結核病細菌學實驗室設置要求探討

鄧海清 楊蕾 陳成 王國治 陳國慶

?

·專家論壇·

結核病細菌學實驗室設置要求探討

鄧海清 楊蕾 陳成 王國治 陳國慶

依據《實驗室生物安全通用要求》對于生物安全實驗室的規定和《結核病診斷實驗室檢驗規程》對于結核病細菌學實驗室的相關規定，探討了生物安全二級實驗(BSL-2)的基本要求，分析了目前關于BSL-2實驗室存在的問題和不足，對從事結核分枝桿菌分離培養、涉及微生物學技術進行的結核分枝桿菌耐藥檢測與分型鑒定實驗室提出改進的建議，解決該類實驗室存在的生物安全隱患，提高生物安全防護措施，以期得到國家相關部門和同仁的支持。

結核分枝桿菌; 細菌學技術; 實驗室; 安全措施

結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)是引起結核病的病原菌。結核病細菌學實驗室檢測主要實驗過程涉及到結核分枝桿菌的微生物學、免疫學與分子生物學檢測等，根據原衛生部公布的《人間傳染的病原微生物名錄》(以下簡稱《名錄》)[1]，結核分枝桿菌危害程度分類屬于高致病性的第二類病原微生物。結核分枝桿菌可通過呼吸道、消化道和破損的皮膚黏膜等多途徑進入機體，可侵襲機體任何組織、器官引起進行性疾病，且耐藥結核病難以治愈；進行結核分枝桿菌分離培養、涉及微生物學技術的結核分枝桿菌耐藥檢測與分型鑒定工作的實驗室涉及范圍廣、環節多，實驗室的安全防護是否得當直接關系到醫務人員和科研工作者的個人健康，同時合理的實驗室設置也減少了結核分枝桿菌污染環境的可能性。如何合理科學配置結核病細菌學實驗室的設施與設備以確保其安全，是結核病相關醫務人員和科研工作者必須面對的問題。

實驗室基本要求與問題分析

依據《名錄》對結核分枝桿菌不同實驗活動所需生物安全實驗室級別的規定，在實驗室操作涉及到“大量”病原菌的制備，或易產生氣溶膠的實驗操作(如病原菌離心、凍干等)，以及結核分枝桿菌活菌感染的動物實驗應在《實驗室生物安全通用要求(GB19489-2008)》[2](以下簡稱《通用要求》)規定的三級生物安全實驗室(BSL-3)或三級動物生物安全實驗室(ABSL-3)進行。樣本檢測包括樣本的病原菌分離純化、藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)、生化鑒定、免疫學實驗、PCR核酸提取、涂片、顯微觀察等初步檢測和檢驗活動在BSL-2實驗室進行，非感染性材料的不含致病性活菌材料的分子生物學、免疫學等實驗可在BSL-1實驗室進行。依據《名錄》規定，在國內涉及面最廣的臨床結核病實驗室檢測工作在BSL-2實驗室進行。目前，我國對生物安全實驗室基本設施要求強制執行的標準有中華人民共和國住房和城鄉建設部與中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局聯合頒布的《生物安全實驗室建筑技術規范》[3](GB 50346-2011)、中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局和中國國家標準化管理委員會發布的《通用要求》和中國防癆協會在1995年制定并于2006年再版修訂的實驗室常規操作標準《結核病診斷實驗室檢驗規程》[4]，其基本要求如下。

一、BSL-2實驗室建筑基本要求

1. 實驗室建筑要求分類：生物安全實驗室根據所操作致病性生物因子的傳播途徑可分為a類和b類。a類指操作非經空氣傳播生物因子的實驗室；b類指操作經空氣傳播生物因子的實驗室。b1類生物安全實驗室指可有效利用安全隔離裝置進行操作的實驗室；b2類生物安全實驗室指不能有效利用安全隔離裝置進行操作的實驗室。結核病檢測實驗室屬b1類實驗室。

圖1 典型BSL-2實驗室(圖片來源于世界衛生組織《實驗室生物安全手冊(第三版)》[5])

