耐多藥結核分枝桿菌對環絲氨酸、對氨基水楊酸的耐藥性及其與基因型關系分析

楊健 逄宇 趙雁林 張天華 王西娣 陳美齡 李妍 王蕊

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·論著·

耐多藥結核分枝桿菌對環絲氨酸、對氨基水楊酸的耐藥性及其與基因型關系分析

楊健 逄宇 趙雁林 張天華 王西娣 陳美齡 李妍 王蕊

目的 評價耐多藥結核分枝桿菌菌株對環絲氨酸(Cs)和對氨基水楊酸(PAS)兩種二線抗結核藥物的耐藥性并分析耐藥表型與基因型之間的關聯，為我國耐多藥結核病的治療提供科學依據。方法 從2007年全國耐藥基線調查點收集的菌株中選取196株耐多藥結核分枝桿菌菌株，采用微孔板Alamar blue顯色法分別測定對Cs和PAS的最低抑菌濃度(MIC)，并采用間隔區寡核苷酸分型法(Spoligotyping)對其進行基因分型。北京基因型與非北京基因型對Cs和PAS耐藥率比較采用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。結果 196株耐多藥結核分枝桿菌菌株中對Cs耐藥為44株，耐藥率為22.4%(44/196)；對PAS耐藥為34株，耐藥率為17.3%(34/196)。在耐Cs的耐多藥結核分枝桿菌菌株中北京基因型為34株，耐藥率為21.0%(34/162)；34株非北京基因型菌株中耐Cs為10株，耐藥率為29.4%(10/34)；兩者耐藥率差異無統計學意義(χ2=1.15，P>0.05)。在耐PAS的耐多藥結核分枝桿菌菌株中北京基因型為26株，耐藥率為16.0%(26/162)；34株非北京基因型菌株中耐PAS為8株，耐藥率為23.5%(8/34)；兩者耐藥率差異無統計學意義(χ2=1.10，P>0.05)。結論 我國耐多藥結核分枝桿菌對二線抗結核藥物Cs和PAS的耐藥率處于較高水平。北京基因型家族是我國耐多藥結核分枝桿菌中主要流行的菌株，北京基因型與非北京基因型的耐多藥結核分枝桿菌菌株對Cs和PAS兩種二線抗結核藥物耐藥率差異無統計學意義。

結核分枝桿菌; 抗藥性,多種,細菌; 環絲氨酸； 氨基水楊酸； 基因型

耐藥結核分枝桿菌的出現，特別是耐多藥結核病 (至少對異煙肼和利福平同時耐藥的結核病)患者的出現是造成結核病疫情居高不下的重要原因之一。我國是全球22個結核病高負擔國家之一，也是全球27個耐藥結核病高負擔國家之一[1]。根據WHO《全球結核病控制2010年報》估算，我國結核病年發病患者例數僅次于印度，居世界第二位，而耐藥結核病患者例數居世界首位[2]。全國結核病耐藥性基線調查報告(2007—2008)顯示：涂陽肺結核患者分離的結核分枝桿菌耐多藥率為8.32%，廣泛耐藥率為0.68%，尤以復治患者的耐藥性為嚴重(耐多藥率為25.64%，廣泛耐藥率為2.06%)[3]。隨著耐多藥結核病患者的日趨增多，異煙肼和利福平等一線抗結核藥物常不能滿足臨床治療的需要，在我國耐多藥結核病的治療主要依靠二線抗結核藥物，其中阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)、氧氟沙星(Ofx)等藥物在治療耐多藥結核病中起著非常重要的作用,而中國對以上二線抗結核藥物耐藥性研究較為普遍，但目前尚缺乏耐多藥結核病患者對環絲氨酸(Cs)的耐藥性的分析。近年來，“北京基因型家族”菌株在結核分枝桿菌的研究中受到廣泛關注。這些菌株傳播廣泛，有時可引起大范圍的結核病暴發，在某些情況下又與耐藥性有聯系。因此筆者選取2007年全國耐藥基線調查點收集分離的196株耐多藥結核分枝桿菌菌株，主要探討Cs及對氨基水楊酸(PAS)兩種二線抗結核藥物的耐藥性及耐藥表型與基因型之間的關系。

材料和方法

一、菌株來源

2007年全國耐藥基線調查點收集的部分菌株，經羅氏培養、生化鑒定并進行比例法藥敏試驗鑒定為耐多藥結核分枝桿菌的菌株，共收集菌株196株。其來源分布見表1，標準菌株H37Rv來源于國家參比實驗室菌株庫保存標準株。

