γ干擾素釋放試驗在不同年齡活動性結核病患兒診斷中的應用價值

孫琳 田建嶺 尹青琴 李潔瓊 郭雅潔 綦輝 肖婧 徐放 焦偉偉 申晨 申阿東

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·論著·

γ干擾素釋放試驗在不同年齡活動性結核病患兒診斷中的應用價值

孫琳 田建嶺 尹青琴 李潔瓊 郭雅潔 綦輝 肖婧 徐放 焦偉偉 申晨 申阿東

目的 評價γ干擾素釋放試驗(interferon gamma release assays，IGRAs)在不同年齡活動性結核病患兒診斷中的應用價值。方法 搜集2011年3月至2013年6月期間，我院臨床診斷為活動性結核病的患兒205例、非結核呼吸系統感染患兒867例進行回顧性分析。根據年齡分為不同亞組(0～歲組136例，2～歲組323例，6～歲組312例，10～18歲組301例)，分析IGRAs和結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test, TST)在各亞組中的敏感度、特異度、一致性等。準確度以受試者特征工作曲線下面積(AUC)評價。結果 在總的研究對象中，IGRAs的敏感度(85.4%，175/205)與TST試驗(81.5%，167/205)接近(χ2=1.128，P>0.05)；在0～歲組患兒中，IGRAs的敏感度(80.0%，24/30)高于TST(53.3%，16/30)(χ2=0.03，P>0.05)，但差異無統計學意義。在各年齡組中IGRAs的特異度均顯著高于TST(0～歲，99.1% 和86.8%，χ2=12.125，P<0.01；2～歲，93.9% 和73.6%，χ2=41.603，P<0.01；6～歲，92.2%和77.0%，χ2=23.948，P<0.01； 10～18歲組，88.8%和65.6%，χ2=33.040，P<0.01)。0～歲組、2～歲組和10～18歲組中IGRAs檢測的AUC(分別為0.895、0.882、0.893)均高于TST(分別為0.701、0.770、0.764)(P值均<0.05)，6～歲組中IGRAs檢測和TST的AUC差異無統計學意義，分別為0.895和0.838，P>0.05；Kappa值均小于0.40。4個年齡組間，IGRAs檢測的AUC差異無統計學意義(P值均>0.05)。IGRAs試驗結果總的不確定率為8.6%(101/1173)，10～18歲組的不確定率顯著低于其他年齡組(0～歲，2～歲，6～歲，10～18歲分別為10.5%，10.0%，8.0%，6.8%，χ2=859.9，P<0.01)。結論 IGRAs在各年齡階段兒童具有較好的敏感度和特異度，在活動性結核病患兒的輔助診斷中均具有一定的應用價值。

干擾素γ釋放試驗； 結核/診斷; 兒童

結核病是當前威脅發展中國家兒童健康的重要原因之一。兒童結核病負擔已經高達全球負擔的10%～20%[1]。兒童作為高危人群，感染Mtb后容易進展為嚴重的活動性結核病。因此，早期對兒童結核病進行診斷并加以控制對于結核病的防控具有非常重要的意義。

目前，結核病的免疫學診斷方法主要包括結核菌素皮膚試驗(tuberculin skin test, TST)和γ干擾素釋放試驗(interferon gamma release assays，IGRAs)。而IGRAs在兒童結核病輔助診斷中的研究較少，尤其是在5歲以下兒童中應用的數據更少。兒童作為一個快速發育的個體，機體抵抗外來病原體的防御能力在不同的年齡段存在顯著差異。5歲以下兒童作為結核病的高風險人群，在感染Mtb的最初2年內，進展為重癥結核病的概率高達20%～40%[2]，因此，更加需要靈敏、準確的方法進行早期診斷。但不同研究者對年齡是否會影響IGRAs試驗的診斷價值仍然存在爭議[3-4]。本研究通過評價IGRAs和TST兩種方法在不同年齡組兒童中的準確性，從而確定IGRAs在不同年齡段兒童結核病診斷中的輔助價值。

資料和方法

一、實驗設計

本研究為基于醫院的診斷研究，目的在于評價IGRAs和TST在臨床實際應用中的價值。對IGRAs和TST兩種方法敏感度的評價，分別在確診活動性結核病患兒(Mtb培養陽性)和臨床診斷的活動性結核病患兒中進行，特異度評價在呼吸系統感染性疾病患兒中進行。

