結核分枝桿菌Rv1419蛋白抗原表位的預測

劉銀萍 王全立 張俊仙 梁艷 陽幼榮 白雪娟 吳雪瓊

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·論著·

結核分枝桿菌Rv1419蛋白抗原表位的預測

劉銀萍 王全立 張俊仙 梁艷 陽幼榮 白雪娟 吳雪瓊

目的 預測結核分枝桿菌Rv1419蛋白的抗原表位。方法 利用DNAStar軟件包中Protean軟件對Rv1419氨基酸序列進行分析，采用包括二級結構、親水性、抗原性、可及性、柔韌性、電荷分布等多參數預測其二級結構及T細胞和B細胞抗原表位。結果 Rv1419蛋白具有豐富的二級結構和多處抗原指數較高的區段，含有少數潛在的B細胞抗原肽表位(可能在67～70、72～82、142～154、131～137位氨基酸殘基或其附近)，這些表位抗原性較好，都含有β轉角和無規則卷曲結構，呈現在表面的可能性和柔韌性都較大。該蛋白含有較多潛在的T細胞抗原肽表位(可能在5～15、18～22、29～32、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、110～114、117～123、126～128、136～140位氨基酸殘基或其附近)。結論 結核分枝桿菌Rv1419蛋白是一個T細胞抗原表位占優勢的蛋白抗原，也存在B細胞抗原表位，本研究結果為該蛋白抗原表位的進一步研究、應用奠定了基礎。

表位； 細菌蛋白質類； 蛋白質結構, 二級； 結核分枝桿菌

目前，Mtb標準菌株H37Rv和臨床株CDC1551全基因組測序均已完成，但對Mtb感染后如何與宿主相互作用尚不十分清楚。Mtb抗原能夠刺激機體產生免疫應答，并能與免疫應答產物(如抗體和致敏淋巴細胞)在體外結合，發生免疫效應。宿主免疫細胞通過其表面受體識別的并不是整個蛋白質抗原分子，而是抗原肽分子中由特殊的化學基團組成的結構，即表位(epitope)，又稱為抗原決定簇(antigenic determinant)。一個蛋白質抗原不僅含有B細胞、T細胞[輔助性T細胞(T helper cell,Th細胞)、CD8+、細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocyte，CTL)]等和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK細胞)與免疫識別密切相關的表位結構，也含有一些對于保護性免疫不利的表位結構。因此，抗原優勢表位的篩選和鑒定對表位疫苗的研制具有重要的意義，Mtb蛋白抗原表位的免疫學特性成為當前研究的熱點之一。

圖1 結核分枝桿菌Rv1419蛋白二級結構和抗原表位預測

Mtb Rv1419基因全長474 bp，編碼157個氨基酸，蛋白等電點4.1155，預測相對分子質量為16 853(16.853 kDa)，成熟蛋白相對分子質量為13 600(13.6 kDa)[1]。其N端含有33個氨基酸的信號肽(MGELRLVGGVLRVLVVVGAVFDVAVLNAG-AASA)，存在于H37Rv株的培養濾液中，可能是分泌蛋白[2-4]。生物信息學分析顯示，Rv1419蛋白可能是凝集素或凝集素樣分子[1,5]，這種凝集素可以調節多種生物過程，比如細胞與細胞間的黏附、細胞的有絲分裂和固有免疫過程等，尤其是在宿主-病原體相互作用中發揮重要作用。因此，本研究首次應用DNAStar生物信息學軟件對Mtb Rv1419蛋白進行抗原表位預測，為今后進一步的深入研究和應用，尤其是疫苗和免疫診斷試劑的開發奠定理論基礎。

材料和方法

1. 抗原表位分析軟件：DNAStar軟件包是DNASTAR有限公司開發的生物軟件，可在計算機上進行DNA和蛋白質分析。用DNAStar軟件包中Protean軟件對蛋白的二級結構和抗原表位進行分析和預測[6]。

