結核性腦膜炎臨床分離株表型耐藥特點及其治療效果研究

王婷 趙雁林 逄宇 馮國棟 宋媛媛 歐喜超 彭晉湘 趙鋼 戰麗萍

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·論著·

結核性腦膜炎臨床分離株表型耐藥特點及其治療效果研究

王婷 趙雁林 逄宇 馮國棟 宋媛媛 歐喜超 彭晉湘 趙鋼 戰麗萍

目的 研究分析結核性腦膜炎(tuberculous meningitis, TBM)的致病菌對抗結核藥的耐藥特點及抗結核藥對致病菌的治療效果。方法 500例疑似TBM患者腦脊液標本經MGIT(mycobacteria growth indicator tube)960液體培養出25株臨床分離株，再用16S rRNA基因測序法進行菌種鑒定。繼而對這25株結核分枝桿菌臨床分離株分別進行14種抗結核藥物的MGIT 960液體藥敏試驗和12種抗結核藥物的傳統比例法固體藥敏試驗、16種抗結核藥物的最低抑菌濃度(MIC)測定。通過計算血藥濃度峰值(Cmax)/MIC值的大小來判斷藥物對菌株殺菌率的高低，并由此推斷藥物對該致病菌的治療效果。結果 液體藥敏試驗結果和固體藥敏試驗結果均顯示了任意耐藥的TBM臨床分離株有13株(13/25), 耐多藥的TBM臨床分離株有3株(3/25)；利福平、莫西沙星、左氧氟沙星、氯法齊明、對氨基水楊酸的Cmax/MIC值分別為19.880、63.333、19.149、75.000、50.855。結論 莫西沙星、氯法齊明、對氨基水楊酸、左氧氟沙星、利福平的Cmax/MIC值較高，提示臨床上使用高劑量利福平和氟喹諾酮類藥物聯合治療TBM可以提高療效；對氨基水楊酸和氯法齊明對耐多藥TBM臨床分離株可能有較好效果。

結核, 腦膜/藥物療法; 表型; 微生物敏感性試驗; 治療結果

截至2011年，全球耐多藥結核病(MDR-TB)已出現310 000例，耐多藥結核性腦膜炎(MDR-TBM)也相繼出現報道[1]，全世界約有200萬例潛伏感染患者并可能復發，成為結核病防治的重大難題之一[2]。中樞神經系統Mtb感染占肺外結核的5%，其中結核性腦膜炎(tuberculous meningitis, TBM)危害最嚴重。耐藥結核病的出現降低了現有標準治療方案的效果，亟需精確的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)數據來實施個體化的治療。抗結核藥物最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration, MIC) 能精細地反映Mtb的耐藥程度，對治療MDR-TB具有重要價值。MIC值的測定也是篩選新抗結核藥物的重要環節[3]。以前Mtb藥敏試驗標準臨界濃度的設置有所不同。1963年，Canetti 等[4]注意到Mtb菌群具有不均一性，每個培養的野生型Mtb菌落可能含有很小比例(<1%)的耐藥菌株。研究人員根據這1%比例的耐藥突變，制定了標準的臨界藥物濃度以區分敏感和耐藥菌株，此后確定了一線抗結核藥物的體外藥敏試驗臨界值并沿用至今[5]，后來又陸續制定出二線抗結核藥物藥敏試驗的臨界濃度。目前，大部分抗結核藥物的臨界濃度和臨床治療結果之間并沒有清晰的對應關系[6]。MIC快速檢測方法藥敏試驗臨界值的設置是通過與傳統檢測方法相對比，繪制受試者工作特征曲線(receiver operating characteristic curves，ROC) 來得到一個與傳統方法符合率最高的臨界值[7]。這種臨界值的確定既缺乏足夠的樣本量，又常忽略Mtb菌群差異對臨界值的影響。因此，建立規范、有效的Mtb藥敏試驗MIC的檢測方法及設置有效的臨界值，對于結核病個體化治療、快速耐藥檢測方法的研究和新型抗結核藥物篩選等領域具有重要意義，也是控制MDR-TB產生和傳播的關鍵。而大部分抗結核藥物均屬于濃度依賴型抗生素，其殺滅致病菌的效果主要取決于血藥濃度峰值(Cmax)與MIC的比值[8]。因此，筆者就TBM致病菌對抗結核藥物的表型耐藥、MIC及其臨界值的特點做了初步研究。并通過計算Cmax/MIC值的大小來研究抗結核藥物對菌株的殺菌率，并由此推斷藥物對該致病菌的治療效果，以了解TBM的致病菌對抗結核藥物的耐藥特點及抗結核藥物對致病菌的治療效果。

