γ干擾素釋放試驗與結核菌素皮膚試驗在肺結核患者密切接觸者隨訪中的應用比較

李晉 楊倩婷 岳建榮 林玲 張明霞 顧美紅 鄧群益 鄧國防 鄧永聰 陳心春

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·論著·

γ干擾素釋放試驗與結核菌素皮膚試驗在肺結核患者密切接觸者隨訪中的應用比較

李晉 楊倩婷 岳建榮 林玲 張明霞 顧美紅 鄧群益 鄧國防 鄧永聰 陳心春

目的 比較γ干擾素釋放試驗(IGRAs)和結核菌素皮膚試驗(TST)在篩查肺結核密切接觸者是否發生結核感染中的效能。方法 對138名肺結核患者的密切接觸者[分別為家屬(60名)和同事(78名)]每6個月進行酶聯免疫斑點試驗(ELISPOT)和TST平行檢測，同時了解結核病的發生情況，共隨訪24個月；統計分析ELISPOT和TST檢測結果與疾病發生和結核分枝桿菌暴露的關系。結果 在2年的隨訪中，累計發現11例新發活動性肺結核。與127名完成2年共5次隨訪的未發病密切接觸者相比，新發活動性肺結核發病人群第一次ELISPOT檢測的陽性率為72.7%(8/11)，顯著高于未發病人群的陽性率33.1%(42/127)，χ2=6.8905，P=0.0087；而TST檢測的陽性率分別是63.6%(7/11)、66.9%(85/127),χ2=0.0494，P=0.8241，差異無統計學意義。ELISPOT陽性率與結核分枝桿菌暴露程度有關，暴露程度較高的密切接觸者(家屬)的陽性率為45.0%(27/60)，顯著高于暴露程度較低的同事[28.2%(22/78)]，χ2=4.1773，P=0.0410；而TST檢測的陽性率分別為55.0%(33/60)和75.6%(59/78)，與結核分枝桿菌暴露程度不一致。 結論 ELISPOT篩查肺結核密切接觸者中高危人群的特異度顯著高于TST，能更準確地反映結核分枝桿菌暴露后的感染情況。

結核,肺/診斷； 接觸者追蹤； 干擾素γ釋放試驗； 結核菌素試驗； 酶聯免疫斑點測定； 隨訪研究

篩查肺結核密切接觸者是否發生結核感染，并對潛伏結核感染者(latent tuberculosis infection, LTBI)進行預防性化療，是根除結核病的一個重要措施，也是當前一些結核病低流行的發達國家采用的結核病防控策略。我國是結核病高負擔國家，早期發現和治療活動性肺結核患者以減少社區的傳播顯得十分重要。而由于潛伏感染人群巨大，以及患者對預防性化療的依從性差，至少短期內很難實施LTBI的干預化療。在潛伏感染人群中，約10%進展為活動性結核病，這些新發結核病患者進而造成新的傳播，從而影響結核病的控制效果。因此，如何從LTBI中篩選出可能進展為活動性結核病的個體進行預防性化療，對于實現結核病徹底控制的目標具有重要意義。

結核菌素皮膚試驗(TST)和γ干擾素釋放試驗(IGRAs)是當前用于LTBI診斷的兩種主要技術。由于結核病的流行情況等多種因素影響，不同地區對于兩種方法在LTBI診斷的應用方面存在不同的意見，在具體的應用中兩種技術可能各有優勢。 另一方面，肺結核患者密切接觸者是結核分枝桿菌感染和發生結核病的高危人群。為此，筆者通過對密切接觸者的定期隨訪，比較IGRAs和TST對結核病密切接觸者人群中篩查LTBI的應用價值。

資料和方法

一、研究對象

2010—2014年間來我院就診的活動性肺結核患者的密切接觸者，在肺結核患者發現的2周以內，每6個月隨訪檢測1次結核感染和發病情況，包括酶聯免疫斑點試驗(enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT)檢測、TST檢測、胸片，以及臨床癥狀等[1]。 本研究僅對完成5次隨訪的138名受試者進行統計分析。其中密切接觸者納入標準:(1)自愿參加隨訪，簽署知情同意書；(2)在活動性肺結核患者治療之前與其一起居住、密切接觸6個月以上(家庭成員、同一辦公室同事)；(3)入組時年齡>14周歲；(4)排除機體免疫缺陷疾病(先天性免疫缺陷、HIV感染)、重度營養不良及免疫抑制劑使用者。本研究獲得深圳市第三人民醫院倫理委員會的審查和批復。