2. 位置要求：BSL-2生物安全實驗室宜實施一級屏障(操作者和被操作對象之間的隔離)和二級屏障(生物安全實驗室和外部環境的隔離)；實驗室與建筑物其他部分可相通，實驗室的走廊和通道應不妨礙人員和物品通過。應設計緊急撤離路線，緊急出口應有明顯的標識。

3. 其他要求：實驗室選址、設計和建造應符合國家和地方環境保護和建設主管部門等的規定和要求。實驗室的安全保衛、防火和安全通道設置應符合國家的消防規定和要求，同時應考慮生物安全的特殊要求；實驗室的建筑材料和設備等應符合國家相關部門對該類產品生產、銷售和使用的規定和要求。應有可靠的電力供應。必要時，重要設備(如：培養箱、生物安全柜、冰箱等)應配置備用電源。

二、BSL-2實驗室設施基本要求

1. 基本布局：實驗室基本布局如圖1所示。BSL-2實驗室在實驗室門口處應設存衣或掛衣裝置，可將個人服裝與實驗室工作服分開放置，靠近實驗室出口宜設置洗手池，必要時應設緊急噴淋裝置；實驗室房間的入口處應有警示和進入限制及可視窗，房間的門根據需要安裝門鎖，門鎖及門的開啟方向應不妨礙室內人員逃生，門鎖應便于內部快速打開。放置生物安全柜實驗間的門應可自動關閉，生物安全柜放置應遠離實驗室入口。

2. 基礎設施要求：實驗室可以利用自然通風，如果采用機械通風，應避免交叉污染。如果有可開啟的窗戶，應安裝可防蚊蟲的紗窗；實驗室應有防止節肢動物和嚙齒動物進入的措施。應設應急照明裝置。供水和排水管道系統應不滲漏，下水應有防回流設計。實驗室內應避免不必要的反光和強光。實驗室的室內環境參數應符合工作要求和衛生等相關要求，機械通風的實驗室溫度在18 ℃～27 ℃，相對濕度在30%～70%，噪聲小于60 dB(A)，平均光照度300 lx。

3. 其他要求：實驗室的墻壁、天花板和地面應易清潔、不滲水、耐化學品和消毒滅菌劑的腐蝕。地面應平整、防滑，不應鋪設地毯。實驗室臺柜和座椅等應穩固，邊角應圓滑。實驗室臺柜等擺放應便于清潔，實驗臺面應防水、耐腐蝕、耐熱和堅固。實驗室應有足夠的空間和臺柜等擺放實驗室設備和物品。應根據工作性質和流程合理擺放實驗室設備、臺柜、物品等，避免相互干擾、交叉污染，并應不妨礙逃生和急救。

三、BSL-2實驗室設備基本配置

1. 生物安全柜：BSL-2實驗室應配備與其實驗活動相匹配的生物安全柜，并按生物安全柜產品的設計要求安裝和使用。如果生物安全柜的排風在室內循環，室內應具備通風換氣的條件；如果使用需要管道排風的生物安全柜，應通過獨立于建筑物其他公共通風系統的管道排出。

2. 滅菌消毒設備：應在實驗室或其所在的建筑內配備高壓蒸汽滅菌器或其他適當的消毒滅菌設備，所配備的消毒滅菌設備應以風險評估為依據。若操作刺激或腐蝕性物質，應在30 m內設洗眼裝置。

四、BSL-2實驗室存在的問題

1. 《名錄》不符合《條例》規定：盡管《名錄》明確規定包括藥敏試驗檢測在內的病原微生物樣本檢測可在BSL-2實驗室進行，但結核分枝桿菌藥敏試驗檢測時已經分離并確定是結核分枝桿菌，根據國務院令第424號《病原微生物實驗室生物安全管理條例》[6](本文簡稱《條例》)第二十一條規定生物安全一級、二級實驗室不得從事高致病性病原微生物實驗活動，《名錄》的規定明顯不符合《條例》規定。