材料和方法

一、一般資料

1. 菌株獲取：本實驗從2010年7月至2011年6月收集了500例疑似TBM患者的腦脊液標本，這些患者來自全國22家大中型醫院。所選TBM患者的診斷標準均參照2009年5月南非國際結核性腦膜炎大會制定的臨床診斷標準執行[9]。所有納入患者HIV檢測為陰性，并做了MGIT 960液體培養。有25例患者培養陽性，包括男8例，女17例，年齡范圍3～82歲，平均年齡(35.68±23.36)歲，以H37Rv標準株(ATCC25177，來自國家參比實驗室)作為藥敏試驗標準對照菌株。25株臨床分離株均經PCR基因測序法鑒定為Mtb[10]。菌株均保存在-70 ℃，然后在37 ℃固體培養基上復蘇2～3個星期。該研究所納入的患者均已簽署知情同意書，并得到西京醫院倫理委員會的批準。

2. 診斷標準：500例疑似TBM患者至少同時符合以下3個診斷標準：(1)發熱、頭痛、嘔吐、頸項強直；(2)腦脊液細胞增多，以白細胞和單核細胞為主，糖含量降低，蛋白含量增高，且沒有其他致病菌感染；(3)影像學顯示腦栓塞或腦積液，或有粟粒型肺結核。

3. 試劑和儀器：L-J固體培養基依據《結核病診斷實驗室檢驗規程》[11]由國家參比實驗室統一制備。全自動Bactec MGITTM960TB系統(美國BD公司生產)，Middlebrook 7H9干粉和油酸、白蛋白、右旋糖和過氧化氫酶(OADC)培養液(美國BD公司生產)；Alamar blue購自英國AbD Serotec公司；滅菌96孔板購自美國Corning公司；藥品均購自美國Sigma-Aldrich公司。異煙肼(H)、乙胺丁醇(E)、鏈霉素(S)、卡那霉素(Km)、阿米卡星(Am)、卷曲霉素(Cm)、莫西沙星(Mfx)、對氨基水楊酸(PAS)、環絲氨酸(Cs)、克拉維酸(TLC)溶于雙蒸水。克拉霉素(Clr)、苯乙烯基甲基甲酮縮氨硫脲(Thz)、利福平(R)、乙硫異煙胺(Eto)、美羅培南(MEC)、丙硫異煙胺(Pto)、氯法齊明(Cfz)溶于二甲基亞砜(DMSO)有機溶劑中；左氧氟沙星(Lfx)、氧氟沙星(Ofx)溶于NaOH(0.1N)中。所有藥物置于-20～4 ℃存放。

4. MGIT 960藥敏試驗：根據2008年WHO最新指南[12]推薦藥物和濃度，選擇了14種抗結核藥物[H(0.1 μg/ml)、R(1 μg/ml)、E(5 μg/ml)、Z(100 μg/ml)、S(1 μg/ml)、Km(2.5 μg/ml)、Am(1 μg/ml)、Cm(2.5 μg/ml)、Mfx(0.5或2.0 μg/ml)、Ofx(2.0 μg/ml)、Lfx(1.5 μg/ml)、PAS(4 μg/ml)、Eto(5 μg/ml)、Pto(2.5 μg/ml)]行液體藥敏試驗。孵育至儀器報陽，最多培養4周，如未能生長，儀器將報告為陰性[13]。

