色氨酸-犬尿氨酸代謝中間產物對結核病患者T細胞免疫的影響

張熒 朱慧 梁倩 趙立平 黃海榮 黃娟 孫照剛

?

·論著·

色氨酸-犬尿氨酸代謝中間產物對結核病患者T細胞免疫的影響

張熒 朱慧 梁倩 趙立平 黃海榮 黃娟 孫照剛

結核/免疫學； T淋巴細胞亞群； 色氨酸； 犬尿氨酸

色氨酸(TRP)是人體必需氨基酸。TRP-犬尿氨酸(KYN)代謝途徑會因為某些疾病的發生而改變，從而影響機體免疫作用的發揮。機體免疫狀態是決定結核病發生、發展和轉歸的決定性因素，而TRP代謝中間產物，如KYN、喹啉酸(QA)、吡啶酸(PA)、鄰氨基苯甲酸(AA)等，對機體的免疫系統產生全面而又深遠的影響，如細胞分化、細胞凋亡和炎性反應等[1-2]。因此，研究TRP-KYN代謝途徑有助于闡明結核分枝桿菌感染與發病的生物學機制。本研究在明確結核病患者體內TRP-KYN代謝中間產物含量的基礎上[3],進一步通過體外試驗分析代謝中間產物對免疫細胞凋亡和分化的影響。

材料和方法

一、研究對象

試驗組來源于我院2012年9—12月期間經細菌學、病理學和影像學檢查明確診斷為肺結核且無腫瘤、艾滋病、糖尿病等合并疾病的結核病患者，共104例；其中男76例，女28例；經數字表法隨機抽樣選取45例作為試驗組，年齡20～65歲，平均(47.32±14.13)歲。所有患者HIV檢測均為陰性，均無免疫抑制劑和免疫增強劑使用史。健康對照組為同期北京市昌平區結核病防治所的健康體檢志愿者，經細菌學、病理學和影像學檢查明確無結核病，且無結核病病史，無慢性病病史，無呼吸疾病，共100名；其中男63名，女37名；經數字表法隨機選取其中39例作為健康對照組，年齡16～60歲，平均(39±18.62)歲。本研究經首都醫科大學附屬北京胸科醫院倫理委員會審核并通過[批件號：(2012)年KY臨審第(11)號]，征得受試對象同意，簽署了知情同意書。

二、試驗儀器和試劑

血細胞的流式細胞分析主要采用美國BD公司FACSCalibur型流式細胞儀。除細胞凋亡試劑盒購自美國BioVision公司外，其余所用熒光標記抗體、含抗凝劑的采血管和淋巴細胞分離液均購自美國BD公司。

三、試驗方法

1. 全血中人淋巴細胞的分離、抗體染色與流式分析：用抗凝采血管取5 ml全血后，采用人淋巴細胞分離液分離外周血單核淋巴細胞(PBMCs)；調整細胞濃度為5×106個/ml，用于調節性T細胞(Treg)和T輔助細胞17(Th17)及代謝中間產物的刺激試驗。Th17和Treg細胞的染色參考文獻[4]的方法。BD公司FACSCalibur型流式細胞儀進行檢測，結果用WinMDI 2.9軟件分析。本試驗以CD4+IL-17A+標記Th17細胞，以CD4+CDhigh 25FoxP3+標記Treg細胞，并設立空白對照(未染色)、FITC單色對照、PE單色對照、APC單色對照、Alexa Flour647單色對照、Alexa Flour647-IgG同型對照、PE-IgG同型對照，以便進行熒光標記效果的質量控制。上述熒光標記抗體均購自BD公司。