2. 生物安全隱患：根據《通用要求》定義：生物安全實驗室要求生物安全防護水平為二級的實驗室適用于操作能夠引起人類或者動物疾病，但一般情況下對人、動物或者環境不構成嚴重危害，傳播風險有限，實驗室感染后很少引起嚴重疾病，并且具備有效治療和預防措施的微生物；結核分枝桿菌從其分類來看，主要包括國際標準株H37Rv、其減毒株H37Ra和臨床分離株等。臨床分離株又包含敏感、單耐藥、多耐藥、廣泛耐藥、全耐藥等結核分枝桿菌菌株，對于廣泛耐藥、全耐藥結核分枝桿菌目前并無有效的治療藥物。近年來，關于結核病流行病學調查顯示，我國是全球22個結核病高負擔國家之一，患病人數僅次于印度，居世界第二位，其中耐多藥結核病在我國的流行異常嚴重，流行比例為9.3%，約是世界平均水平(4.8%)的2倍[7]，耐多藥結核病(MDR-TB)、廣泛耐藥結核病(XDR-TB)和全耐藥結核病等的出現使得結核病的防控面臨巨大的挑戰，從現有的BSL-2實驗室防護水平來看，存在很大的生物安全隱患，并不能滿足結核分枝桿菌的細菌學檢測等試驗的要求。

3. 結核分枝桿菌獲得性感染：關于結核病實驗室研究人員感染或醫院內相關醫務人員感染的報道也是屢見不鮮，何廣學、韓超楠等[8-9]對國內外結核分枝桿菌感染現狀進行了總結分析，醫務人員獲得性肺結核比例顯著高于一般人群，感染和患病風險明顯高于普通人群；研究表明，醫院內感染暴露因素比較復雜，我國還沒有系統的醫務人員感染結核分枝桿菌和患病篩查、合理的保護措施及有效的監督制度，以及有關這方面的流行病學研究及微生物環境監測，這些都有待進一步完善。國內學者就專門針對實驗室獲得性感染事件進行了統計研究[10]，結核分枝桿菌感染事件高達223例，證明了目前的實驗室安全防護還需要進一步加強和改善。陸兵等[11]報道實驗室獲得性結核分枝桿菌感染主要為吸入感染，因設備故障或缺陷、銳器損傷或擦傷、操作失誤、呼吸暴露(多數為未進行有效的呼吸防護)而造成感染。值得注意的是，所有實驗室獲得性結核分枝桿菌感染事件中，未見BSL-3實驗室發生結核分枝桿菌感染的報道，未見充分呼吸防護后發生結核分枝桿菌感染的報道。這也說明了一個問題，現有的BSL-2實驗室的設計與要求存在不足，普通的BSL-2 實驗室對于結核分枝桿菌的感染不能進行有效的防護。

4. 建議：我國對BSL-3實驗室硬件要求高于WHO生物安全手冊的規定。而且，根據《條例》規定，建立BSL-3實驗室應在國家生物安全實驗室體系規劃內并依法履行有關審批手續；要經國務院科技主管部門、環境保護主管部門審查同意；實驗室建成后要通過認證認可監督管理部門確定的認可機構進行實驗室認可；實驗目的和擬從事的實驗活動要通過國務院衛生主管部門審查。因此從事結核分枝桿菌檢測均在BSL-3實驗室進行并不現實。根據上述情況，結核分枝桿菌檢測實驗室需要加強生物安全防護而又無法在BSL-3實驗室工作情況下，以世界衛生組織《實驗室生物安全手冊(第三版)》[5]中生物防護三級實驗室為參考模板，建立符合中國國情的負壓結核分枝桿菌檢測BSL-2實驗室是解決結核分枝桿菌檢測實驗室生物安全防護的有效方法。

實驗室改進建議

一、負壓結核分枝桿菌檢測BSL-2實驗室建筑與布局要求

實驗室應與同一建筑內自由活動區域分隔開，具體可將實驗室置于走廊的盲端，或設隔離區和隔離門。實驗室宜設立雙緩沖間(即雙門通過間)，緩沖間和鄰近空間應保持壓差，緩沖間的門可自動關閉且互鎖，配備有能擊碎的面板供緊急撤離時使用，窗戶應關閉、密封、防碎。在每個出口附近安裝不需用手控制的洗手池或手消毒裝置，生物安全柜的安裝位置應遠離人員活動區，且避開門和通風系統的交叉區，負壓結核分枝桿菌檢測實驗室平面布局見圖2。

