基因芯片檢測耐利福平結核分枝桿菌準確性的Meta分析

冉兵 蔡林

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·論著·

基因芯片檢測耐利福平結核分枝桿菌準確性的Meta分析

冉兵 蔡林

目的 對基因芯片方法在檢測耐利福平結核分枝桿菌的準確性進行系統評價，為基因芯片技術應用于臨床檢測耐藥結核分枝桿菌的必要性提供證據。方法 計算機檢索The Cochrane Library(2014年第1期)、 PubMed、EMbase、Wanfang Data、CNKI數據庫，檢索時限均為建庫至2014年2月。由2位研究者根據納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料，采用評價診斷準確性質量研究(quality assessment of diagnostic accuracy studies，QUADAS)條目評價納入研究論文的方法學質量，檢出相關文獻223篇,按照標準納入22篇文獻。采用Meta-DiSc 1.4軟件對其敏感度(SEN)、特異度(SPE)、陽性似然比(+LR)、陰性似然比(-LR)、診斷比值比(DOR)進行異質性檢驗和合并分析，繪制匯總受試者工作特征(SROC)曲線，計算曲線下面積(AUC)。 結果 共納入22篇文獻(包括一篇多中心研究文獻)，25個研究，包括4879株經傳統藥敏試驗鑒定結核分枝桿菌菌株，其中耐RFP菌株(1314株)、敏感菌株(3565株)。基因芯片技術檢測Mtb對RFP耐藥的SEN合并為0.89[95%CI(0.87～0.91)]、SPE合并為0.98[95%CI(0.97～0.98)]、+LR為30.89[95%CI(22.15～43.06)]、 -LR為0.10[95%CI(0.07～0.15)]、 DOR合并為354.06[95%CI(212.09～591.07)]、AUC為0.9833。結論 基因芯片方法具有較好的診斷價值；以傳統藥敏法為金標準，基因芯片方法特異度、敏感度，診斷OR值均較高，說明其在Mtb對RFP耐藥檢出率較高，可作為臨床結核分枝桿菌耐藥檢測的輔助手段。

結核分枝桿菌； 利福平； 寡核苷酸序列分析； 結核, 抗多種藥物性； 細菌蛋白質類； Meta分析

20世紀40～50年代初隨著一些抗結核藥物的陸續出現，Mtb得到了階段性的控制。但是由于公共衛生監督力度的不足，在部分抗生素的廣泛濫用與合并艾滋病感染等多種因素下，結核病疫情又呈上升趨勢，尤其是在發展中國家，如印度、中國等更是成為耐多藥結核病的重災區[1]。在中國約有1/10的結核病患者是耐多藥結核病(至少對一線藥物異煙肼(INH)和利福平(RFP)耐藥，MDR-TB)，在所有新發結核病患者中MDR-TB的比例更是達到5.7%，且8%的MDR可被定義為廣泛耐藥結核病(即至少對一線藥物INH和RFP耐藥外，還同時對卡那霉素、阿米卡星或卷曲霉素中任何一種注射類藥物和任何一種氟喹諾酮類藥物耐藥，XDR-TB)[2]，甚至部分地區已經出現全耐藥的Mtb。

Mtb感染、特別是耐藥Mtb感染率的增加，已是一個廣泛的世界醫療問題[3]。Mtb因生長緩慢，應用傳統的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)檢測，至少需4～8周時間，這對臨床的早期診斷和治療帶來了障礙[4]。Mtb及其耐藥性的快速鑒定對結核病早期治療和控制耐藥菌的傳播具有重要的意義。因此，近年來建立了多種檢測Mtb耐藥基因的方法用于快速檢測耐藥Mtb，以彌補傳統藥敏試驗的不足[5]。基因芯片檢測方法是利用熒光標記的特定基因探針與Mtb基因雜交，經芯片掃描儀掃描，檢測熒光信號，比較與標準株間熒光信號的異同或通過序列分析，判定耐藥基因是否存在突變，確定Mtb的耐藥情況。基因rpoB已被證明是Mtb耐RFP的相關基因，并已確定了該基因的熱突變(突變頻率較高的基因位點)位點[6]。即使已有很多有關基因芯片檢測Mtb耐藥基因rpoB的研究，但因限于實驗室資源有限，多為小樣本研究，到目前為止還罕有多中心大樣本的研究評價該方法與傳統藥敏試驗檢測耐RFPMtb的敏感度和特異度，特別是在耐藥結核病發生較嚴重的地區[7]。為了進一步評價基因芯片檢測方法在臨床的應用前景，筆者帶著該問題對國內外文獻進行了檢索，嘗試通過Meta分析的方法得出較為可信的結果供業內人士參考。