2. TRP及其代謝中間產物對CD4+T淋巴細胞和CD8+T淋巴細胞的體外刺激：住院次日凌晨空腹抽靜脈血5 ml，肝素抗凝，用標準的Ficoll-Hypaque密度梯度離心方法分離得到PBMCs，經磷酸鹽緩沖液洗滌后，用含10%胎牛血清(FBS)的杜爾伯科極限必需培養基(DMEM)培養液調整細胞濃度為1×106個/ml，并以每孔500 μl接種細胞于24孔培養板，培養24 h；試驗組分別單獨加入TRP、KYN、QA 3種化合物，終濃度分別為0.2 mmol/L和2 mmol/L，每種化合物的每個濃度分別設立3個重復試驗；空白對照加入同體積的DMEM培養基，共培養24 h。之后進行細胞的染色和流式分析。本實驗采用隨機數字表法選取其中的6例患者作為試驗組進行了PBMCs的分離和化合物體外刺激實驗。其中5例患者獲得的5 ml全血分離的PBMCs數量達到107左右，而且流式細胞分析方法的染色效果符合流式標準，滿足本研究需要；另外1例因PBMCs總數不足而未滿足實驗要求。試驗組是化合物刺激組，空白組未加化合物刺激。

3. 細胞凋亡的檢測：采用Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit試劑盒(美國BioVision公司)進行細胞凋亡的染色分析。按試劑盒說明書進行檢測及結果判定。

四、統計學分析

結 果

一、 外周血Treg細胞和Th17細胞與年齡、性別的相關性分析

健康對照組和試驗組的組間性別構成經卡方檢驗(χ2=0.163,P=0.330)，結果顯示差異無統計學意義；采用方差檢驗分析兩組之間平均年齡(t=2.001，P=0.152)，差異無統計學意義。多因素相關性分析的結果顯示，本研究所測定Treg細胞和Th17細胞與性別、年齡兩因素并無相關性(表1)。因此，組間性別、年齡因素差異對試驗結果不造成偏倚影響。

二、試驗組和健康對照組外周血Treg細胞和Th17細胞水平的比較

試驗組PBMCs中Treg細胞占CD4+T細胞的比率為(1.49±0.82)%，健康對照組為(0.41±0.26)%，兩組間相比較，試驗組外周血中Treg細胞含量顯著高于健康對照組(t=33.64，P=0.000)；試驗組外周血PBMCs中Th17細胞占CD4+T細胞的比率為(1.04±0.72)%，而健康對照組的Th17細胞占CD4+T細胞的比率為(0.73±0.43)%(圖1，2)，兩者之間差異無統計學意義(t=44.46，P=0.071)(表2)。

表1 入組人群年齡、性別與外周血中Treg細胞和Th17細胞的相關性分析

表2 試驗組外周血和健康對照組外周血Treg細胞和Th17細胞水平

Treg細胞具有免疫抑制的功能，而Th17細胞分泌細胞因子IL-17是促進炎癥反應的細胞，研究兩者的比例在結核病免疫學中具有潛在意義。本研究中試驗組外周血PBMCs中Treg細胞和Th17細胞的比值為2.39±2.241，健康對照組的比值為0.77±0.767，兩者比較差異有統計學意義(t=34.25，P=0.001)。

三、TRP、KYN和QA對T細胞的影響

結核病患者體內TRP、KYN和QA的含量顯著增加提示：TRP及其代謝中間產物可能會對免疫細胞的含量產生影響，從而影響機體的免疫平衡狀態；為此筆者在體外條件下對CD4+T和CD8+T細胞用這3種化合物進行了體外刺激試驗。空白對照組表示未加化合物刺激。

1. TRP、KYN和QA對CD4+T細胞凋亡的影響：流式細胞分析結果顯示，KYN刺激試驗組外周血中經植物血凝素(PHA)活化的CD4+T細胞，共培養24 h后細胞凋亡率增高，在0.2 mmol/L和2.0 mmol/L濃度的刺激下其凋亡率分別為(14.47±0.18)%和(30.07±7.37)%；而空白對照組為(8.40±3.28)%。體外2.0 mmol/L的KYN刺激結核病患者CD4+T細胞平均凋亡率[(30.07±7.37)%]顯著高于空白對照組[(8.40±3.28)%]的CD4+T細胞凋亡率，兩組之間CD4+T細胞凋亡率差異有統計學意義(t=7.49，P=0.000)，甚至在0.2 mmol/L低濃度的KYN環境中CD4+T細胞凋亡率[(14.47±0.18)%]和空白對照組[(8.40±3.28)%]之間也顯示差異有統計學意義(t=5.16，P=0.045)。0.2 mmol/L和2.0 mmol/L的QA刺激CD4+T細胞產生的凋亡率分別為(6.83±1.66)%和(6.85±0.43)%，兩種濃度的QA對CD4+T細胞的凋亡率差異無統計學意義(t=4.13，P=0.112；t=8.21，P=0.107)。0.2 mmol/L和2.0 mmol/L的TRP刺激CD4+T細胞產生的凋亡率分別為(6.93±0.52)%和(6.66±0.96)%，兩種濃度的QA對CD4+T細胞的凋亡率差異無統計學意義(t=6.32，P=0.102；t=6.42，P=0.189)(表3)。