5. 傳統比例法固體藥敏試驗：根據2008年WHO最新指南[11]推薦藥物和濃度，選擇12種抗結核藥物[H(0.2 μg/ml)、R(40 μg/ml)、E(2 μg/ml)、S(4 μg/ml)、Km(30 μg/ml)、Am(30 μg/ml)、Cm(40 μg/ml)、Ofx(4 μg/ml)、Lfx(4 μg/ml)、 PAS(1 μg/ml)、Pto(40 μg/ml)、Cs(30 μg/ml)]進行比例法藥敏試驗；耐藥結果判定：耐藥百分比=(含藥培養基的菌落數/對照培養基的菌落數)×100%。耐藥百分比<1%為敏感，≥1%為耐藥[14]。

6. MIC的測定：參照2008年的美國臨床實驗室標準化研究所(Clinical and Laboratory Stan-dards Institute,CLSI)推薦的藥物濃度和Alamar blue顯色法[15]，選擇了16種抗結核藥物[H、R、E、Km、Am、Cm、Mfx、Lfx、PAS、Pto、Cs、Clr、阿莫西林-克拉維酸(Amx-Clv)、Thz、Cfz、MEC]進行MIC試驗。

7. 數據的整理和統計學分析：統計菌株對各藥物的MIC范圍。其中MIC實驗的準確度可利用ROC曲線評價，曲線下面積(AUC)越大，則認為該方法正確區分Mtb耐藥和敏感的能力越大。ROC曲線可給出區分耐藥和敏感的最佳耐藥閾值(藥敏界值)，當AUC為1時，該閾值可正確將耐藥和敏感菌株完全分開，當AUC≤0.5時，該閾值不能將耐藥和敏感菌株完全分開。用SPSS 16.0軟件進行ROC曲線分析，結合傳統比例法固體和液體藥敏試驗的結果，并以此作為金標準，確定各抗結核藥物的折點濃度，并計算菌株對該藥物的AUC。

8. 計算藥物對菌株殺菌率的高低：筆者通過計算Cmax/MIC值的大小來研究藥物對菌株殺菌率的高低，并由此推斷藥物對該致病菌的治療效果。因所選15種抗結核藥均為濃度依賴性殺菌劑，故采用文獻報道的濃度依賴性殺菌劑所用標準：對氨基糖苷類，若Cmax/MIC≥8～10，臨床有效率可達90%；對氟喹諾酮類，若Cmax/MIC≥10～12，可達最高的殺菌率[20]。

9. 質量控制(簡稱“質控”)：質控選取標準株H37Rv作為藥敏試驗參考標準菌株，以及空白培養基和無菌蒸餾水做空白對照。每部分實驗均重復3次或3次以上。若一致，說明質控合格；若不一致，說明質控不合格，還需重新檢測。

二、相關概念

MDR-TBM：是指同時耐H和R的TBM；廣泛耐藥結核性腦膜炎(XDR-TBM)：是指同時耐H和R，也耐氟喹諾酮類藥或二線抗結核注射藥類中的任意一種[15]。

結 果

一、藥敏試驗結果

比例法和MGIT 960藥敏試驗檢測結果基本一致(表1)，綜合固體和液體藥敏試驗結果后發現，任意耐藥(包括一線和二線抗結核藥物)的TBM臨床分離株有13株(13/25)，對一線4種抗結核藥物(H、R、E、Z)全敏感者有15株；耐藥菌株10株，其中表型耐H或R所占的比例較大，MDR-TBM有3株(3/25)。二線注射藥(S、Km、Am、Cm)敏感株有19株(19/25)；口服二線抑菌藥(PAS、Pto、Eto、Cs)敏感株有20株(20/25)；表型耐氟喹諾酮類藥(Mfx、Ofx、Lfx)有2株(2/25)，敏感株有23株(23/25)。