2. Mtb Rv1419蛋白氨基酸全序列(157個氨基酸殘基)：見圖1。

3. Rv1419蛋白二級結構的預測：采用Gamier-Robson方法、Chou-Fasman方法和Coiled Coil方法預測Rv1419蛋白二級結構。Gamier-Robson方法是通過計算特定氨基酸殘基在特定結構內部的可能性來預測蛋白質二級結構；Chou-Fasman方法是通過序列氨基酸殘基的晶體結構來預測蛋白質二級結構；Coiled Coil方法是預測跨膜區的阿爾法螺旋。

4. Rv1419蛋白抗原表位的預測：用Kyte-Doolittle方法、Hopp-Woods方法和Eisenberg方法對Rv1419蛋白的疏水性和親水性進行了分析；用Emini方法預測蛋白的表面可能性；用Karplus-Schulz方法預測蛋白質骨架區的柔韌性；以Jameson-Wolf方法預測蛋白潛在的抗原表位，以AMPHI方法預測蛋白免疫優勢輔助性T淋巴細胞抗原位點，以Rothbard-Taylor方法預測含有特定基序(motif)的潛在 T 淋巴細胞抗原表位，以Sette MHC Motifs方法預測短肽上與老鼠 MHC Ⅱ d 型蛋白質相互作用的抗原位點，最后綜合評價Rv1419蛋白抗原表位。

結 果

1.Rv1419蛋白二級結構和抗原表位預測：見圖1。

2. Rv1419蛋白二級結構的預測：蛋白質的二級結構與其B細胞表位的分布關系密切。綜合采用Gamier-Robson、Chou-Fasman和Coiled Coil共3種方法預測Rv1419蛋白二級結構的結果顯示，α螺旋結構形成在10～15、18～26、37～40、95～99氨基酸殘基，數量較少，不存在跨膜區的α螺旋結構；β折疊數量較多，分布較均勻(位于1～27、33～50、56～62、68～72、79～84、88～93、96～101、103～107、111～115、118～130、137～141、153～156氨基酸殘基)，其中在4～26、56～61、125～130、138～141氨基酸殘基的分值較高。該蛋白在各β折疊單元之間存在較多長短不一的轉角；在28～29、73～77、85～86、94～95、132～135氨基酸殘基存在無規則卷曲。

3．Rv1419蛋白的親水性分析：用Kyte-Doolittle方法對Rv1419蛋白的疏水性和親水性進行了分析，結果顯示：Rv1419蛋白存在7個疏水性區域(位于2～30、43～52、56～63、83～89、91～94、121～123、125～131氨基酸殘基)和6個親水性區域(36～42、53～55、64～82、105～114、116～120、132～157)。親水性區域提示其暴露于表面的概率較大，作為抗原表位的可能性也最大。

4. Rv1419蛋白的表面可能性和柔韌性分析：Rv1419蛋白呈現在表面可能性較大的區域主要是在38～40、67～70、72～79、147～154氨基酸殘基，其他部位展示的可能性較小或表現為負值。

Rv1419蛋白含有較多的柔韌性區域(位于33～45、50～55、63～70、75～81、86～88、114～123、131～141、145～154氨基酸殘基)，且分布比較均勻。提示該蛋白肽段的柔韌性較大，發生扭曲、折疊的概率較高，能形成豐富的二級結構。

5. Rv1419蛋白B細胞和T細胞抗原表位的預測分析：聯合上述蛋白質結構及抗原性預測方法，綜合分析推測Rv1419蛋白潛在的B細胞抗原表位位于67～70、72～82、142～154、131～137氨基酸殘基，若再結合親水性、表面可及性和柔韌性，前3個多肽親水性指數比較高，暴露于表面的概率較大，肽段的柔韌性較大，發生扭曲、折疊的概率較高，能形成豐富的二級結構。因此，作為B細胞抗原表位的可能性較大，尤其是蛋白質的C端具有較好的親水性、表面可及性和柔韌性，將是很好的B細胞抗原表面區域。

