耐多藥肺結核患者血CD4細胞計數及痰菌分離鑒定和藥物敏感性試驗分析

胡永芳 張匯征 劉家秀 林一民 譚克輝

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·論著·

耐多藥肺結核患者血CD4細胞計數及痰菌分離鑒定和藥物敏感性試驗分析

胡永芳 張匯征 劉家秀 林一民 譚克輝

結核, 肺； CD4淋巴細胞計數； 革蘭陰性菌； 微生物敏感性試驗

耐多藥肺結核(MDR-PTB)是指肺結核患者感染的Mtb經體外證實至少同時對異煙肼和利福平耐藥[1]。MDR-PTB日趨增多，已成為肺結核防治的極大障礙，如合并呼吸道感染就更加棘手。各種感染性疾病的轉歸與細胞免疫功能密切相關，尤其是與T淋巴細胞功能的關系更加密切[2]。筆者回顧分析489例MDR-PTB患者CD4細胞和痰中病原菌及藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結果，探討CD4細胞與MDR-PTB患者呼吸道感染的相關性，為制定治療方案提供參考，現將結果報道如下。

資料和方法

一、 臨床資料

收集重慶市公共衛生醫療救治中心2013年1月至2014年8月住院治療的489例經痰結核分枝桿菌培養陽性、藥敏試驗證實為MDR-PTB，伴咳嗽、咯痰加重、出現肺部啰音或啰音增多、或(和)發熱，行血常規和影像學檢查支持呼吸道感染者，排除重癥監護、呼吸機輔助呼吸者，以及血液系統疾病、自身免疫性疾病、HIV抗體陽性等免疫功能低下者，其中男350例，女139例，年齡范圍13～85歲，平均年齡(40.04±15.03)歲。

206例患者痰標本鏡下檢查每低倍視野中白細胞>25個、上皮細胞<10個且白細胞有吞噬病菌或與病菌并存現象、培養出相應菌為病原菌組，其余283例患者則為無病原菌組。

二、方法

1.主要儀器和試劑：CD4細胞檢測采用美國BD公司流式細胞儀(FACSCount)、專用試管及配套試劑。微生物分析系統為美國德靈公司產品及配套鑒定及藥敏試驗板、輔助試劑，有關藥敏試驗紙片為英國Oxoid公司產品，血平板、嗜血桿菌平板、麥康凱平板和真菌培養平板等均購自重慶龐通公司。

2.標本采集與處理：按CD4細胞檢測要求采集患者靜脈血2.0 ml，防止凝集及溶血；不能立即檢測者可4 ℃保存24 h。在醫護人員指導下，患者留取合格痰標本置于無菌容器中并在2 h內送檢。

3.方法：CD4細胞檢測按照試劑盒說明書，采用流式細胞儀MutiSET軟件自動分析計數，計數單位：個/μl，本室參考值為414～1123 個/μl。按照《全國臨床檢驗操作規程》[3]推薦程序進行細菌培養，采用美國德靈微生物分析系統對分離菌株進行鑒定及藥敏試驗。采用抑制增強紙片法確認超廣譜β-內酰胺酶(extended-spectrum β-lactamase,ESBLs)菌株，葡萄球菌體外耐甲氧西林的檢測用K-B法頭孢西丁進行確認。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853、金黃色葡萄球菌ATCC25923、白色念珠菌ATCC10231，均由重慶市臨床檢驗中心提供。

三、 統計學處理

結 果

一、患者外周血CD4細胞檢測結果

489例患者CD4細胞總檢測結果在30～1894(438±258)個/μl；無病原菌組為86～1894(514±273)個/μl，38.5%(109/283)低于本室參考值下限；病原菌組為30～935(340±194)個/μl，75.7%(156/206)低于本室參考值下限。兩組CD4細胞平均數差異有統計學意義(U=8.23，P<0.01)。將CD4細胞每100個/μl作為一個區間，不同CD4細胞區間兩組平均年齡和患者分布比較見表1。

二、痰普通病原菌分布

489例患者283例無病原菌，206例培養出病原菌244株，其中革蘭陰性桿菌123株、真菌63株、革蘭陽性球菌58株，詳見表2。大腸埃希菌6株、肺炎克雷伯菌5株、陰溝腸桿菌2株產ESBLs，檢出率5.3%(13/244)；金黃色葡萄球菌6株、凝固酶陰性葡萄球20株耐甲氧西林，檢出率為10.7%(26/244)。在CD4<400個/μl區間病原菌感染者154例，占病原菌組的74.8%(154/206)，即大多數低于本室參考值下限。單一真菌35例，3例CD4≤200個/μl、12例201個/μl≤CD4≤400個/μl、10例401個/μl≤CD4≤600個/μl、10例CD4>600個/μl。細菌合并真菌28例，其中17例CD4≤200個/μl和7例201個/μl≤CD4≤400個/μl，4例分散在其他區間。