二、試劑和培養基來源

6種藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)培養基和對硝基苯甲酸(PNB)培養基、噻吩-2-羧酸肼(TCH)培養基、改良羅氏培養基(L-J)均購自珠海貝索生物技術有限公司，藥粉購自美國Sigma-Aldrich公司，7H9液體培養基(7H9粉、OADC)購自美國BD公司，Alamar blue顯色液購自美國BIO-RAD公司。

表1 196株耐多藥結核分枝桿菌菌株來源分布情況

三、方法

(一)藥敏試驗及菌種鑒定

藥敏試驗及分枝桿菌菌種鑒定按照文獻[4]操作，藥敏試驗采用比例法，培養基內藥物終濃度分別為異煙肼(INH)0.2 μg/ml、利福平(RFP)40 μg/ml、乙胺丁醇(EMB)2 μg/ml、鏈霉素(Sm)4 μg/ml、卡那霉素(Km)30 μg/ml、氧氟沙星(Ofx)2 μg/ml。采用PNB生長試驗和TCH生長試驗對分枝桿菌進行菌種鑒定，培養基中PNB濃度為500 mg/ml、TCH濃度為5 mg/ml。

(二)Cs和PAS的最低抑菌濃度(MIC)測定

采用微孔板Alamar blue顯色法，操作方法參照文獻[5]，使用7H9液體培養基(7H9∶OADC=9∶1)，MIC測定的藥物濃度：Cs為0.5～512 μg/ml，PAS為0.25～256 μg/ml。藥物臨界值參照文獻[5]推薦的臨界濃度，Cs為2.5 μg/ml，PAS為2 μg/ml。取改良羅氏培養基中傳代3周后生長良好的菌落進行磨菌、比濁、制備1 mg/ml菌懸液，接種到稀釋成不同藥物濃度梯度的7H9液體培養基上，37 ℃孵育1周后加Alamar blue顯色液顯色。以標準菌株H37Rv作為對照。

(三)采用間隔區寡核苷酸分型方法(Spoligotyping法)進行檢測

1. DNA模板的制備：實驗菌株采用羅氏培養基常規培養3～4周，用生理鹽水從L-J培養基斜面上洗脫菌體，吸取菌懸液1 ml于無菌1.5 ml離心管中，80 ℃ 30 min滅活， 12 000×g離心5 min后倒掉上清液，菌體沉淀用500 μl TE緩沖液充分懸浮，95 ℃水浴30 min，12 000×g離心3 min，取上清液即為DNA模板。

2. DR區(又稱直接重復區，不同菌株間或同一株菌株內的直接重復區序列高度保守，而間隔區的數量和序列存在多態性，通過比較間隔序列的多態性可以區分不同基因型的菌株)序列PCR擴增：使用Spoligotyping法對菌株的DR區域進行鑒定分型，操作流程按照試劑盒提供的說明書進行(荷蘭，Isogn Bioscience BV公司)。引物的序列為DRa：5′-GGT TTT GGG TCT GAC GAC-3′，5′端用生物素標記，用于雜交后發光檢測；DRb：5′-CCG AGA GGG GAC GGA AAC-3′，以耐多藥結核分枝桿菌菌株基因組DNA為模板進行擴增。PCR反應體系采用50 μl反應體系：PCR預混液25 μl(北京，Genstar公司)，DRa 4 μl， DRb 4 μl，DNA模板5 μl，無菌去離子水12 μl。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性40 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸30 s，35個循環；72 ℃延伸10 min，擴增整個直接重復(DR)區。同時擴增標準菌株H37Rv、卡介苗(BCG)作為對照。

3. DNA雜交：PCR產物用150 μl 2×SSPE(緩沖液)/0.1%十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)稀釋，95 ℃變性10 min，立即置于冰水浴中。用250 ml 2×SSPE/0.1%SDS 60 ℃洗膜5 min，置于Miniblotter雜交板內，探針方向與狹縫垂直，吸凈狹縫剩余液體，按標本順序將稀釋的PCR產物加入到雜交板的狹縫中，同時加入標準菌株H37Rv、BCG、空白作為對照組，在水平面60 ℃雜交1 h。