二、主要試劑

1.TST 檢測標準PPD：購于四川成都生物制品研究所。

2.ELISPOT 檢測的主要試劑: 包被抗體(anti-human IFN-γ)、檢測抗體(affinity purified anti-human IFN-γ) 及 酶 聯 二 抗 (streptavidin，alkalin phosphatase conjugated anti-IgG)，前兩者購自 eBioscience公司(美國)，后者購自 Pierce公司(美國)；堿性磷酸酶底物顯色試劑盒[對甲苯胺藍(BCIP)+四唑硝基藍(NBT),BCIP+NBT]購自Thermo(美國)；而 ELISPOT 檢測中所使用的結核菌重組蛋白早期分泌抗原靶6(ESAT-6)為深圳市第三人民醫院肝病研究所自行制備[2-3]；重組培養濾液蛋白10(CFP-10)-ESAT-6融合蛋白(重組CFP-10-ESAT-6融合蛋白，簡稱“多肽抗原”)由深圳瀚宇生物技術公司合成，純度超過 95%。ELISPOT讀數系統(Bioreader 4000 Pro-X) 為德國BioSys公司產品。

3.痰涂片主要材料:痰涂片所需黏附載片(超白玻璃，高清潔度，規格：25 mm×75 mm，厚度：1～1.2 mm)，購于江蘇省世泰實驗器材有限公司。

三、方法及步驟

1.一般要求：所有的密切接觸受訪者均要求進行胸部X線檢查、ELISPOT及TST檢測。胸部X線檢查有異常者，結合其臨床癥狀、病史開展相應的相關輔助檢查、綜合檢查，以及臨床治療情況由傳染病?？漆t生排除其他疾病的可能性；參照2001年中華醫學會結核病學分會制定的《肺結核診斷和治療指南》標準，確定肺結核診斷。

2.ELISPOT 檢測：采集密切接觸者外周全血5 ml(肝素鋰抗凝)，分離外周血單個核細胞(PBMCs)，在預先包被好的抗體的平板中加入細胞100 μl/孔，每孔細胞濃度為2×105個細胞。陰性對照孔中不加任何刺激物；陽性對照每孔加入自然凝集素(PHA)5 μg,終濃度5 μg/ml；實驗孔加入本實驗室自行制備的抗原ESAT-6及多肽抗原，終濃度為每孔5 μg/ml。繼而移至 5% CO2培養箱 37 ℃培養 16～24 h。第二天洗板后，先加入檢測抗體于CO2培養箱孵育 1 h，然后洗板，再加入親和素繼續CO2培養箱孵育 1 h，繼而洗板，最后加入顯色劑顯色。待顯色洗板后，采用酶聯斑點圖像分析儀讀數，記錄斑點數量。按照 ELISPOT 試劑說明書及根據前期ROC曲線，以ESAT-6蛋白抗原孔中形成的斑點形成細胞(SFCs)≥40個，或多肽抗原孔中SFCs≥30 個判斷為陽性[4]。

3.TST檢測方法：采血后由深圳市第三人民醫院結核病區有經驗的醫院工作人員在密切接觸者左側前臂內側皮內注射由四川生物制品公司生產的標準PPD 0.1 ml(含 BCG PPD 5 IU)，使局部形成皮丘。48～72 h 后，記錄硬結平均直徑。按硬結平均直徑≥15 mm為陽性[5]。

四、統計學方法

對于配對樣本進行ELISPOT及TST檢測結果的統計，采用配對四格表統計分析；對于兩組間的差別，采用非配對t檢驗；對于等級資料，采用行列表進行統計分析，均以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、138名結核病密切接觸者的隨訪情況

在隨訪周期內，累計發現11例新發活動性結核病患者，其中男∶女=1.75∶1 (7/4)，平均年齡(27.64±17.76)歲。 完成2年5次隨訪未發病的密切接觸者127名，其中男∶女=1.44∶1 (75/52)，平均年齡(28.34±13.66)歲。新發活動性肺結核ELISPOT、TST及結核分枝桿菌暴露程度(與傳染源的關系),詳見表1。

二、未發病人群和新發病人群中ELISPOT及TST檢測的結果比較

比較隨訪2年間未發病和發病的兩組人群第一次(隨訪的第1個月)ELISPOT 和TST檢測結果，ELISPOT檢測陽性率分別為33.1%和72.7%，差異具有顯著統計學意義(P=0.0087)；而TST 檢測陽性率分別為66.9%和63.6%，差異無統計學意義(P=0.8241)(表2)。

三、ELISPOT與TST檢測結果與結核分枝桿菌暴露程度的關系

結核感染和結核病的發生與結核分枝桿菌暴露程度密切相關[2,6]，為了探討ELISPOT與TST檢測結果與結核分枝桿菌暴露程度的關系，筆者比較了暴露程度顯著差別的家屬和同事ELISPOT與TST檢測的陽性率(表3)。雖然本研究未能精確計算家屬和同事的具體暴露時間，但已有資料表明家屬的結核分枝桿菌暴露程度顯著高于同事。與此一致，筆者發現11例新發患者中8例為家屬，而只有3例是同事，盡管完成2年隨訪的人群中家屬人數(60名)少于同事(78名)。值得注意的是：雖然TST和ELISPOT檢測陽性率在家屬和同事中差異均有統計學意義，但兩者檢測結果的方向截然相反(表3)，暴露程度較高的家屬TST檢測陽性率反而低于暴露程度較低的同事。