二、研究對象

(一)納入標準

納入研究對象為2011年3月至2013年6月期間，因呼吸系統感染性疾病就診于我院的患兒。根據臨床最終診斷，分為活動性結核病組(簡稱“結核病組”)和呼吸系統感染性疾病組(簡稱“非結核病組”)。

確診活動性結核病患兒：體液標本(痰液、支氣管灌洗液、胃液、腦脊液、胸腔積液等)結核分枝桿菌培養陽性和(或)抗酸染色陽性；臨床診斷的活動性結核病患兒[5-6]：同時具有：(1)存在疑似活動性結核病癥狀；(2)影像學檢查提示活動性結核病存在；(3)抗結核治療有效；(4)有明確的活動性結核病密切接觸史。

呼吸系統感染性疾病組：(1)存在確切的其他病原體感染的證據，如病毒、支原體、肺炎鏈球菌等；(2)存在典型的呼吸系統感染性疾病癥狀；(3)常規抗炎治療后病情好轉或治愈；(4)經臨床診斷為非結核的其他呼吸系統感染性疾病。

(二)排除標準

存在以下情況者不納入本研究：(1)合并血液系統疾病者，如急性淋巴細胞白血病、中性粒細胞缺乏癥、非霍奇金淋巴瘤等；(2)合并免疫系統疾病者，如免疫缺陷病；(3)使用免疫抑制劑者或糖皮質激素治療>1周者；(4)未能同時行IGRAs和TST兩種方法檢測者；(5)IGRAs試驗結果為臨界值者；(6)臨床資料不全者。

(三)研究對象納入

2011年3月至2013年6月期間，共計2827例呼吸系統感染性疾病患兒行IGRAs或TST檢測。根據納入和排除標準，最終1173例患兒納入研究，其中IGRAs試驗結果不確定者有101例，因此，共計1072例患兒納入準確性統計分析(納入和排除流程圖見圖1)。根據最終臨床診斷將其分為結核病組205例和非結核病組867例。患兒臨床資料見表1。

結核病組中，肺結核62例(30.2%)，肺結核合并肺外結核125例(61.0%)，肺外結核18例(8.8%)；非結核病組中，累及氣管及肺部者721例(83.2%)，同時累及氣管、肺部和呼吸系統以外的其他部位者146例(16.8%)，包括合并肝功能損傷43例，胸腔積液29例，心肌損傷19例，關節炎9例，上頜竇炎或鼻炎9例，腦膜炎8例，胃炎7例，腎炎7例，中耳炎5例，胸腔內占位4例，胸膜炎4例，血管炎2例。

圖1 研究對象納入和排除流程

臨床資料例數結核病組非結核病組例數構成比(%)例數構成比(%)年齡(歲) 0～1363014.610612.3 2～3234622.427731.9 6～3124321.026931.0 10～183018642.021524.8 小計1072205100.0867100.0性別 男65212962.952360.3 女4207637.134439.7 小計1072205100.0867100.0卡介苗接種 是94014671.279491.6 否1015225.4495.6 不詳3173.4242.8 小計1072205100.0867100.0

結核病組中有26例(12.7%)為結核分枝桿菌培養陽性，培養陽性標本來源包括痰液4例、支氣管灌洗液9例、胃液11例、胸腔積液1例、腹腔積液1例；12例(5.8%)為抗酸染色陽性的結核病患兒，陽性標本來源包括痰液2例、支氣管灌洗液2例、胃液5例、病理活檢3例。

(四)倫理學

本研究取得了我院倫理委員會的批準。

三、研究方法

1． TST:患兒于入院或者門診就診當天行TST，患兒前臂皮下注射0.1 ml(含5 IU的PPD),注射后48～72 h測量硬結平均直徑(mm)。

TST陽性標準：無硬結或硬結平均直徑<5 mm為陰性(-);5～9 mm為陽性(+)；10～19 mm為中度陽性(++)；≥20 mm為強陽性(+++)；局部除硬結外還有水泡、破潰、淋巴管炎及雙圈反應為極強陽性(++++)。