二、25株TBM臨床分離株對16種抗結核藥物的MIC及其與菌株耐藥表型的關系

H、R、E、Km、Am、Cm、Mfx、Lfx、PAS、Pto、Cs、MEC、Clr、Thz、Cfz、Amx的敏感株MIC值中位數分別為25.60、0.50、5.00、4.00、2.00、5.00、0.08、0.16、0.31、5.00、20.00、64.00、12.50、20.00、0.32、480.00 μg/ml(表2)。

三、15種抗結核藥物的最佳藥敏界值分析

由于不同個體差異較大，Cmax(峰值血藥濃度) 影響因素廣泛，筆者參閱匯總了多篇國際上權威文獻報道的Cmax值[16-23]。由于MEC、Amx、Cfz、Pto、Clr未做固體藥敏試驗，因此沒有通過做ROC曲線來確定最佳藥敏界值，所取藥敏界值為大部分TBM臨床分離株的MIC值(表3)。其余藥物的ROC曲線下面積(AUC)數值大小均在0.500～1.000之間。其中R、Mfx、Lfx、Cfz、PAS的Cmax/MIC值較高，分別為19.880、63.333、19.149、75.000、50.855，均>12.000。E、MEC、Amx的Cmax/MIC值較低，分別為0.115、0.010、0.004。氨基糖苷類Km、Am、Cm的Cmax/MIC值分別為1.830、1.800、5.300，均<8.000。

討 論

根據國際防癆和肺部疾病聯合會和世界衛生組織對于結核病藥敏試驗藥物濃度界限確定的原則[24]，將肺結核臨床分離株對H的MIC界值限定為4.00或8.00 μg/ml；R為0.25或1.00 μg/ml；E為1.00 μg/ml；Km為5.00 μg/ml；Am為4.00 μg/ml；Mfx為2.00 μg/ml；Lfx為2.00 μg/ml；PAS為2.00 μg/ml；Pto為5.00 μg/ml；Cs為32.00 μg/ml[25]。本實驗中H、R、E、Km、Am、Cm、Mfx、Lfx、PAS、Pto、Cs分別為25.60、0.50、5.00、4.00、2.00、5.00、0.08、0.16、0.31、5.00、20.00 μg/ml，普遍較肺結核低。但TBM臨床分離株對H、E的MIC界值(25.60，5.00)普遍較肺結核(4.00，1.00)臨床分離株高。筆者查閱了原始數據資料并重復了4次試驗，菌株重新接種后也更換了不同批次的藥物，發現仍然是相同結果。目前，大多數文獻報道的MIC值均是針對肺結核臨床分離株的，而對TBM臨床分離株的相關數據報道甚少，還沒有權威文獻可供參考。因此，筆者認為造成H和E的MIC界值普遍較高的原因可能有：肺結核臨床分離株的MIC界值和TBM臨床分離株的MIC界值不相同；H、E的Cmax/MIC值分別為0.600和0.115(表3)，也可說明H、E對TBM臨床分離株殺菌率較低，治療效果不好；菌株數太少，導致數據代表性不強；但由于分離TBM臨床菌株難度很大，造成本研究的菌株數十分有限。若在今后的工作中能繼續擴大樣本量，相信還會有更多發現。

表1 不同藥物采用比例法固體和MGIT 960液體技術進行藥敏試驗的結果

注 H：異煙肼； R：利福平； Z：吡嗪酰胺； E：乙胺丁醇； S：鏈霉素； Km：卡那霉素； Am：阿米卡星； Cm：卷曲霉素； Mfx：莫西沙星； Ofx：氧氟沙星； Lfx：左氧氟沙星； PAS：對氨基水楊酸； Eto：乙硫異煙胺； Pto：丙硫異煙胺； Cs：環絲氨酸；“-”表示WHO暫未推薦做固體藥敏試驗或液體藥敏試驗