4.檢測：吸出狹縫中雜交液，用2×SSPE/0.5% SDS于60 ℃洗膜10 min，加入15 ml鏈霉親和素-過氧化物酶偶聯溶液(15 ml 2×SSPE/0.5%SDS加7.5 μl 500 U/ml鏈霉親和素-過氧化物酶偶聯物)，42 ℃孵育60 min，用2×SSPE/0.5% SDS 42 ℃洗膜2次，2×SSPE室溫洗膜2次，使用化學發光系統對膜上的雜交信號進行收集。

5.質量控制：藥敏試驗、MIC試驗均設H37Rv標準菌株作為質控株，菌種鑒定實驗在高稀釋度菌液對照培養基上生長菌落少于20株，均進行重復試驗。間隔區寡核苷酸分型試驗均以標準菌株H37Rv、BCG作為質控株，如與標準條帶不符合則進行重復試驗。

(四)統計學分析

所有Spoligotyping數據提交至國際數據庫MIRU-VNTRplus和SpolDB 4.0進行基因型比對。采用SAS 9.2統計學軟件進行統計學分析，北京基因型與非北京基因型對Cs和PAS耐藥率比較使用卡方檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

一、196株耐多藥結核分枝桿菌菌株對Cs和PAS的MIC值分布

結果顯示196株耐多藥結核分枝桿菌菌株中Cs耐藥為44株，敏感為152株，耐藥率為22.4%；其中耐藥菌株主要分布在藥物濃度為2.50 μg/ml和8.00 μg/ml的培養基上，分別為22株(11.2%)和8株(4.1%)；敏感株分布在藥物濃度為0.50 μg/ml的培養基上50株(25.5%)，濃度為1.00 μg/ml者54株(27.6%)，濃度為1.25 μg/ml者48株(24.5%)(表2)。PAS耐藥為34株，敏感為162株，耐藥率為17.3%；耐藥株主要分布在藥物濃度為8.00 μg/ml、16.00 μg/ml、256.00 μg/ml的培養基上，分別為4株(2.0%)、4株(2.0%)、10株(5.1%)(表3)。

表2 不同Cs濃度在196株耐多藥結核分枝桿菌菌株中的分布

注 Cs的MIC臨界濃度為2.5 μg/ml

表3 不同PAS濃度在196株耐多藥結核分枝桿菌菌株中的分布

注 PAS的MIC臨界濃度為2.0 μg/ml

二、196株耐多藥結核分枝桿菌菌株在Spoligotyping法中的基因型分布

本研究共分離得到196株耐多藥結核分枝桿菌菌株，96.4%(189/196)菌株基因型為數據庫MIRU-VNTRplus和SpolDB 4.0內所包含，7株沒有匹配到結果，為新發現基因型。其中北京基因型菌株162株，占82.7%(162/196)；北京基因型中非典型北京基因型2株，占1.0%(2/196)。非北京基因型菌株34株，占17.3%(34/196)。非北京基因型中T1基因型14株，占7.1%(14/196)，非北京基因型中T2基因型11株，占5.7%(11/196)，MANU2基因型1株，占0.5%(1/196)，S基因型1株，占0.5%(1/196)；新發現基因型為7株，共占3.6%(7/196)(表4)。

三、196株耐多藥結核分枝桿菌不同基因型的Cs和PAS耐藥情況比較

在耐Cs的耐多藥結核分枝桿菌菌株中，北京基因型為34株，耐藥率為21.0%(34/162)；34株非北京基因型菌株中耐Cs為10株，耐藥率為29.4%(10/34)；兩者耐藥率差異無統計學意義(χ2=1.15，P>0.05)。在耐PAS的耐多藥結核分枝桿菌菌株中，北京基因型為26株，耐藥率為16.0%(26/162)；34株非北京基因型菌株中耐PAS為8株，耐藥率為23.5%(8/34)；兩者耐藥率差異無統計學意義(χ2=1.10，P>0.05)(表5)。

表4 196株耐多藥結核分枝桿菌菌株在Spoligotyping法中的基因型分布

注a：數據庫MIRU-VNTRplus和SpolDB 4.0中的SIT[Spoligotyping international type(間隔區寡核苷酸分型法國際類型)，是數據庫定義的一個編碼系統，便于索引和匹配]編號；“-”：數據庫中無匹配結果；序號1～7為北京基因型，共計162株；序號8～20為非北京基因型，共計34株