注 KYN：犬尿氨酸；TRP：色氨酸； QA：喹啉酸。左側表示各代謝中間產物所用的濃度，低濃度為0.2 mmol/L，高濃度為2.0 mmol/L，0.0 mmol/L表示不加入任何代謝中間產物。KYN、TRP、QA在0.2 mmol/L與0.0 mmol/L濃度刺激下的凋亡率進行統計學處理，t值分別為5.16、6.32、4.13；P值分別為0.045、0.102、0.112；在2.0 mmol/L與0.0 mmol/L濃度刺激下的凋亡率進行統計學處理，t值分別為7.49、6.42、8.21；P值分別為0.000、0.189、0.107

2. TRP、KYN和QA對CD8+T細胞凋亡的影響：流式細胞分析結果顯示，0.2 mmol/L和2.0 mmol/L的KYN刺激T細胞后引起CD8+T細胞亞群的細胞凋亡率分別為(19.41±2.94)%和(26.36±1.09)%，高于未添加任何化合物的空白對照組產生的凋亡率[(15.31±1.88)%](t=5.42，P=0.041；t=4.89，P=0.003)；低濃度(0.2 mmol/L)和高濃度(2.0 mmol/L)的QA誘導CD8+T細胞產生的凋亡率分別是(14.94±3.24)%和(17.18±2.07)%，與未添加任何化合物的空白對照組[(15.31±1.88)%]比較差異無統計學意義(t=8.13，P=0.214；t=8.02，P=0.121)。低濃度(0.2 mmol/L)和高濃度(2.0 mmol/L)的TRP誘導CD8+T細胞產生的凋亡率分別是(16.28±2.28)%和(16.48±4.75)%，與未添加任何化合物的空白對照組[(15.31±1.88)%]比較，差異無統計學意義(t=5.33，P=0.411；t=7.41，P=0.238)(表4)。

表4 不同濃度KYN、TRP和QA化合物刺激結核病患者致CD8+ T細胞凋亡情況分析

注 KYN：犬尿氨酸；TRP：色氨酸； QA：喹啉酸。左側表示各代謝中間產物所用的濃度，低濃度為0.2 mmol/L，高濃度為2.0 mmol/L，0.0 mmol/L表示不加入任何代謝中間產物。KYN、TRP、QA在0.2 mmol/L與0.0 mmol/L濃度刺激下的凋亡率進行統計學處理，t值分別為5.42、5.33、8.13；P值分別為0.041、0.411、0.214；在2.0 mmol/L與0.0 mmol/L濃度刺激下的凋亡率進行統計學處理，t值分別為4.89、7.41、8.02；P值分別為0.003、0.238、0.121

討 論

一、TRP-KYN代謝中間產物參與結核病免疫

目前，對結核病患者代謝的研究主要集中在抗結核藥物的影響方面[5-6]。TRP-KYN代謝路徑中吲哚胺-2,3-雙加氧酶(IDO)是關鍵限速酶，KYN、QA等中間代謝產物具有重要的免疫調節作用。表達IDO的細胞在體內、外均能抑制T細胞的增殖[1-2,7]，主要的機制在于TRP的被降解，造成局部蛋白合成受阻；或者代謝產物抑制免疫細胞的增殖或促進凋亡[8]。這其中Th17和Treg 細胞起了重要作用[9-10]。結核病患者體內的TRP-KYN代謝途徑被活化提高，提示TRP代謝途徑會因為結核分枝桿菌的感染而增強，其代謝中間產物含量變化的生物學意義需要進一步認識。