潛在的T細胞抗原表位位于5～15、18～22、29～32、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、110～114、117～123、126～128、136～140氨基酸殘基，其中9～15、43～55、58～62、64～68、86～97、99～109、119～123、126～128位氨基酸殘基可能是免疫優勢的輔助性 T 淋巴細胞抗原位點，11～16和28～33位氨基酸殘基可能是與小鼠 MHC Ⅱd 型蛋白質相互作用的抗原位點。

討 論

結核分枝桿菌生長緩慢，天然蛋白抗原的獲取較困難，通過基因工程技術獲得重組蛋白抗原進行研究應用已成為一個簡便、有效的途徑。此外，近年來結核病疫苗如重組蛋白疫苗、重組卡介苗、DNA疫苗的研發[7]，有些己經進入臨床試驗，而生物信息技術的迅猛發展和互聯網數據庫的開發利用已為確定蛋白優勢抗原表位提供了有效的方法，使得研究者不需要克隆整個蛋白，可根據不同的需求有選擇地克隆抗原表位，去除了蛋白抗原中的不利因素，使免疫反應集中針對強免疫原性的抗原表位；預測到更可能成為抗原表位的肽段，也就不需要合成許多重疊的多肽段進行篩選、評價，只需根據生物信息學軟件的預測結果選擇合成不同的多肽，顯著降低了候選肽段的數目，減少了合成肽段的費用和體外試驗鑒定的工作量；而且縮短了時間，也避免遺漏掉一些較長的抗原表位。利用生物信息學軟件的強大功能進行表位預測，將為表位疫苗的發展、免疫診斷制劑的開發開辟新的路徑[8]。

DNAStar軟件包中Protean軟件已被用于蛋白抗原表位的預測[9-10]，如丁淑琴等[10]應用該軟件分析結核分枝桿菌早期分泌性抗原靶6(ESAT-6)二級結構，結果顯示其二級結構中含有較多的α螺旋結構(占78%)，β折疊、轉角、無規則卷曲較少，分別只有1%、5%和16%。而本研究應用DNAStar軟件包中Protean軟件對Rv1419氨基酸序列進行分析，預測該蛋白的二級結構與結核分枝桿菌ESAT-6的二級結構明顯不同，Rv1419蛋白β折疊、轉角的數量較多，而α螺旋結構較少。α螺旋和β折疊化學鍵鍵能比較高，形態固定，結構規則不易變形，常處于蛋白質內部，較難結合抗體，一般不作為抗原表位。β轉角為凸出結構，與無規則卷曲多出現在蛋白質的表面，結構松散，有利于與抗體結合，較可能成為B細胞抗原表位。

本研究圖1清楚地顯示了Rv1419蛋白可能的B細胞和T細胞抗原優勢表位，發現該蛋白含有較多潛在的T細胞抗原肽表位和少數潛在的B細胞抗原肽表位，是一個T細胞抗原表位占優勢的蛋白抗原，與筆者前期的研究結果及Nogueira等[1]的研究報道一致。Rv1419蛋白具有很好的免疫原性和抗原性，在活動性肺結核患者中，可刺激外周血單個核細胞(PBMC)產生大量的IFN-γ；在活動性肺結核患者的血清中可檢出高滴度的抗Rv1419 IgG抗體；其DNA疫苗免疫小鼠后可在小鼠體內高效表達，并誘導機體產生體液免疫應答和強的細胞免疫應答[11]。鑒于抗結核免疫主要是細胞免疫，該抗原可能在抗結核分枝桿菌感染的保護性免疫應答中發揮重要和獨特的作用。本研究結果為該抗原進一步深入研究，使之成為疫苗組分之一或細胞免疫刺激原奠定了理論基礎。