2．IGRAs:采集受試者外周靜脈血2～4 ml，肝素抗凝，標本采集后室溫放置，并于6 h內進行IGRAs。采用結核感染T細胞免疫斑點試驗(T-SPOT.TB)試劑盒(英國Oxford Immunotec 公司生產)進行檢測，具體操作及結果判斷，按試劑盒說明書步驟進行。

IGRAs采用植物血凝素作為陽性對照抗原，用以評估受試者外周靜脈血中T細胞的反應活性。

T-SPOT.TB結果判讀：

(1)陽性判斷標準：滿足以下任一項即為陽性。①空白對照孔斑點數為0～5個，且“抗原A或抗原B孔斑點數-空白對照孔斑點數”≥6個；②空白對照孔斑點數為6～10個，且“抗原A或抗原B孔的斑點數為空白對照孔斑點數的2倍及以上”即判為陽性結果。

(2)陰性判斷標準：陽性質控對照孔結果良好(斑點數≥20)，但抗原A或抗原B孔斑點數均達不到陽性標準。

(3)不確定結果：陽性對照孔斑點數低于20個者。

(4)臨界值結果：檢測孔A或B斑點數在4～8之間。

四、統計學分析

分析參數包括敏感度、特異度、陽性預測值、陰性預測值、陽性似然比、陰性似然比、一致性等。IGRAs和TST敏感度和特異度比較采用McNemar檢驗，計數資料以百分比表示，以受試者工作特征(receiver operating characteristic, ROC)曲線評價診斷價值。兩個試驗的一致性采用一致性檢驗，用Kappa(K)值表示，K值>0.75表示一致性高，K值在0.40和0.75之間表示一致性中等，K值<0.40則表示一致性差。IGRAs試驗結果不確定者，未進入準確性分析。采用SPSS 11.5軟件進行統計學分析。

結 果

一、IGRAs和TST兩種方法在各年齡組的準確性分析

1. 敏感度分析：在總的研究對象中，IGRAs的敏感度與TST接近，分別為85.4% (175/205)和81.5%(167/205)，二者差異無統計學意義(P>0.05)。在0～歲組的活動性結核病患兒中，IGRAs的敏感度高于TST，分別為80.0% (24/30)和53.3%(16/30)，但二者差異無統計學意義(P>0.05)。在其他年齡組中，兩種方法的敏感度差異無統計學意義(P值均>0.05)(表2)。

在各年齡組間進行比較，IGRAs的敏感度差異無統計學意義(P>0.05)；而TST在0～歲組的敏感度僅有53.3%，顯著低于其他年齡組(P值均<0.01)。

在各年齡組中，IGRAs的陽性預測值和陽性似然比均高于TST；在0～歲組中，IGRAs的陰性預測值和陰性似然比均低于TST，在其他3個年齡組中數值接近(表2)。

在Mtb培養和抗酸染色陽性的38例結核病患兒中，36例IGRAs檢測陽性，其敏感度為94.7%；28例為TST陽性，其敏感度為73.7%，二者差異有統計學意義(χ2=6.333，P<0.05)。其中26例Mtb培養陽性患兒IGRAs檢測均為陽性(100.0%)，12例抗酸染色陽性患兒中10例(83.3%)IGRAs檢測陽性。在病原學陰性(Mtb培養和抗酸染色陰性)的167例結核病患兒中，IGRAs和TST的敏感度均為83.3%(χ2=0，P>0.05)。

表2 不同分析參數在IGRAs和TST檢測不同年齡組中的統計分析

注 在4個年齡組內，IGRAs與TST的敏感度比較，χ2值分別為4.800、0.072、0.453、0.054，P值均>0.05；在4個年齡組內，IGRAs和TST的特異度比較，χ2值分別為12.125、41.603、23.948、33.040，P值均<0.01

2. 特異度分析：IGRAs的特異度在各個年齡組均顯著高于TST試驗，P值均<0.01；隨著年齡的增長，IGRAs和TST的特異度均逐漸降低，各年齡組間差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