二、TRP-KYN代謝中間產物促進了T細胞的分化

先前的研究發現，與健康對照組相比，結核病患者體內KYN和QA的含量會增加，而TRP的含量降低，而PA和AA的含量不變[3]。KYN不僅抑制T細胞分化和功能[11]，還能通過活性氧(ROS)作用誘導NK細胞的凋亡[12]。TRP的減少及KYN的增加促進了結核病患者體內Treg細胞比例的增加[13]。而Treg細胞的增加促進了TRP的利用，從而使T細胞的增殖因TRP的缺乏受到抑制。T細胞增殖受抑制的原因也與Treg細胞表面的CD25分子與效應T細胞的白細胞介素2競爭結合，使效應T細胞因無法獲得生長信號而受抑制有關[1-2, 7-8]。高濃度的QA刺激能夠促進產生促炎細胞分子和趨化因子，提高趨化因子受體表達水平[14]。由此推測結核分枝桿菌感染機體后，血清或血漿中的QA含量升高可能增強炎癥反應、促進免疫反應，從而消除感染細菌，但是這一過程受Treg細胞的調節。筆者的研究結果證明，結核病患者體內Treg細胞明顯增加(t=33.64，P=0.000)，Th17細胞雖有增加但差異無統計學意義(t=44.46，P=0.071)。試驗組PBMCs中Treg細胞和Th17細胞的比值與健康對照組相比，差異有統計學意義(t=34.25，P=0.001)，揭示結核病患者存在重要的免疫再平衡過程。為了避免免疫病理損傷，結核病患者發病時其免疫系統處于一定程度的抑制狀態。本試驗結果中Treg細胞與Th17細胞比值的標準差與比值的均值接近，顯示了利用比值來反應結核病患者的免疫學狀態的可行性存在較大的不確定性，Treg細胞與Th17細胞比值的臨床意義需要進一步驗證。

三、TRP-KYN代謝中間產物影響T細胞的凋亡

已有的研究發現結核病患者的CD4+T和CD8+T細胞較健康對照組明顯下降[15]，除了細胞增殖受到抑制的因素外，細胞凋亡的誘發和中樞免疫器官功能受損等成為解釋該現象的主要原因[15]。細胞凋亡機制是細胞產生分化的一種途徑方式。本研究發現：在結核病患者CD4+T細胞亞群中，Treg和Th17的比例上升[試驗組和健康對照組分別為：(1.49±0.83)%和(0.42±0.27)%；(1.04±0.77)%和(0.73±0.43)%]。通過體外實驗，本研究發現KYN對CD4+和CD8+T細胞都具有顯著的凋亡誘導作用[分別由(8.40±3.28)%上升至(30.07±7.37)%和由(15.31±1.88)%上升至(26.36±1.09)%]。Frumento等[16]認為QA能選擇性地抑制CD4+和CD8+T淋巴細胞的增殖并且激活NK細胞，在TRP缺乏的情況下這種現象會更加顯著。本研究沒有觀察到QA刺激結核病患者外周血中CD4+或者CD8+T細胞而產生的凋亡現象(P值分別為0.107、0.121)，由此推測QA僅具有抑制CD4+和CD8+T細胞增殖的作用，但是并沒有激活其凋亡機制的作用。

總之，結核病患者體內高水平的KYN、QA及低水平的TRP在結核病免疫中起了重要作用，這主要表現在Treg細胞的比例增加。KYN在誘導T細胞分化和產生Treg細胞中起了重要作用，該作用的發揮主要靠細胞凋亡實現。QA在結核病免疫中的作用可能與炎癥反應和抑制增殖有關，而與細胞分化無關。

志謝 中國疾病預防控制中心結核病防治臨床中心姜曉穎博士在統計學方面給予了極大的幫助！

[1] Terness P, Bauer TM, R?se L, et al. Inhibition of allogeneic T cell proliferation by indoleamine 2,3-dioxygenase-expressing dendritic cells: mediation of suppression by tryptophan meta-bolites. J Exp Med, 2002, 196 (4): 447-457.

[2] Mellor AL, Munn D, Chandler P, et al. Tryptophan catabolism and T cell responses. Adv Exp Med Biol, 2003, 527: 27-35.

[3] 張熒，朱慧，任衛聰，等. 液相色譜-質譜聯用技術同時定量檢測結核病患者中多種色氨酸代謝產物及其臨床意義. 中華臨床醫師雜志(電子版)，2013，7(9):3866-3870.