表5 不同基因型耐藥率的比較

討 論

耐藥結核病的發生及其流行已成為全球結核病控制的一大難題，為治療耐多藥結核病，二線抗結核藥物得到廣泛應用，對其耐藥性也隨之增高。

一、196株耐多藥結核分枝桿菌菌株對Cs耐藥性分析

早在利福平問世以前，Cs即已成為復治結核病化學治療方案中的主要藥物。近年來耐多藥結核病患者日趨增多，異煙肼和利福平等一線抗結核藥物常不能滿足臨床治療的需要，Cs對結核病的低耐藥率受到重視。Cs為D-丙氨酸類似物，可抑制丙氨酸消旋酶、合成酶，抑制細胞壁黏肽產生，使結核分枝桿菌的細胞壁缺損和耐酸能力減弱，起到殺菌和抑菌作用[6]。Cs的耐藥率較低，與其他抗結核藥物不發生交叉耐藥，在用藥過程中不易產生耐藥性。

據文獻報道，1993—2007年荷蘭的131例耐多藥結核病患者二線抗結核藥物藥敏試驗中，只有1例對Cs耐藥，耐藥率為0.8%[7]，2005年俄羅斯耐多藥結核分枝桿菌的Cs耐藥率為7.4%，1995—2011年中國香港耐多藥結核分枝桿菌中的Cs耐藥率只有8.6%[8]。綜合以上研究資料來看，Cs較其他二線抗結核藥物耐藥率低，本研究結果:196株耐多藥結核分枝桿菌菌株中對Cs耐藥株為44株，耐藥率為22.4%，其主要分布在濃度為2.5 μg/ml和8 μg/ml，分別為22株和8株，屬于低濃度耐藥，與荷蘭、俄羅斯、中國香港地區相比耐藥率處于較高水平，可能與我國是全球結核病高負擔大國，地廣人多、經濟發展不平衡，耐藥結核病情況差異較大[3]和在治療過程中藥物的不規范使用等多種因素有關，這有待于下一步的研究探討。

二、196株耐多藥結核分枝桿菌菌株對Cs耐藥性分析

PAS的作用機制尚未肯定，一般認為對氨基水楊酸鈉化學結構與對氨基苯甲酸(PABA)相似，可競爭性抑制二氫葉酸合成酶，使二氫葉酸合成障礙，造成蛋白質合成受阻，使細菌不能繁殖。據文獻報道：1993—2007年荷蘭的131株耐多藥結核分枝桿菌中PAS耐藥率為4.6%[7]；國內對耐多藥結核分枝桿菌中PAS的耐藥率也有很多報道：2006—2007年北京43株耐多藥結核分枝桿菌中PAS耐藥率為9.3%[9]，2009年上海431株耐多藥結核分枝桿菌中PAS耐藥率為8.1%[10]，2008—2009年浙江25株耐多藥結核分枝桿菌菌株中對PAS的耐藥率為32.7%[11]，2008—2010年江西萍鄉22株耐多藥結核分枝桿菌菌株中對PAS的耐藥率為45.5%[12]，2010—2012年江蘇無錫77株耐多藥結核分枝桿菌菌株中對PAS的耐藥率為33.8%[13]，從以上數據來看，各地耐多藥結核分枝桿菌菌株對PAS耐藥率高低各不相同，存在明顯地區差異。本研究196株耐多藥結核分枝桿菌菌株中PAS耐藥為34株，耐藥率為17.3%，與以上國內報道的數據相比處于平均水平，但較國外相比仍處于較高水平。

三、耐藥性與基因型相關性分析

北京基因型結核分枝桿菌在世界各地廣泛流行，并存在明顯的地域差別，在亞洲地區較為流行。北京基因型是中國結核分枝桿菌的主要基因型。本研究結果顯示，196株耐多藥結核分枝桿菌基因型分布具有明顯多態性，主要為北京基因型，共162株，占82.7%，表明北京基因型家族是我國耐多藥結核分枝桿菌菌株中主要流行的菌株。