資料和方法

一、納入與排除標準

1. 研究類型：國內外已發表的基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥的診斷性試驗論文。文種限中、英文。

2. 研究對象： ① 研究菌株為傳統藥敏試驗確定的Mtb菌株(敏感株和耐RFP菌株)，以及用于對照的標準菌株H37Rv。② 能獲得基因芯片方法獨立診斷Mtb對RFP耐藥的真陽性值(TP)、假陽性值(FP)、假陰性值(FN)、真陰性值(TN)等原始測量數據。

3. 診斷方法：待評價試驗為基因芯片方法檢測，以傳統藥敏試驗結果為金標準。

4. 結局指標:敏感度(SEN)、特異度(SPE)、陽性似然比(+LR)、陰性似然比(-LR)、診斷比值比(DOR)，以及匯總受試者工作特征(SROC)曲線下面積(AUC)。

5. 排除標準：① 會議摘要；② 重要資料報告不全者；③ 測量指標不明確者；④ 不同期刊重復發表的文獻；⑤ 對同一個機構的重復報道，只納入其中質量最好者；⑥ 排除僅題目涉及耐藥Mtb和rpoB基因或基因序列，而與基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥無關的研究。

二、 檢索策略

1. 計算機檢索:The Cochrane Library(2014年第1期)、 PubMed、EMbase、Wanfang Data、CNKI數據庫，收集采用基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥的診斷性試驗，檢索時限均為建庫至2014年2月。

2. 檢索詞選擇:在 PubMed、EMbase、The Cochrane Library中英文檢索詞為“tuberculosis、tuberculosis and drug resistance、tuberculosis and drug resistance and gene chip、 tuberculosis and drug resistance and gene chip and rifampicin”。Wanfang Data、CNKI數據庫中文檢索詞為“結核分枝桿菌，耐藥結核分枝桿菌，耐利福平結核分枝桿菌，基因芯片，快速檢測”。

3. 檢索步驟：文獻檢索分3個步驟：①在上述數據庫中檢索相關的原始論文，并對文獻、文題、摘要、所用的關鍵詞及主題詞進行分析，進一步確定文獻檢索關鍵詞；②運用所有相關關鍵詞及主題詞進行檢索，若摘要和納入標準相符合，則閱讀全文；③通過所獲文獻進行進一步手工和電子數據庫檢索。

三、 文獻篩選與資料提取

由2 位研究者根據納入與排除標準獨立篩選文獻、提取資料，所有進入篩選的文獻均可獲得全文資料；如遇分歧討論解決。提取內容包括研究的一般信息(文獻編號、文題、年份、作者、樣本量、統計方法)，患者信息(性別、年齡等)、是否與所建標準比較TP、FP、FN、TN。初檢出相關文獻223篇，其中中文117篇，英文106篇。剔除重復發表及明顯不符合的文獻，納入標準的文獻170篇，經閱讀文題和摘要，納入57篇。進一步查找和閱讀全文，排除其中的部分數據不全及未與金標準進行對照的研究論文，最后納入22篇文獻(包括一篇多中心研究文獻)，25個研究，包括4879株經傳統藥敏試驗鑒定結核分枝桿菌菌株，其中耐RFP菌株(1314株)、敏感菌株(3565株)(圖1、表1)。