三、主要病原菌對常用抗菌藥物藥敏試驗結果

多數革蘭陰性桿菌對碳青霉烯類100.0%敏感, 對阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星敏感率均在50.0%以上，對哌拉西林、頭孢噻肟耐藥嚴重；革蘭陽性球菌對達托霉素、利奈唑胺、萬古霉素均100.0%敏感，對青霉素、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢曲松耐藥率均在60.0%以上(表3，4)。

表1 不同CD4細胞區間病原菌組和無病原菌組平均年齡和患者分布比較

表2 244株病原菌分布和構成比

注 其他真菌包括近平滑念珠菌、毛霉菌、隱球菌、煙曲菌

表3 常用抗菌藥物對主要革蘭陰性桿菌的耐藥率(%)

注 括號中分數為“對某一類菌做某一抗生素藥敏試驗時，耐藥菌株數與全部菌株數之比”

表4 常用抗菌藥物對主要革蘭陽性球菌的耐藥率(%)

注 括號中分數為“對某一類菌做某一抗生素藥敏試驗時，耐藥菌株數與全部菌株數之比”

討 論

結核分枝桿菌引起的免疫反應主要是細胞免疫，以CD4+T淋巴細胞為主，它激活效應細胞，使其他免疫細胞聚集于感染部位以增強宿主免疫反應[4]。相當一部分MDR-TB患者存在細胞免疫功能低下[5]，MDR-PTB患者在抗結核治療時還大量使用糖皮質激素，免疫功能被進一步抑制。本研究中患者血CD4細胞普遍偏低，病原菌組低于無病原菌組，兩組CD4細胞平均數差異有統計學意義(U=8.23，P<0.01)。表1顯示病原菌組74.8%(154/206)在CD4<400個/μl以下，除CD4<100個/μl、301個/μl≤CD4<400個/μl區間外兩組患者分布差異均有統計學意義(P<0.05)；病原菌組平均年齡明顯大于無病原菌組(t=5.70，P<0.01)。細菌、細菌合并真菌感染者所占比率有隨CD4細胞減少而增多的趨勢，但不同CD4細胞區間表現不完全相同。CD4+T淋巴細胞數量的多少是機體免疫狀態的最好體現，機體主要通過CD4+T淋巴細胞介導的細胞免疫激活巨噬細胞,直接或間接增強殺菌效應[6]。病原菌組患者CD4細胞少,難以依靠細胞免疫清除病原菌；呼吸系統疾病大多數患者都與免疫功能降低有關，而且免疫功能降低，又容易發生感染[7]；老年人胸腺退化，淋巴細胞亞群組成及活性等均降低，導致細胞免疫功能下降[8]，易患各種感染性疾??；無病原菌組CD4細胞相對較多，一定程度上可以靠自身細胞免疫清除病原菌，少數未被清除但達不到痰中病原菌判定標準而被視為無病原菌。檢測MDR-PTB血CD4細胞，可作為評估患者免疫力狀況、預防、治療、合理有效干預呼吸道感染的參考。

MDR-PTB患者痰結核分枝桿菌培養持續陽性，導致患者呼吸道免疫力低下，容易發生呼吸道感染[9]；患者多合并支氣管擴張、肺部多發空洞、肺纖維化、胸膜增厚等諸多肺部病變，需要長時間的治療，進一步增加了呼吸道感染的可能性[10]。如發生呼吸道感染，病情迅速惡化，采取有效措施積極處理對病情好轉意義重大。本研究中痰普通病原菌以革蘭陰性桿菌為主(50.4%)，肺炎克雷伯菌、陰溝腸桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼-溶血不動桿菌、大腸埃希菌居前5位，前4位主要存在于呼吸道或為醫院感染重要病原菌，大腸埃希菌是腸道正常寄生菌，移居腸道外為機會致病菌。其次為真菌(25.8%)和革蘭陽性球菌(23.8%)，真菌感染率明顯高于其他相關流行病學調查結果[11]，以白色念珠菌為主；因患者應用抗生素種類多、時間長而致菌群失調使真菌大量繁殖。革蘭陽性球菌中表皮葡萄球菌比率高，可能與抗生素使用不規范擾亂自身平衡所致， ESBLs、MRSA、MRCNS等多重耐藥菌的產生與長期使用廣譜抗生素、濫用抗生素相關，造成臨床治療困難，應引起高度重視。