表2 25株TBM臨床分離株對16種抗結核藥物的MIC特征

注 括號內數值為中位數

表3 15種藥物最佳藥敏界值分析

注 Cmax：血藥峰值濃度，即用藥后所能達到的最高血漿藥物濃度，所選數值來自于參考文獻；AUC：曲線下面積；-：未做比例法固體藥敏試驗；表中MIC值為大部分TBM臨床分離株的MIC值

目前，臨床對于TBM患者的治療仍在延用肺結核的治療方法[23]，對于MDR-TB，通常采用二線抗結核藥物和氟喹諾酮類藥物進行治療。其中氟喹諾酮類藥物投入臨床時間較長、應用的抗菌范圍較廣、不良反應小、價格低廉，已被WHO納入MDR-TB的臨床治療方案，成為聯合治療的核心藥物之一。MDR-TB治療的成敗與Mtb對氟喹諾酮類藥物是否耐藥密切相關[26]。據文獻報道，氟喹諾酮類藥物中Mfx治療結核病效果最好[27]。但隨著Mfx的廣泛應用，未使用Mfx的患者感染耐藥菌株的概率增大，可能導致MIC界限不清，難以確定耐藥界限。對Mfx敏感的肺結核臨床分離株MIC值多集中于0.200 μg/ml，耐Mfx的肺結核臨床分離株MIC值多集中于6.000 μg/ml。本實驗中對Mfx敏感的TBM菌株的MIC值多集中于0.080 μg/ml, 對Mfx耐藥的TBM菌株的MIC值多集中于0.120 μg/ml(表2)，明顯低于肺結核臨床分離株，且Cmax/MIC值高達63.333。由此提示，Mfx對TBM臨床分離株的殺菌力較對肺結核的臨床分離株高，可能會有不錯的治療效果。也有文獻報道高劑量R和氟喹諾酮類藥物聯合治療TBM可以提高療效[24]。本研究也發現Mfx、Lfx、R的Cmax/MIC分別為63.333、19.149、19.880，均>12，其中R最低。提示聯合高劑量R和氟喹諾酮類藥物治療TBM會有不錯的療效。

此外，關于TBM的治療，不僅要考慮體外檢測到的MIC和Cmax，還應考慮藥物對血腦屏障的穿透能力和在腦脊液中能達到的實際濃度。由于血腦屏障的存在，使治療時間更長，且可選擇的藥物少，對多耐藥患者更是如此。血腦屏障能阻止約95%的藥物進入腦組織[28]，使療效大大降低。H、Z、Pto能完全通過血腦屏障，R在腦組織中有較高的Cmax/MIC，據報道氟喹諾酮類藥物與H、R有協同作用[29]。腦膜的病理性破壞可使血腦屏障的通透性增加，從而使能部分通過血腦屏障的藥物進入腦組織的藥量增加。由于Mtb屬細胞內病原菌，大多被肺泡巨噬細胞(AM)所吞噬, 余者處于肺上皮細胞的襯液(ELF)中，故R、Lfx、Mfx在肺泡細胞(AC)、AM及ELF中的濃度反映了其在感染部位的實際分布, 在炎癥條件下，可以部分通過血腦屏障[30]，在腦脊液中有良好的分布，可用于治療TBM[19]。氟喹諾酮類藥物普遍具有良好的藥物動力學性質，口服生物利用度≥78%，其血漿蛋白結合率較低(≤40%)，易于透過細胞膜而達到治療感染所需的組織濃度。由表3可看出MIC/Cmax值較低的為E和Amx，由此推斷治療TBM效果可能不好，即使加大劑量效果也一般。這可能是由于單用E時細菌可迅速產生耐藥性，對胞內Mtb無效，且其不能滲入正常腦膜(TBM患者腦脊液中可有微量)，因此殺菌效果不好。近幾年Amx的廣泛使用可能也是導致其耐藥率增加的原因，因此必須與其他抗結核藥聯合應用。當用于曾接受抗結核藥物治療的患者時，應至少與一種二線藥物合用，有文獻報道Amx和Am聯用可增加治療效果[17]。MEC不易透過血腦屏障，若要治療TBM，還需加大劑量。氨基糖苷類藥物(如Am和km)的Cmax/MIC值均<8 μg/ml，H的Cmax/MIC值<1,因此其在TBM治療中的應用還有待評價。本實驗發現Pto、Clr用于治療TBM效果一般；Cm、PAS治療TBM可能會起到不錯的效果。有文獻報道Cfz對Mtb及耐多藥Mtb均有較強的體外抗菌作用[31]，其作用機制主要是干擾核酸代謝及能量代謝，不易產生耐藥性，與現有抗結核藥物無交叉耐藥，與細胞色素P450酶沒有內在的相互作用[19]。本實驗也發現Cfz的Cmax/MIC值高達75.000(表3)，因此使用較少劑量即可達到較大殺菌率。此外，有文獻報道貝達喹啉(bedaquiline)和地依麥迪(delamanid)較易滲透血腦屏障，在治療MDR-TBM中也會有很好前景[32]。