圖1 PRISMA文獻篩選四階段流程圖

表1 納入研究論文中基因芯片技術檢測Mtb的結果統計

注 所有納入文獻的研究均為前瞻性研究，均以傳統藥敏試驗為金標準，均未描述是否使用盲法。TP：真陽性；FP：假陽性；TN：真陰性；FN：假陰性。文獻21為多中心研究文獻，分別在不同的城市(a:呼和浩特；b:連云港；c:開封；d:永川)進行了實驗

四、納入研究的方法學質量評價

應用Whiting 等[8]制訂的評價診斷準確性質量研究(quality assessment of diagnostic accuracy studies，QUADAS)工具評價納入文獻質量，其中第3、8、9 條條目為非必須評價條目。每一條目以“是”、“否”、“不清楚”評價，“是”為滿足此標準，“否”為不滿足此標準，部分滿足或者從文章中無法得到足夠的信息為“不清楚”。 納入的22篇論文的25個研究中，文獻[6-13,15-30]中的24個研究均滿足了質量評價的14條標準，文獻[14]未滿足第10、11條標準(表2)。

五、 統計學分析

參考《超聲造影對乳腺腫塊良惡性鑒別診斷價值的系統評價》一文對診斷性Meta分析格式[9]，Meta 分析采用Meta-DiSc 1.40[10]軟件進行。統計學分析指標和內容包括：SEN、SPE、+LR、-LR、DOR、SROC、AUC。

六、 異質性檢驗

將數據輸入Meta-DiSc 1.40軟件，采取隨機效應模型進行初步合并，利用統計量I2來檢驗其統計異質性，憑借醫學專業知識對臨床異質性的來源可能進行分析，當異質性較大時應用Meta-DiSc 1.40軟件進行逐一亞組分析，尋找異質性來源、分析原因并剔除導致異質性的納入研究。如果I2≥50%則接受隨機效應模型合并結果，若I2<50%則可采用固定效應模型進行合并分析。

表2 納入研究文獻中的方法學質量評價

結 果

一、 Meta分析結果

ROC平面散點圖不呈典型的“肩臂狀”，提示無閾值效應；Spearman相關系數=0.192，P=0.380，提示尚不能認為存在閾值效應。DOR的Cochran-Q值為21.77，P=0.474，可認為多個同類研究具有同質性。各項結局指標的I2均<50%，提示各研究由非抽樣誤差所引起的異質性較小，故采用固定效應模型進行分析。固定效應模型Meta分析結果顯示：SEN合并為0.89(95%CI=0.87～0.91)、SPE合并0.98(95%CI=0.97～0.98)、 +LR為30.98(95%CI=22.15～43.06)、 -LR為0.10(95%CI=0.07～0.15)、 DOR合并為354.06(95%CI=212.09～591.07)、AUC為0.9833。若I2>50%則選擇隨機效應模型進行分析。將每個研究逐一剔除后進行敏感度分析，結果顯示SEN和SPE未見明顯改變，說明結果穩定性好(圖2～6)。

二、異質性結果

本研究應用Meta-diSc 1.4軟件檢測，結果敏感度I2為42.2%，特異度I2為47.5%，陽性預測值I2為23.3%,陰性預測值I2為24.5%，診斷性比值比I2為43.0%。

討 論

一、 異質性來源

Higgins等[31]在2003年將異質性分為低、中、高3個程度，分別用I2值25%、50%、75%表示。2011年以后Cochrane標準[32]將異質性分為4個程度：I2值0～40%，輕度異質性，40%～60%中度異質性，60%～75%較大異質性，75%～100%，很大異質性。I2作為一個率，用于描述由各個研究所致的，而非抽樣誤差所引起的變異(異質性)占總變異的百分比，克服了Q統計量對納入個數的依賴，可以更好地衡量多個研究結果間異質性程度的大小。在Cochrane系統評價中，只要I2≤50%，起異質性是可以接受的[31]，我們可以認為異質性由偶然因素引起，而非各研究間差異。由于本研究的敏感度和特異度I2均>40%，為了進一步分析其異質性來源，推測其異質性是否與國內外研究等差異有關，進行了分析對比：國內研究敏感度略高于國外研究，異質性較國外低；而國外研究特異度、診斷OR值、AUC、Q值較國內研究高，異質性低(表3)。