圖2 負壓結核分枝桿菌檢測BSL-2實驗室示意圖(圖片來源于世界衛生組織《實驗室生物安全手冊(第三版)》[5])

二、負壓結核分枝桿菌檢測BSL-2實驗室設施要求

防護實驗室中應配置用于污染廢棄物消毒的高壓滅菌器，如果感染性廢棄物需運出實驗室處理，則必須根據國家或國際的相應規定，密封于不易破裂的、防滲漏的容器中；供水管必須安裝防逆流裝置；真空管道應采用裝有液體消毒劑的防氣閥和高效空氣過濾器(high efficiency particulate air filter，HEPA)或相當產品進行保護；備用真空泵也應用防氣閥和過濾器進行適當保護，實驗室應密封；需建造空氣管道通風系統以進行氣體消毒；可視傳遞窗應設計為單向開啟且有滅菌設備(如紫外燈等)，進入物品直接由傳遞窗進入，經過處理后的廢棄物由傳遞窗傳出并按規定處理；靠近走廊一側或入口應設置為可視窗以方便實驗室外人員觀察實驗室動態和安全情況或外來人員參觀。

三、負壓結核分枝桿菌檢測BSL-2實驗室空調凈化系統基本要求

負壓結核分枝桿菌檢測實驗室須建立可使空氣定向流動的可控通風系統，以確保實驗室內氣流由緩沖間向核心工作區域定向流動。在構建通風系統時，應保證從生物安全實驗室內所排出的空氣不會逆流至該建筑物內的其他區域，空氣經HEPA過濾后排出建筑以外。應安裝直觀的監測系統，以便工作人員可以隨時確保實驗室內維持正確的定向氣流，該監測系統可帶也可不帶警報系統。可以安裝取暖、通風和空調(Heating, ventilation and air conditioning，HVAC)控制系統來防止實驗室出現持續正壓，應考慮安裝視聽警報器，向工作人員發出HVAC系統故障信號。

四、負壓結核分枝桿菌檢測實驗室安全柜選擇與安裝要求

1. 不涉及揮發性化學物質的安全柜選擇：在實驗室實驗內容中不涉及揮發性化學物質時選擇外排風式A2 型Ⅱ級生物安全柜，安全柜的設計使用“套管(thimble)”或“傘形罩(canopyhood)”連接。套管安裝在安全柜的排風管上，將安全柜中需要排出的空氣應通過獨立于建筑物其他公共通風系統的管道排出。在套管和安全柜排風管之間保留一個直徑差通常為2.5 cm 的小開口，以便讓房間的空氣也可以吸入到獨立排風系統中，這種安全柜的開啟或關閉不影響室內壓力，節約能源且易于安裝。

2. 涉及揮發性化學物質的安全柜選擇：在實驗室實驗內容中涉及揮發性化學物質時選擇Ⅱ級B2 型安全柜，也稱為全排放型安全柜，可用于操作少量揮發性化學品和放射性核素。如果選擇Ⅱ級B2 型生物安全柜，必須是連接到專門的排風系統，建筑物排風系統的排風量和靜壓必須與生產商所指定的要求完全一致。

結 論

由于結核分枝桿菌的特殊性，主要以空氣傳播、氣溶膠感染為主，生物安全防護問題相對于其他病原微生物顯得更為重要。目前國內大部分結核病專科醫院、結核病防治所、疾病預防控制中心等的研究實驗室多為BSL-2實驗室，條件雖然有很大的改善，但離三級防護還有一定差距，因結核病患者或者含結核分枝桿菌活菌的標本較為集中，空氣中結核分枝桿菌的含量也可能高于其他正常區域，存在發生醫院內或者實驗室內感染的風險，加之近年來越來越嚴重的耐藥結核分枝桿菌的檢出，大多數處于一線基層的實驗人員感染結核分枝桿菌的風險遠高于普通人群，對自身安全問題構成了嚴重的挑戰。隨著結核病患者的耐藥率逐年升高，相關實驗室的建設、設施的要求、人員的防護等一系列生物安全問題就應該成為首要問題。