綜上所述，關于TBM臨床分離株耐藥性、最低抑菌濃度及各類抗結核藥對致病菌的治療效果方面的研究，國內還未見類似報道。本課題很好地擴展了結核病的研究范圍，有助于解決臨床上的諸多問題。比如，同樣是不耐藥的Mtb，為何對肺結核療效好的藥物對TBM的療效卻不好？如何才能更快、更有效地治療TBM？諸如此類問題將是結核病基礎和臨床研究的新方向，值得每位學者為之探索發現。

[1] Patel VB, Padayatchi N, Bhigjee AI, et al. Multidrug-resis-tant tuberculous meningitis in KwaZulu-Natal, South Africa. Clin Infect Dis, 2004, 38(6):851-856.

[2] Zumla A, Raviglione M, Hafner R, et al. Tuberculosis. N Engl J Med, 2013, 368(8):745-755.

[3] Khan A, Sarkar D. A simple whole cell based high throughput screening protocol usingMycobacteriumbovisBCG for inhibitors against dormant and active tubercle bacilli. J Microbiol Metho-ds, 2008, 73(1): 62-68.

[4] Canetti G, Froman S, Grosset J, et al. Mycobacteria: laboratory methods for testing drug sensitivity and resistance. Bull World Health Organ, 1963, 29(5): 565-578.

[5] Gumbo T. New susceptibility breakpoints for first-line antituberculosis drugs based on antimicrobial pharmacokinetic/pharmacodynamic science and population pharmacokinetic variability. Antimicrob Agents Chemother, 2010, 54(4): 1484-1491.

[6] Steingart KR, Henry M, Laal S, et al. A systematic review of commercial serological antibody detection tests for the diagnosis of extrapulmonary tuberculosis. Postgrad Med J, 2007, 83(985): 705-712.

[7] Luna-Herrera J, Martínez-Cabrera G, Parra-Maldonado R, et al. Use of receiver operating characteristic curves to assess the performance of a microdilution assay for determination of drug susceptibility of clinical isolates ofMycobacteriumtuberculosis. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2003, 22(1): 21-27.

[8] Wise R. Maximizing efficacy and reducing the emergence of resistance. J Antimicrob Chemother, 2003, 51 Suppl 1: S37-42.

[9] Marais S, Thwaites G, Schoeman JF, et al. Tuberculous meningitis: a uniform case definition for use in clinical research. Lancet Infect Dis, 2010, 10(11): 803-812.

[10] 王婷，趙雁林，劉家云，等. 結核性腦膜炎臨床分離株基因型和耐藥表型的特征分析.中國防癆雜志，2013，35(9):660-667.