由于耐多藥北京基因型菌株多次引起暴發流行，北京基因型菌株與耐藥性之間的關聯成為研究的熱點。北京基因型結核分枝桿菌與耐藥性密切相關，但不同國家和地區各有不同，有研究表明，俄羅斯、越南和伊朗等國耐藥結核病流行主要由北京基因型菌株引起；有些文獻報道，在越南胡志明市、愛沙尼亞、美國紐約等地區，北京基因型家族耐藥率高于非北京基因型家族；有些報道，在印度尼西亞、阿塞拜疆、哥倫比亞等地區，北京基因型家族與非北京基因型家族耐藥率差異無統計學意義,而中國香港北京基因型家族菌株異煙肼耐藥率低于非北京基因型家族菌株[14]。本研究結果表明：北京基因型與非北京基因型的耐多藥結核分枝桿菌菌株對Cs和PAS兩種二線抗結核藥物耐藥率差異無統計學意義，這在一定程度上表明北京基因型的耐多藥結核分枝桿菌菌株流行可能與Cs和PAS耐藥性無明顯相關性。

有研究表明[14]，北京基因型家族又分為古代型與現代型，古代型主要盛行在東南亞、印度等地區，與菌株的耐藥性密切相關，而現代型為我國主要流行菌株，與菌株流行傳播能力有關，與古代型相比，現代型具有高度的遺傳性和致病能力，為進一步探討耐藥表型與基因型的關系，筆者后續會擴大樣本量并對北京基因型中古代型和現代型進行流行病學分析。

我國耐多藥結核分枝桿菌對二線抗結核藥物Cs和PAS的耐藥率處于較高水平。北京基因型家族是我國耐多藥結核分枝桿菌中主要流行的菌株，北京基因型與非北京基因型的耐多藥結核分枝桿菌菌株對Cs和PAS兩種二線抗結核藥物耐藥性無明顯相關性。

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(本文編輯：王然 薛愛華)

Analyses on resistance to cycloserine and p-aminosalicylic acid and genotypes in multidrug-resistant M. tuberculosis isolates

YANG Jian*，PANG Yu，ZHAO Yan-lin，ZHANG Tian-hua，WANG Xi-di，CHEN Mei-ling，LI Yan，WANG Rui.

*Tuberculosis Reference Laboratory, Shaanxi Provincial Institute for Tuberculosis Control and Prevention，Xi’an 710048，China

ZHANG Tian-hua，Email：zhthfzhk@126.com； ZHAO Yan-lin，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

Objective To evaluate the resistance to cycloserine (Cs) and p-aminosalicylic acid (PAS) in multi-drug resistant (MDR)M.tuberculosisisolates, and analyze the relationship between the genotype and drug-resistant phenotype, which will provide the scientific evidence for MDR-tuberculosis treatment. Methods One hundred and ninety-six MDR-M.tuberculosisisolates were collected from the first tuberculosis drug resistance survey of China conducted in 2007, were detected their minimum inhibition concentrations (MICs) of Cs and PAS by microplate Alamar blue assay, and were analyzed the genotypes by Spoligotyping method. Cs and PAS resistant rates between Beijing genotype and non-Beijing genotype strains were compared using Chi square test,P<0.05 was considered as statistically significant difference. Results Of 196 MDR-M.tuberculosisisolates, 22.4%(44/196) were resistant to Cs, and 17.3%(34/196) were resistant to PAS. 82.7%(162/196)isolates belonged to Beijng geno-type, while 17.3%(34/196) strains belonged to non-Beijing genotypes. Of 162 Beijing genotype strains, 21.0% (34/162)strains were resistant to Cs, while 29.4%(10/34) of non-Beijing genotype strains were resistant to Cs. There were no statistical difference in Cs-resistant rates between Beijing and non-Beijing genotype strains(χ2=1.15，P>0.05). 16.0%(26/162)of Beijing genotype strains were resistant to PAS, while 23.5% (8/34) of non-Beijing genotype strains showed the resistance to PAS. They had no significant difference(χ2=1.10，P>0.05). Conclusion The Cs- and PAS-resistant rates in MDR-M.tuberculosisstrains were high in China. Beijing genotype was the predominant among MDR-M.tuberculosisisolates in China. The Cs- and PAS-resistant rates between Beijing and non-Beijing genotype strains had no significant difference.

Mycobacteriumtuberculosis; Drug resistance, multiple, bacterial; Cycloserine； Aminosalicylic acid； Genotype

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.02.002

710048 西安，陜西省結核病防治研究所 結核病參比實驗室(楊健、王西娣、陳美齡、李妍、王蕊)，辦公室 (張天華)；中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心(逄宇、趙雁林)

張天華，Email：zhthfzhk@126.com；趙雁林，Email：zhaoyanlin@chinatb.org

2014-05-30)