表1 新發活動性肺結核患者情況一覽表

注 根據第7版《傳染病學》表中胸片診斷Ⅲ型肺結核即為繼發性肺結核，分子代表左肺，分母代表右肺，上、中、下代表左右肺的結核發生位置，(-/+)代表影像學的陰/陽性

表2 結核病接觸者第一次隨訪ELISPOT及TST檢測結果比較

注 表中括號內數值分子為陽性例數，分母為檢測人數(名)

表3 隨訪2年時(第五次隨訪)ELISPOT與TST檢測結果在不同結核分枝桿菌暴露人群中的比較

注 表中括號內數值分子為陽性例數，分母為檢測人數(名)

表4 密切接觸者ELISPOT及TST檢測結果與傳染源痰AFB分級的關系

注 表中括號內數值分子為陽性例數，分母為檢測人數(名)

除暴露時間和密切接觸程度外，研究報道傳染源痰結核分枝桿菌檢測情況也是決定密切接觸者暴露程度的重要因素[7]。為此，筆者進一步分析了密切接觸者的傳染源。痰涂片抗酸桿菌(AFB)分級的結果與ELISPOT和TST檢測結果的關系(表4)。結果發現，傳染源的AFB分級結果與密切接觸者ELISPOT和TST檢測的結果沒有相關性。

討 論

IGRAs和TST是當前用于LTBI診斷的兩個主要手段，由于LTBI診斷缺乏金標準，有關兩者在LTBI診斷中的優缺點一直存在爭議，直至最近WHO和多個國家與地區根據做出了相應的應用指南[8-10]。但另一方面，由于LTBI者本身異質性明顯， 包括了從穩定的LTBI到即將要發病的LTBI，因此，從LTBI中進一步篩查結核病發生高風險(即將要發病的LTBI)要遠比籠統的診斷LTBI重要，也是當前結核病診斷最為嚴峻的挑戰之一。本研究采用自制IGRAs試劑，通過對完成了2年5次隨訪的127名未發病的密切接觸者與隨訪期間發現的11例新發活動性結核病患者進行IGRAs和TST平行檢測分析，發現IGRAs較TST在密切接觸者人群的隨訪中更有優勢。理由是，11例新發患者與未發病的接觸者比較，前者IGRAs陽性率顯著增高，而TST陽性率則差異無統計學意義；再有，IGRAs檢測陽性率與結核分枝桿菌暴露程度呈正相關，而TST檢測結果與暴露無關，其結果與暴露程度相反。雖然，筆者尚不明確本項目中結核分枝桿菌暴露程度較高的密切接觸者(家屬)的TST檢測陽性率反而低于接觸程度較低的密切接觸者(同事)的確切原因，但至少說明在密切接觸者中篩選LTBI時，TST的檢測效率有限。筆者此前的研究表明,TST檢測陰性的成年人在BCG接種3個月后，TST檢測結果96%(26/27)轉為陽性，而ELISPOT檢測的陽性率不受影響[3]。因此，上述TST檢測結果與結核分枝桿菌暴露程度不一致，可能是由于TST不能有效區分BCG接種和LTBI所造成的。另外，由于TST檢測無法區分結核分枝桿菌感染和非結核分枝桿菌感染[11]， 本項目入組人群年齡>14歲，環境中反復暴露的非結核分枝桿菌所誘導的免疫反應，可能是TST檢測結果與暴露程度不一致，甚至相反的另一種可能原因。

盡管上述結果表明IGRAs較TST檢測在密切接觸者中篩查LTBI更有優勢，但僅僅通過IGRAs檢測，在11例新發活動性肺結核患者中ELISPOT檢測陽性率只有72.7%。相反，雖然TST檢測陽性率為63.6%；但聯合ELISPOT檢測的陽性率將達到90.9%，表明IGRAs聯用TST有利于提高對密切接觸者中高風險人群篩查診斷的敏感度，可以發現絕大部分(10/11)密切接觸者中的LTBI患者。對1例IGRAs和TST檢測均陰性的患者的臨床資料進行核查，確認肺結核的診斷。該患者年齡為73歲，無合并其他疾病，外周血T淋巴細胞計數正常；因此，考慮是年齡大、免疫抑制導致的ELISPOT和TST檢測結果陰性，但確切的原因尚需要進一步研究確定。另外，在隨訪中筆者發現11例新發活動性肺結核有5例在隨訪6個月發病，5例在隨訪1年時發病，1例在隨訪2年時發病，提示我們隨訪篩查高危人群，大部分活動性結核病患者的密切接觸者發病時間發生在18個月內，這提示在日后對結核病患者的密切接觸者隨訪時間至少要延長到18個月以上。