[11] 中國防癆協會基礎專業委員會．結核病診斷實驗室檢驗規程．北京：中國教育文化出版社，2006:54,56-57.

[12] Falzon D, Jaramillo E, Schünemann HJ, et al. WHO guidelines for the programmatic management of drug-resistant tuberculosis: 2011 update. Eur Respir J, 2011, 38(3):516-528.

[13] Kontos F, Maniati M, Costopoulos C, et al. Evaluation of the fully automated Bactec MGIT 960 system for the susceptibility testing ofMycobacteriumtuberculosisto first-line drugs: a multicenter study. J Microbiol Methods, 2004, 56(2): 291-294.

[14] Pang Y, Zhou Y, Zhao B, et al. Spoligotyping and drug resistance analysis ofMycobacteriumtuberculosisstrains from national survey in China. PLoS One, 2012, 7(3): e32976.

[15] Angra PK, Taylor TH, Iademarco MF, et al. Performance of tuberculosis drug susceptibility testing in U.S. laboratories from 1994 to 2008. J Clin Microbiol, 2012, 50(4): 1233-1239.

[16] Hong L, Jiang W, Pan H, et al. Brain regional pharmacokinetics of p-aminosalicylic acid and its N-acetylated metabolite: effectiveness in chelating brain manganese. Drug Metab Dispos, 2011, 39(10): 1904-1909.

[17] Di Paolo A, Gori G, Tascini C, et al. Clinical pharmacokine-tics of antibacterials in cerebrospinal fluid. Clin Pharmacokinet, 2013, 52(7): 511-542.

[18] Nuermberger E, Grosset J. Pharmacokinetic and pharmacodynamic issues in the treatment of mycobacterial infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis, 2004, 23(4): 243-255.

[19] Rubrichi S, Quaglini S. Summary of Product Characteristics content extraction for a safe drugs usage. J Biomed Inform, 2012, 45(2): 231-239.

[20] Garcia-Prats AJ, Rose PC, Hesseling AC, et al. Linezolid for the treatment of drug-resistant tuberculosis in children: a review and recommendations. Tuberculosis(Edinb), 2014, 94(2)：93-104.

[21] Cholo MC, Steel HC, Fourie PB, et al. Clofazimine: current status and future prospects. J Antimicrob Chemother, 2012, 67(2): 290-298.

[22] Han M, Jun SH, Lee JH, et al. Method for simultaneous analysis of nine second-line anti-tuberculosis drugs using UPLC-MS/MS. J Antimicrob Chemother, 2013, 68(9): 2066-2073.

[23] Fish DN, Abraham E. Pharmacokinetics of a clarithromycin suspension administered via nasogastric tube to seriously ill patients. Antimicrob Agents Chemother, 1999, 43(5): 1277-1280.

[24] Shandil RK, Jayaram R, Kaur P, et al. Moxifloxacin, ofloxacin, sparfloxacin, and ciprofloxacin againstMycobacteriumtuberculosis: evaluation of in vitro and pharmacodynamic indices that best predict in vivo efficacy. Antimicrob Agents Chemo-ther, 2007, 51(2): 576-582.

[25] Hall L, Jude KP, Clark SL, et al. Evaluation of the Sensititre MycoTB plate for susceptibility testing of theMycobacteriumtuberculosiscomplex against first-and second-line agents. J Clin Microbiol, 2012, 50(11): 3732-3734.

[26] Wang JY, Lee LN, Lai HC, et al. Fluoroquinolone resistance inMycobacteriumtuberculosisisolates: associated genetic mutations and relationship to antimicrobial exposure. J Antimicrob Chemother, 2007, 59(5): 860-865.

[27] Thwaites GE. Advances in the diagnosis and treatment of tuberculous meningitis. Curr Opin Neurol, 2013, 26(3): 295-300.

[28] Pardridge WM. Drug transport across the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab, 2012, 32(11): 1959-1972.