但下列幾個問題值得注意：(1)應用生物信息學軟件預測出來的只是理論優勢表位，還需要進一步通過功能試驗方法進行驗證，如B細胞表位可通過Western blot和ELISA分析其抗原抗體反應親和力；T細胞表位可通過T 細胞增殖性試驗、細胞殺傷實驗、流式細胞技術、酶聯免疫斑點試驗(enzyme linked immunospot assay, ELISPOT)技術等鑒定。目前，筆者正在進行Rv1419蛋白潛在的T細胞抗原肽表位的驗證工作。(2)應用DNAStar軟件包中Protean軟件進行表位預測，并不一定完全正確，有些優勢表位可能未能預測到，也可能存在預測錯誤，可多選擇幾個公認的軟件進行預測，然后再合成多肽表位做進一步的體外驗證試驗。(3)只有少部分B細胞表位是線性表位，絕大部分(約90%)是構象型表位[11]，而DNAStar軟件是在氨基酸一級結構的基礎上應用多個參數預測B細胞抗原表位，如二級結構、親水性、抗原性、可及性、柔韌性、電荷分布等，忽略了各氨基酸之間的分子作用力，因此， 對構象依賴的B細胞表位的預測有一定局限性。(4)T細胞表位都是線性表位[12]，但DNAStar軟件用于預測T細胞表位的參數較少，也不能進一步預測Th1型T細胞表位和CTL表位，這不利于抗結核疫苗的設計。Zhu等[13]應用SYFPEITHI超基序法、BIMAS量化基序法和NetCTL法預測并合成了幾個結核分枝桿菌Rv1410c 蛋白的CTL 表位，驗證發現天然肽表位Rv1410c-p510 (TLAPQVEPL)和改造的肽表位Rv1410c-p510-1Y9V (YLAPQVEPV)與HLA-A*0201分子均具有較好的親和力和穩定性，并能夠誘導IFN-γ釋放，但Rv1410c-p510只能在體外誘導CTL反應，而Rv1410c-p510-1Y9V無論在體外還是在體內均能夠誘導CTL反應。因此，筆者將聯合應用其他抗原表位預測軟件進一步預測T細胞表位，以提高預測的準確度和特異度。

總之，結核分枝桿菌Rv1419是一個T細胞抗原表位占優勢的蛋白抗原，也存在B細胞抗原表位。應用生物信息學軟件預測蛋白抗原表位可為蛋白免疫學特性的研究及其應用奠定理論基礎。

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(本文編輯：薛愛華)

Prediction of epitopes ofMycobacteriumtuberculosisRv1419 protein

LIU Yin-ping*, WANG Quan-li，ZHANG Jun-xian, LIANG Yan, YANG You-rong, BAI Xue-juan, WU Xue-qiong.

*Department of Blood Transfusion, The Affiliated Hospital of the Academy of Military Medical Sciences，Beijing 100071, China

Corresponding author： WANG Quan-li，Email：13691110351@163.com WU Xue-qiong，Email：wu-xueqiong@263.net

Objective To predict the epitopes of Mycobacterium tuberculosis Rv1419 protein. Methods The amino acid sequence of Rv1419 protein was input and predicted B cell and T cell epitopes using multi-parameters including the secondary structure, hydrophilicity, antigenicity, accessibility, flexibility, charge distribution by Pro-tean software of DNAStar software package. Results The Rv1419 protein has rich secondary structure and multiple sections with higher antigenicity. There were a few potential B cell epitopes at 67-70, 72-82, 142-154, 131-137 amino acid residues or nearby, these epitopes had better antigenicity, contained beta angle and irregular coil structure, present in the surface probability and had larger flexibility. There also were more potential T cell epitopes of the protein containing at 5-15, 18-22, 29-32, 43-55, 58-62, 64-68, 86-97, 99-109, 110-114, 117-123, 126-128, 136-140 amino acid residues or nearby. Conclusion Mycobacterium tuberculosis Rv1419 protein is a T-cell-epitope dominant antigen, B cell epitopes also exists, which will lay the foundation for its further study and application.

Epitopes； Bacterial proteins； Protein structure, secondary； Mycobacterium tuberculosis

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.011

100071 北京，軍事醫學科學院附屬醫院輸血科(劉銀萍、王全立)；解放軍第三〇九醫院全軍結核病研究所 全軍結核病防治重點實驗室[劉銀萍(研究生)、張俊仙、梁艷、陽幼榮、白雪娟、吳雪瓊]

王全立，Email:13691110351@163.com；吳雪瓊，Email: wu-xueqiong@263.net

2014-08-07)