3. IGRAs和TST兩種方法在各年齡組檢測結果的ROC曲線下面積分析： ROC曲線下面積(AUC)顯示，在各年齡組中， IGRAs的AUC均高于TST，(0～歲組，2～歲組，10～18歲組中，P值均<0.05；6～歲組中P>0.05)。而在各年齡組間進行比較，IGRAs的AUC在4個年齡間接近；6～歲組中，TST的AUC高于0～歲和10～18歲組(表3)。

圖2 IGRAs和TST的ROC曲線下面積

表3 IGRAs和TST在4個年齡組中及組間的ROC曲線下面積比較

二、IGRAs和TST兩種方法檢測結果在各年齡組的一致性分析

IGRAs和TST的一致性較差。在各年齡組間，K值均<0.40。在結核病組中，小年齡組的一致率最低，在0～歲組和2～歲組中兩者一致率分別為53.3% (16/30)和67.4% (31/46)。IGRAs和TST檢測結果不一致，以IGRAs檢測陽性和TST檢測陰性為主，在205例結核病患兒中，31例(15.1%)為IGRAs檢測陽性而TST檢測陰性；在0～歲組患兒中，該不一致結果比例高達36.7% (11/30)。

與之相反，在非結核病組中，IGRAs和TST一致率隨年齡增長有降低趨勢。在10～18歲組中一致率僅有74.0% (159/215)。IGRAs和TST檢測結果不一致以IGRAs陰性和TST陽性為主，867例非結核病患兒中，TST陽性的患兒223例，而其中僅有54例(24.2%， 54/223)為IGRAs試驗陽性(表4)。

表4 不同分析參數在 IGRAs和TST檢測結核與非病組中各年齡段的結果分析

注 一致率(%)=IGRAs和TST檢測均陽性患兒的百分比+IGRAs和TST檢測均陰性患兒的百分比

三、IGRAs檢測在各年齡組中的不確定率

IGRAs檢測不確定結果有101例，不確定率為8.6%(101/1173)。隨著年齡增長，IGRAs不確定率逐漸降低，差異有統計學意義(0～歲組，10.5%；2～歲組，10.0%；6～歲組，8.0%； 10～18歲組，6.8%，χ2=859.9，P<0.01)；其中10～18歲組的不確定率最低，顯著低于其他年齡組(χ2值分別為405.2、553.0、562.8，P值均<0.01)。

101例患兒中6例(5.9%)為重癥結核病、20例(19.8%)為重癥支原體肺炎、4例(4.0%)為壞死性肺炎、3例(3.0%)為遷延性肺炎。

討 論

由于兒童活動性結核病的臨床癥狀多樣，影像學特征不典型，病原學檢查陽性率低，給疾病的早期診斷帶來很大的困難和挑戰，常常造成漏診和誤診。因此，加強兒童活動性結核病的早期診斷極其重要。

兒童作為一個特殊的群體，其身體機能都處在不斷成熟和完善過程中。因此，各年齡段兒童的免疫功能發育存在差別。IGRAs的原理基于檢測機體內效應T細胞分泌的γ-干擾素。我院前期的研究數據也顯示，不同年齡段兒童的T淋巴細胞亞群存在差異[7]。因此，本研究將年齡作為一個主要研究因素，分析IGRAs和TST在不同年齡階段兒童中的診斷價值。

一、 IGRAs和TST兩種方法在各年齡組的準確性分析

1. IGRAs和TST兩種方法的敏感度及準確性分析：本研究結果顯示，在活動性結核病患兒中，IGRAs檢測的敏感度和AUC在各年齡組間差異無統計學意義。由此可見，IGRAs在兒童活動性結核病的輔助診斷中，在各年齡段均具有較好的準確性。在病原學確診的結核病患兒中，IGRAs檢測的敏感度顯著高于TST。且IGRAs檢測的陽性預測值和陽性似然比均高于TST，提示IGRAs試驗是輔助診斷兒童結核病有效的指標。

在0～歲組兒童中，IGRAs試驗的敏感度顯著高于TST。在年齡越小的患兒中，IGRAs(+)和PPD(-)不一致結果比例越高，即TST的假陰性率、漏診率越高。因此在小年齡組患兒中使用IGRAs可以彌補TST的假陰性結果的不足。