考慮到BSL-3實驗室從實驗室選址、總體設計、設施要求甚至到水電氣設施要求等都有明確的規定，要求極高，成本大大增加，鑒于中國的實際國情，需要將所有結核分枝桿菌細菌學檢測實驗室都按BSL-3實驗室標準建設是不切實際的，目前有效的措施應該是對現有的BSL-2實驗室設計與設施進行改造，建立符合中國國情的結核分枝桿菌BSL-2實驗室。建立這樣的負壓實驗室也需要花費不少人力、財力等，經費問題是首要問題。為了醫務工作者和結核病相關研究人員的健康，更為了整個醫療事業的穩步發展，希望我國政府相關部門能夠給予一定的經費支持，建議國家主管部門制定相關的補充規定，保證相關工作能夠得到順利實施。

[1] 中華人民共和國衛生部. 人間傳染的病原微生物名錄. 北京：中華人民共和國衛生部辦公廳，2006：21-28.

[2] 中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會. 實驗室生物安全通用要求(GB19489-2008). 北京：中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局，中國國家標準化管理委員會，2008: 6-10.

[3] 中華人民共和國住房和城鄉建設部，中華人民共和國國家質量監督檢驗檢疫總局. 生物安全實驗室建筑技術規范. 北京：中國建筑工業出版社，2011: 5-10.

[4] 中國防癆協會基礎專業委員會. 結核病診斷實驗室檢驗規程. 北京：中國教育文化出版社, 2006: 1-7.

[5] World Health Organization. Laboratory biosafety manual. 3rd ed. Geneva: World Health Organization, 2004: 14-21.

[6] 中華人民共和國國務院. 病原微生物實驗室生物安全管理條例. 2004-11-12.

[7] 中華人民共和國衛生部. 全國結核病耐藥性基線調查報告(2007—2008年). 北京:人民衛生出版社, 2009：1-10.

[8] 何廣學, 熊勇超, 侯月云, 等. 國內外結核感染控制現狀與對策. 結核病與肺部健康雜志, 2012, 1(1): 52-54.

[9] 韓超楠, 肖和平. 醫院潛伏性結核分枝桿菌感染. 結核病與肺部健康雜志, 2012，1(1): 66-69.

[10] 周乙華, 莊輝. 實驗室感染與生物安全. 中華預防醫學雜志, 2005，39(3): 215-217.

[11] 陸兵, 劉秋煥, 王榮, 等. 結核分枝桿菌實驗室獲得性感染事件分析. 中國防癆雜志, 2012，34(5): 333-335.

(本文編輯：郭萌)

Discussion on the setup requirements of Mtb laboratory

DENG Hai-qing, YANG Lei, CHEN Cheng, WANG Guo-zhi, CHEN Guo-qing.

Division of Tuberculosis Vaccines, National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China

CHEN Guo-qing, Email: chengq@nicpbp.org.cn

According to the provisions of “Laboratories-GeneralRequirementsforBiosafety” for the biosafety laboratory and “TheTestProceduresofTuberculosisDiagnosticLaboratory” for theMycobacteriumtuberculosis(Mtb) bacteriology testing laboratories, in this paper we explore the basic requirements and shortcomings of the biosafety level Ⅱ(BSL-2) laboratory to offer some suggestions for the biosafety of Mtb bacteriology testing laboratory which can conduct Mtb isolating, culturing, drug susceptibility testing and genotyping and so on. It might contribute to similar settings and peers.

Mycobacteriumtuberculosis; Bacteriological techniques; Laboratories; Security measures

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.02.001

國家食品藥品監督管理總局研究課題資助課題(M201405)

100050 北京，中國食品藥品檢定研究院結核疫苗室(鄧海清、楊蕾、陳成、王國治、陳國慶)；溫州醫科大學環境與公共衛生學院(鄧海清、陳成)

陳國慶，Email：chengq@nicpbp.org.cn

2014-11-20)