動物實驗中，暴露的細菌濃度越高，感染的機會越多。流行病學結果是暴露于結核分枝桿菌載量越高的傳染源的密切接觸者，其發生感染的風險越高[6]。然而本研究的結果說明，無論是密切接觸者的IGRAs還是TST檢測陽性率均與傳染源的AFB的等級沒有相關性。這一結果提示，肺結核傳染性的高低不能依靠痰涂片結果來確定，涂片陰性者仍然有傳染性。但有必要指出，筆者選擇138例完成了2年隨訪的密切接觸者進行分析，不能代表所有的密切接觸者的情況。另外，痰涂片AFB分級是一個粗略的定量手段，不夠精確；也不能排除IGRAs和(或)TST檢測敏感度有局限性的問題。

最后，有必要指出的是，本研究隨訪發現的11例新發肺結核患者中，有27.3% 為IGRAs檢測陰性，有36.4% 為TST檢測陰性。這一結果表明，無論是ELISPOT還是TST檢測，其在密切接觸者中篩查發現新發患者的敏感度均不足。因此，在臨床實踐中，尤其是在新的有效篩查檢測方法面世之前，應該在做IGRAs檢測的同時聯合常規癥狀和胸部影像學檢查結果加以綜合考慮，以期提高早期發現的敏感度和準確率。

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(本文編輯：薛愛華)

Evaluation of interferon-gamma release assays and tuberculin skin test in screening active tuberculosis and latent tuberculosis infection in close contacts of pulmonary tuberculosis patients

LI Jin, YANG Qian-ting, YUE Jian-rong, LIN Ling, ZHANG Ming-xia, GU Mei-hong, DENG Qun-yi, DENG Guo-fang, DENG Yong-cong, CHEN Xin-chun.

Shenzhen Key Laboratory of Infection and Immunity, Guangdong Key Laboratory of Diagnosis and Treatment of Emerging Infectious Diseases, Guangdong Medical College, Shenzhen Third People’s Hospital, Shenzhen 518020,China

CHEN Xin-chun, Email: chenxinchun@hotmail.com

Objective To evaluate the efficiency of interferon release assays (IGRAs) and tuberculin skin test (TST) in screening active tuberculosis (TB) and latent tuberculosis infection (LTBI) in close contacts of pulmonary TB patients. Methods Samples of 138 close contacts of TB patients from family members (60 cases) and colleagues (78 cases) were collected. ELISPOT test (ELISPOT) and TST parallel detection were done every six months during the whole process of 24 months. Statistical analysis of the relationship between the results and disease occurrence andMycobacteriumtuberculosisexposure was performed. Results Among 138 close contacts who completed 5 times of follow-up detection in a period of 24-month, 11 cases developed to active PTB. Of the 11 patients, the positive rate of first ELISPOT was 72.7% (8/11), which was significantly higher than that of the unaffected (33.1%, 42/127)(χ2=6.8905,P=0.0087).While the positive rates of first TST were 63.6% (TB) and 66.9% (unaffected) respectively, and the difference was not statistically significant (χ2=0.0494,P=0.8241). ELISPOT positive rate was correlated to the degree of exposure toMycobacteriumtuberculosis.In high level exposure close contacts (families), ELISPOT positive rate was 45.0% (27/60), which was significantly higher than the low level exposure colleagues (28.2%, 22/78)(χ2=4.1773,P=0.0410). While TST positive rates among the high and low level exposure group were 55.0% (33/60) and 75.6% (59/78) respectively, which was inconsistent withMycobacteriumtuberculosisexposure level. Conclusion Compared to TST, IGRAs-ELISPOT has higher specificity in high risk population in close contacts of PTB cases, and is more accurate in the detection of active TB and LTBI in close contact of PTB patients.

Tuberculosis, pulmonary/diagnosis； Contact tracing； Interferon-gamma release tests； Tuberculin test; Enzyme-linked immunospot assay； Follow-up studies

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.007

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003004-002-006)；廣東省醫學科研基金(B2014354)；深圳市科技計劃項目(JCYJ20130329171031741)

5180202 廣東醫學院附屬深圳市第三人民醫院深圳市感染免疫重點實驗室 廣東省新發傳染病診治重點實驗室(李晉、楊倩婷、林玲、張明霞、顧美紅、陳心春)，內科(岳建榮、鄧群益、鄧國防、鄧永聰)

陳心春，Email：chenxinchun@hotmail.com

2015-02-11)