA，Burke DL，et al.Hypoxia－induced pulmonary vascular remodeling requires recruitment of circulating mesenchymal precursors of a monocyte/macrophage lineage［J］.Am J Pathol，2006，168(2): 659－669.

［13］Kolls JK，Linden A.Interleukin－17 family members and inflammation［J］.Immunity，2004，21(4):467－476.

［14］Gaffen SL.An overview of IL－17 function and signaling［J］.Cytokine，2008，43(3):402－407.

［15］Tesmer LA，Lundy SK，Sarkar S，et al.Th17 cells in human disease［J］.Immunol Rev，2008，223:87－113.

［16］聶穎，張維溪，崇蕾，等.PI3K信號通路對哮喘小鼠調節性T細胞與Th17失衡的調控作用［J］.中國病理生理雜志，2012，28(2):332－337.

［17］Zhang JP，Yan J，Xu J，et al.Increased intratumoral IL－17－producing cells correlate with poor survival in hepatocellular carcinoma patients［J］.J Hepatol，2009，50(5): 980－989.

［18］Numasaki M，Fukushi J，Ono M，et al.Interleukin－17 promotes angiogenesis and tumor growth［J］.Blood，2003，101(7):2620－2627.

［19］Du JW，Xu KY，Fang LY，et al.Interleukin－17，produced by lymphocytes，promotes tumor growth and angiogenesis in a mouse model of breast cancer［J］.Mol Med Rep，2012，6(5):1099－1102.

［20］Semik－Orzech A，Barczyk A，Pierzchala W.The role of interleukin 17A in inducing neutrophilic inflammation in the pulmonary tract［J］.Pol Merkur Lekarski，2007，22 (129):163－168.

［21］Hayashi H，Kawakita A，Okazaki S，et al.IL－17/F modulates fibrocyte functions in cooperation with CD40－mediated signaling［J］.Inflammation，2013，36(4):830－838.

［22］Moseley TA，Haudenschild DR，Rose L，et al.Interleukin－17 family and IL－17 receptors［J］.Cytokine Growth Factor Rev，2003，14(2):155－174.

［23］Takahashi H，Numasaki M，Lotze MT，et al.Interleukin－17 enhances bFGF－，HGF－and VEGF－induced growth of vascular endothelial cells［J］.Immunol Lett，2005，98 (2):189－193.

Relationship between Th17 cells infiltrated in lungs and pulmonary vascular reconstruction under hypobarric hypoxia

CUI Yu1，GUAN Li－bin1，LI Xiao－xu1，YANG Cheng－zhong1，TAN Xiao－ling1，GAO Yuqi2，HUANG Jian1

(1Department of High Altitude Physiology and High Altitude Biology，2Department of High Altitude Special Procurement Medicine and High Altitude Special Procurement Equipment，Key Laboratory of High Altitude Medicine of Education Ministry，Key Laboratory of High Altitude Physiology and High Altitude Disease of PLA，College of High Altitude Military Medicine，Third Military Medicine University，Chongqing 400038，China.E-mail:hj3red@gmail.com)

AIM:To investigate the changes of retinoid－related orphan receptor γt(RORγt)mRNA and interleukin－17(IL－17)protein in the lung tissue under hypobaric hypoxia，and the relationship between Th17 cells and hypoxic pulmonary vascular reconstruction.METHODS:Male BALB/c mice(n=50)were randomly divided into control group and 3 d，7 d，14 d and 28 d hypobaric hypoxia groups.The mice in hypobaric hypoxia groups were housed in a hypobaric hypoxia chamber(simulated altitude of 6 000 m)for 3 d，7 d，14 d or 28 d.The mice in control group were housed in normal pressure and oxygen environment.The hemodynamic data were recorded by cardiac catheterization.The hypertrophy of right ventricle was evaluated by the ratio of weight of the right ventricle to the weight of the left ventricle plus interventricular septum，and the right ventricular weight over body weight.The spleen was collected and the proportions of the Th17 (CD4+IL－17+RORγt+)cells were detected by flow cytometry.The serum levels of IL－4，IL－6 and IL－17 and the changeof IL－17 in the lung tissue were measured by ELISA.The mRNA expression of RORγt in the spleen and lung tissues was measured by RT－qPCR.RESULTS:Compared with control group，the mouse right ventricular systolic pressure，the hypertrophy index of right ventricle and the serum IL－17 level were significantly elevated in hypoxia groups，which was consistent with the results of flow cytometry.The mRNA expression of RORγt in the lung tissue was also significantly increased in 7 d，14 d and 28 d hypoxia groups.The expression of IL－17 in the lung tissue was significantly increased in 14 d and 28 d hypoxia groups.CONCLUSION:Hypoxia promotes differentiation of Th0 cells to Th17 cells in the spleen.The Th17 cells infiltrated in the lung tissue under hypobarric hypoxia are involved in pulmonary vascular reconstruction.

Th17 cells;Retinoid－related orphan receptor γt;Interleukin－17;Hypoxic pulmonary hypertension

R392.32

A

10.3969/j.issn.1000－4718.2015.02.011

1000－4718(2015)02－250－06

2014－11－18

2014－12－24

國家973計劃項目(No.2012CB518201);國家自然科學基金資助項目(No.81370150;No.30973446)

△通訊作者Tel:023－68772383;E－mail:hj3red@gmail.com