[29] Be NA, Lamichhane G, Grosset J, et al. Murine model to study the invasion and survival ofMycobacteriumtuberculosisin the central nervous system. J Infect Dis, 2008, 198(10): 1520-1528.

[30] Thwaites GE, Tran TH. Tuberculous meningitis: many questions, too few answers. Lancet Neurol, 2005, 4(3): 160-170.

[31] 桂徐蔚，肖和平，胡忠義，等. 氯法齊明對不同耐藥類型結核分枝桿菌的體外抑菌活性研究. 中華結核和呼吸雜志，2011,34(8)：579-581.

[32] Chaisson RE,Nuermberger EL.Confronting multidrug-resis-tant tuberculosis. N Engl J Med,2012,366(23):2223-2224.

(本文編輯：薛愛華)

Studies on the phenotypically resistant characteristics and therapeutic effect of antitubercular drugs onM.tuberculosisclinical isolates from the patients with tuberculous meningitis

WANGTing*,ZHAOYan-lin,PANGYu,FENGGuo-dong,SONGYuan-yuan,OUXi-chao,PENGJin-xiang,ZHAOGang,ZHANLi-ping.

*DepartmentofInternalMedicine,Yan’anHospitalAffiliatedtoKunmingMedicalUniversity,Kunming650200,China

ZHANLi-ping,Email: 2510765864@qq.com；ZHAOGang,Email:zhaogang@fmmu.edu.cn

Objective To study the phenotypically resistant characteristics and therapeutic effect of antitubercular drugs onM.tuberculosisclinical isolates from the patients with tuberculous meningitis (TBM). Methods Five hundred cerebrospinal fluid (CSF) from suspected patients with tuberculous miningitis were cultured with Bactec MGIT 960. Twenty-five strains were isotated, and then identified the species by 16S rRNA gene sequencing, detected 14 anti-tuberculous drug susceptibility by Bactec MGIT 960 and 12 anti-tuberculous drug susceptibility by the proportional method of conventional solid culture. The minimal inhibitory concentrations (MICs) of 16 anti-tuberculous drugs on these isolates were determined. The bacterial sterilization rate was determined by calculating the ratio of maximal plasma concentration (Cmax)/MIC to evaluated thetherapeutic effect of drugs onM.tuberculosis. Results Of 25M.tuberculosisisolates, 13 were resistant to any anti-tuberculous drugs, 3 were multidrug-resistant. The ratios of Cmax/MIC for rifampicin, moxifloxacin, levofloxacin, clofazimine, and p-aminosalicylic acid were 19.880, 63.333, 19.149, 75.000, and 50.855, respectively. Conclusion Most drug-resistant isolates from TBM patients were phenotypically resistant to isoniazid or rifampicin, the least isolates were phenotypically resistant to quinolone. The Cmax/MIC values of moxifloxacin, clofazimine, p-aminosalicylic acid, levofloxacin and rifampicin were higher, suggesting that the combination of high doses of rifampicin and fluoroquinolones might improve the therapeutic effect of TBM. P-aminosalicylic acid and clofazimine might play an better role in antituberculous treatment of TBM.

Tuberculosis, meningeal/drug therapy； Phenotype； Microbial sensitivity tests； Treatment outcome

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.006

“十二五”國家科技重大專項(2012ZX10003004)

650051 昆明醫科大學附屬延安醫院神經內科(王婷、戰麗萍)；第四軍醫大學西京醫院神經內科[王婷(研究生)、馮國棟、趙鋼]；中國疾病預防控制中心結核病預防控制中心 國家參比實驗室(趙雁林、逄宇、宋媛媛、歐喜超)；解放軍第四七八醫院空勤科(彭晉湘)

注：王婷和趙雁林為并列第一作者

戰麗萍，Email： 2510765864@qq.com；趙鋼，Email： zhaogang@fmmu.edu.cn

2015-02-16)