痰普通細菌藥敏試驗結果顯示：前5種革蘭陰性桿菌除銅綠假單胞菌外未發現對碳青霉烯類耐藥，表3顯示：多數革蘭陰性桿菌對哌拉西林-他唑巴坦、阿米卡星、慶大霉素、左氧氟沙星較敏感，對哌拉西林、頭孢噻肟、頭孢曲松耐藥嚴重。肺炎克雷伯菌對其他抗生素耐藥率較低；陰溝腸桿菌對妥布霉素、左氧氟沙星等多種抗生素耐藥率為45.0%～55.0%，對其他6種抗生素耐藥率較低；銅綠假單胞菌對亞胺培南耐藥率為70.6%，對其他抗生素耐藥率較低；鮑曼-溶血不動桿菌對本中心常用抗生素耐藥率普遍較低；大腸埃希菌對多種抗生素100.0%耐藥。阿米卡星也是二線抗結核藥物，雖可作為經驗治療首選抗生素，但由于其腎毒性較大，應慎重使用。ESBLs菌株會產生抗生素滅活酶，可裂解頭孢菌素類和青霉素類抗生素的β-內酰胺環結構，使其喪失抗菌活性，因此β-內酰胺類抗生素應與相應酶抑制劑聯合使用而發揮抗菌作用。美洛培南對革蘭陰性桿菌廣泛敏感，在所檢測抗生素中抗菌活性最強，可作為治療耐藥菌重癥感染首選藥物。碳青霉烯類常引起肝腎功能損傷、胃腸道反應等多種不良反應，不建議經驗性使用。革蘭陽性球菌對青霉素、氨芐西林、氨芐西林-舒巴坦、頭孢曲松等耐藥嚴重，對復方新諾明、利福平、四環素、慶大霉素敏感率相對較高。未發現對達托霉素、利奈唑胺、萬古霉素耐藥菌株，萬古霉素不良反應多且嚴重，不推薦首選使用。MRSA、MRCNS具有多耐藥和強耐藥性，與第3代頭孢菌素和碳青霉烯類的濫用有關。菌株的來源、培養條件、使用抗生素等情況不同而耐藥性不同；即便菌種相同，但在不同醫院或者地區的耐藥性也會不同；臨床醫生應了解流行菌株耐藥性，合理使用抗生素。

目前，有關CD4+T淋巴細胞與MDR-PTB患者痰中病原菌相關性研究未見報道，蔡青山、毛良平、宋曉東等[9-10,12]只作了MDR-PTB呼吸道感染痰普通細菌及藥敏試驗結果分析，且收集的病例資料較少；我們收集了較多病例資料，在CD4+T淋巴細胞與痰中普通病原菌同步檢測結果趨勢和意義作了研究，為本研究的獨到之處。

綜上所述，MDR-PTB患者存在以CD4細胞下降為突出表現的細胞免疫受損，易合并呼吸道感染，痰中病原菌菌株多元化, 耐藥廣泛而復雜，嚴重困擾著患者的治療。檢測T淋巴細胞亞群評估細胞免疫功能已成為各種感染性疾病診斷及治療監測的一項重要手段[2]；建議建立CD4淋巴細胞、呼吸道病原菌及藥敏試驗常規監測,以便為患者制定個性化治療方案提供參考，使其得到及時有效治療。此外，本研究為回顧性研究，未對性別、病程、營養狀況等因素是否影響研究結果作進一步分析，有待今后繼續收集病例作相應的研究。

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(本文編輯：范永德)

CD4 cell count,sputum bacteria isolation identification and its drug sensitivity test of resistance in multi-drug resistant pulmonary tuberculosis patients

HUYong-fang,ZHANGHui-zheng,LIUJia-xiu,LINYi-min,TANKe-hui.

LaboratoryDepartmentofChongqingMunicipalPublicHealthTreatmentCenter，Chongqing400036,China

LINYi-min,Email：lym_001@aliyun.com；TANKe-hui,Email: 403724868@qq.com

Tuberculosis, pulmonary； CD4 lymphocyte count； Gram-negative bacteria； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.04.007

400036 重慶市公共衛生醫療救治中心檢驗科(胡永芳、張匯征、劉家秀)；重慶市腫瘤研究所檢驗科(林一民)；重慶醫藥高等?？茖W校(譚克輝)

林一民，Email：lym_001@aliyun.com；譚克輝,Email: 403724868@qq.com

2014-11-11)