2. IGRAs和TST兩種方法的特異度及準確性分析：IGRAs檢測的特異度在各個年齡組均顯著高于TST，在TST檢測陽性的患兒中，僅24.2%為IGRAs檢測陽性。提示IGRAs在呼吸系統感染患兒中，最大的臨床應用價值在于可有效區分BCG和非結核分枝桿菌(NTM)病導致的PPD交叉反應還是Mtb感染的陽性結果。我國的BCG接種率較高，另外NTM的感染率也呈逐年上升趨勢。已有一系列研究明確了上述兩種因素對TST的影響。然而在進行潛伏結核感染篩查時，關于PPD陽性結果的判讀，尚無可靠的標準來區分Mtb感染還是BCG接種或NTM感染所致。因此，臨床醫師往往根據TST硬結平均直徑進行經驗性判斷：當硬結平均直徑<10 mm時，考慮為BCG接種導致的交叉反應，而當硬結平均直徑>15 mm時才考慮為結核分枝桿菌感染所致。然而有研究已經證明，TST的硬結平均直徑并不是一個準確的診斷指標，大約50%受NTM感染的患兒其直徑>15 mm[8]。因此，僅根據TST進行判斷的話，會出現誤診的可能。另外，NTM感染的治療與抗結核治療方案也存在較大的差異。因此，當出現IGRAs檢測陰性和PPD檢測陽性結果時，應重點排除是否為BCG接種或NTM感染導致的PPD交叉反應。

在本研究中，IGRAs的特異度隨年齡增長而逐漸降低，也從一定程度上反映了結核感染率隨年齡增長的趨勢。同時IGRAs陽性率隨年齡增長的趨勢與我國第四次全國結核病流行病學調查[9]數據一致。IGRAs檢測的特異度與被檢測人群的感染背景相關，即IGRAs檢測結果陽性者很可能就是真正的潛伏結核感染者。被檢測人群的Mtb感染率越高，IGRAs的特異度反而越低。雖然TST的特異度也隨年齡的升高而顯著降低，但其可能的原因除了Mtb感染率隨年齡升高外，年長兒童感染NTM的風險也逐漸升高。因此，TST不能準確地反映被檢測人群的Mtb感染率。已有研究表明，采用TST所得到的Mtb感染情況的調查結果可能過高地估計了我國Mtb感染的狀況[10]。

二、各國關于IGRAs在兒童結核病診斷中的評價研究

關于IGRAs在兒童結核病診斷中的價值仍存在一些爭議。第一，在確診兒童結核病中其敏感度差別較大。有Meta分析結果表明，IGRAs在確診結核病患兒中的敏感度可達80%，遠高于臨床診斷[11]。本研究結果IGRAs檢測的敏感度為85.4%，與其結論一致。也有研究報道IGRAs在Mtb病原確診兒童結核病中的敏感度僅為53%[12]。第二，關于年齡是否影響IGRAs檢測的準確性也持有不同觀點。Nicol等[4]研究結果顯示，IGRAs在小年齡組兒童中的敏感度顯著降低，而Critselis等[3]研究則提示通過IGRAs檢測(采用QuantiFERON-TB Gold-In-Tube 試劑盒)小嬰兒全血中的γ干擾素水平高于青少年，不受年齡影響。第三，IGRAs檢測結果的不確定率在各研究中差別較大。文獻報道IGRAs檢測結果的不確定率的范圍在0%～40%[13-15]。IGRAs檢測結果不確定可能與低齡、免疫缺陷[16]、營養不良和寄生蟲感染[17]等相關。本研究IGRAs檢測的不確定率相對較高，其原因可能與納入研究人群機體的免疫應答能力低有關。在本研究所納入呼吸系統感染性疾病兒童中，包括重癥支原體肺炎、壞死性肺炎等重癥疾病，且小年齡組在重癥疾病占的比例較高，這可能是導致機體的免疫應答能力降低的原因。然而，造成各研究結果不同的原因較多，包括IGRAs檢測所使用試劑盒的不同，納入的研究人群不同(如是否合并HIV感染、BCG接種情況)，以及研究設計合理性和研究方法質量控制等。但關于上述因素與IGRAs結果的相關性仍需要擴大樣本量進一步驗證。