[4] Lim HW, Lee J, Hillsamer P, et al. Human Th17 cells share major trafficking receptors with both polarized effector T cells and FoxP3+regulatory T cells. J Immunol, 2008, 180(1): 122-129.

[5] 肖和平，唐神結. 二線抗結核藥物的臨床應用. 中國防癆雜志，2009,31(10): 612-616.

[6] 閆世明，孫秀娟，鄒志艷，等. 吡嗪酰胺對老年肺結核病人血尿酸代謝的影響. 中國防癆雜志，1993，15(1):96-99.

[7] Takikawa O. Biochemical and medical aspects of the indolea-mine 2,3-dioxygenase-initiated L-tryptophan metabolism. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 338(1): 12-19.

[8] Hwu P, Du MX, Lapointe R, et al. Indoleamine 2,3-dioxygenase production by human dendritic cells results in the inhibition of T cell proliferation. J Immunol, 2000, 164(7): 3596-3599.

[9] Sojka DK, Huang YH, Fowell DJ. Mechanisms of regulatory T-cell suppression—a diverse arsenal for a moving target. Immunology, 2008, 124(1): 13-22.

[10] McGovern JL, Nguyen DX, Notley CA, et al. Th17 cells are restrained by Treg cells via the inhibition of interleukin-6 in patients with rheumatoid arthritis responding to anti-tumor necrosis factor antibody therapy. Arthritis Rheum, 2012, 64(10): 3129-3138.

[11] Kwidzinski E, Bechmann I. IDO expression in the brain: a double-edged sword. J Mol Med (Berl), 2007, 85(12): 1351-1359.

[12] Song H, Park H, Kim YS, et al. L-kynurenine-induced apoptosis in human NK cells is mediated by reactive oxygen species. Int Immunopharmacol, 2011, 11(8): 932-938.

[13] Kaper T, Looger LL, Takanaga H, et al. Nanosensor detection of an immunoregulatory tryptophan influx/kynurenine efflux cycle. PLoS Biol, 2007, 5(10): e257.

[14] 石蓮，張麗華，孟萍，等.肺結核患者外周血T淋巴細胞亞群測定的臨床研究. 中國防癆雜志，2009，31(11)：673-675.

[15] Rodrigues DS, Medeiros EA, Weckx LY, et al. Immunophenotypic characterization of peripheral T lymphocytes inMycobacteriumtuberculosisinfection and disease. Clin Exp Immunol, 2002, 128(1): 149-154.

[16] Frumento G, Rotondo R, Tonetti M, et al. Tryptophan-derived catabolites are responsible for inhibition of T and natural killer cell proliferation induced by indoleamine 2,3-dioxyge-nase. J Exp Med, 2002, 196(4): 459-468.

(本文編輯：郭萌)

Effect of the metabolites in the tryptophan-kynurinine pathway on T-cell immunity among patients with tuberculosis

ZHANGYing,ZHUHui,LIANGQian,ZHAOLi-ping,HUANGHai-rong,HUANGJuan,SUNZhao-gang.

NationalTuberculosisClinicalLaboratory,BeijingChestHospital,CapitalMedicalUniversity,BeijingkeyLaboratoryinDrugResistantTuberculosisResearch,BeijingTuberculosis&ThoracicTumorResearchInstitute,Beijing101149,China

SUNZhao-gang，Email:sunzg75@hotmail.com;HUANGJuan,Email：happyhj888@163.com

Tuberculosis/immunology； T-lymphocyte subsets； Tryptophan； Kynurenine

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.001

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003009)；北京市高層次衛生技術人才培養項目(2011-3-069)；北京市醫院管理局臨床醫學發展專項(ZYLX201304)

101149 首都醫科大學附屬北京胸科醫院 國家結核病臨床實驗室 北京市結核病胸部腫瘤研究所 耐藥結核病研究北京市重點實驗室[張熒(研究生)、梁倩、趙立平、黃海榮、孫照剛]，藥物研究室(朱慧)；青島農業大學 山東省預防獸醫學重點實驗室[張熒、黃娟]

孫照剛，Email：sunzg75@hotmail.com；黃娟，Email：happyhj888@163.com

2014-11-03)