本研究也存在一定的局限性。首先，由于本研究中結核病患兒標本(痰液、支氣管灌洗液、胃液、胸腔積液、腹腔積液、病理活檢)的Mtb培養和抗酸染色的陽性率較低，采用敏感度在病原學確診和臨床診斷的結核病患兒中進行評價，存在一定的多重參照偏倚。因此，我們選擇當前公認的兒童結核病臨床綜合診斷標準，并嚴格篩選患兒，盡量減小此類偏倚。其次，由于缺乏潛伏結核感染診斷的金標準，在呼吸系統感染患兒中可能會存在真正的潛伏結核感染者，采用此類患兒作為對照可能會低估上述試驗的特異度。

綜上所述，相比于TST，IGRAs在各年齡段兒童中具有較高的敏感度和特異度，在各年齡段兒童結核病的輔助診斷中具有一定的臨床應用價值。

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(本文編輯：范永德)

Performance of the interferon gamma release assay for diagnosis of tuberculosis in children in different ages

SUN Lin, TIAN Jian-ling, YIN Qing-qin, LI Jie-qiong,GUO Ya-jie, QI Hui, XIAO Jing, XU Fang, JIAO Wei-wei, SHEN Chen, SHEN A-dong.

Beijing Children’s Hospital Affiliated to Capital Medical University, Beijing Pediatric Research Institute, Key Laboratory of Major Diseases in Children and National Key Discipline of Pediatrics (Capital Medical University), Ministry of Education, Beijing Key Laboratory of Pediatric Respiratory Infection Diseases, Beijing 100045, China

SHEN A-dong, Email：shenad16@hotmail.com

Objective To analyze the performance of interferon gamma release assays (IGRAs) for diagnosis of tuberculosis in children in different age. Methods The diagnostic accuracy of IGRAs and TST were assessed in 205 children with active tuberculosis and 867 children with nontuberculous respiratory infection, who were referred to the Beijing Children’s Hospital during the period from March 2011 through June 2013. Sensitivity, specificity and concordance were calculated between different subgroups classified by different ages (136 cases in 0～y， 323 cases in 2～y， 312 cases in 6～y and 301 cases in 10～18y). The diagnostic accuracy was analyzed by the area under the curve (AUC).The criterion for significance was set asP<0.05. Results The sensitivity of IGRAs (85.4%，175/205) was higher than TST test (81.5%，167/205) in active TB children (χ2=1.128，P>0.05), especially who were younger than 1 year old (IGRAs: 80.0%, 24/30, TST: 53.3%, 16/30,χ2=0.03，P>0.05),but there was no statistical difference. And the specificity of IGRAs was much higher than that of TST in each of the age subgroups (0～y，99.1% vs.86.8%，χ2=12.125，P<0.01；2～y，93.9% vs.73.6%，χ2=41.603，P<0.01；6～y，92.2% vs.77.0%，χ2=23.948，P<0.01；10～18y，88.8% vs.65.6%，χ2=33.040，P<0.01). AUC of IGRAs (0.895, 0.882, 0.893) was much higher than that of TST (0.701, 0.770, 0.764) in 0～y, 2～y and 10～18y subgroups (P<0.05), and AUC of the two tests were similar in 6～y subgroup (IGRAs: 0.895, TST: 0.838,P>0.05).The two test obtained low concordance in the enrolled subjects,kappa<0.40. The AUC of four tests were no statistical difference (P>0.05). The overall proportion of indeterminate results was high (8.6%, 101/1173)， the indeterminate rate of children older than 9 years old was significant lower than the other three groups (10.5% for 0～y，10.0% for 2～y，8.0% for 6～y，6.8% for 10～18y，χ2=859.9，P<0.01). Conclusion IGRAs is a specific and sensitive tool for diagnosis of active tuberculosis in children.

Interferon-gamma release tests; Tuberculosis/diagnosis; Child

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.07.009

首都衛生發展科研專項 (2011-2009-05)；“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003003-004)

100045首都醫科大學附屬北京兒童醫院 北京市兒科研究所結核病研究室 教育部兒科重大疾病研究重點實驗室 兒童呼吸系統感染性疾病研究北京市重點實驗室

申阿東,Email：shenad16@hotmail.com

2015-01-28)