文獻[21]為多中心研究文獻，分別在不同城市(a：呼和浩特；b：連云港；c：開封；d：永川)進行了研究圖2 22篇文獻中基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥的敏感度分析

文獻[21]為多中心研究文獻，分別在不同城市(a：呼和浩特；b：連云港；c：開封；d：永川)進行了研究圖3 22篇文獻中基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥的特異度分析

文獻[21]為多中心研究文獻，分別在不同城市(a：呼和浩特；b：連云港；c：開封；d：永川)進行了研究圖4 22篇文獻中基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥的診斷OR值分析

圖5 22篇論文中基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥的陽性預測值和陰性預測值分析

圖6 納入的22篇論文中研究基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥的SROC曲線

表3 Meta DiSc 1.4軟件隨機效應模型合并分析結果(敏感度分析和亞組分析)

注 ALL:納入的所有研究；I2(%)：異質性；DOR：診斷OR值；AUC：SROC曲線下面積

Mtb作為一種病原微生物，其表型各異，且易受所處環境的影響。盡管有許多關于Mtb耐藥性的研究，但是仍然沒有發現可以直接區分是否耐藥的表型標記分子或檢測手段。正因為如此，使得應用基因芯片方法檢測Mtb耐藥相關基因得到了更多的關注。不同抗生素作用壓力會導致不同位點的基因突變，不同地區抗生素應用情況不一致使得各地區所獲得的耐RFP菌株的數量上會有差別；而在同是RFP耐藥的菌株其突變的堿基也存在不同，rpoB531和rpoB526是RFP耐藥基因(rpoB)的易突變點[33-34]，其他的突變點還有512、513、514、515、517、518、522、524[35]。不同的研究應用的基因芯片結構的差異，可能會使部分突變位點檢不出，引起各個研究間的敏感度差異，導致異質性增大。

目前仍有5%～35%的耐藥分離株未能檢測出耐藥基因突變，說明可能存在其他的耐藥機制。因此，臨床標本耐藥基因突變檢測陰性并不完全意味著對藥物敏感，而敏感株的耐藥基因可能存在不改變酶活性的同義突變與耐藥無關的錯義突變而被判定為耐藥，則可引起假陽性；或因為在一群體中耐藥個體數目尚未達到一定的比例，但因為檢測過程中敏感度高的PCR擴增而出現假陽性[36-37]。另外，傳統藥敏試驗檢測以臨界水平判斷耐藥，而基因芯片法可能檢測到比傳統藥敏試驗臨界濃度更低的低度耐藥突變菌株，這可能對最終結果產生影響。

基因芯片來源不同、芯片上點樣孔數目、預測位點的不同，會使各研究間出現偏差，出現不同程度的假陽性和假陰性；另外，實驗操作人員的熟練程度，操作過程中接種菌量、藥物濃度、耐藥或敏感結果標準的判定差異也是出現異質性的原因之一。

在診斷性實驗研究中應用盲法可以得到更為真實的結果，使得結果更有說服力，盡可能地減少假陽性和假陰性。

二、基因芯片技術在耐藥性結核分枝桿菌診斷的臨床應用

本研究共納入4159株Mtb菌株，其中耐RFP菌株1161株，敏感Mtb菌株2998株。結果顯示：采用基因芯片方法診斷Mtb對RFP耐藥的SEN合并為0.89，SPE合并為0.98，說明漏診率為11%，誤診率為2%。+LR合并為30.89>1，說明基因芯片診斷Mtb對RFP耐藥為陽性時，感染對RFP耐藥Mtb的可能性較大；-LR合并為0.10<1，說明基因芯片方法檢測為陰性時，不能完全排除患者感染對RFP耐藥的Mtb的可能性。SROC曲線下面積為0.9878，表明其診斷效能較高。OR值為354.06，提示基因芯片方法對Mtb是否耐RFP具有很高的準確性。本研究結果還顯示，在診斷的人群中基因芯片方法檢測的SEN和SPE變化范圍不大，分別為0.87～0.91、0.97～0.98，提示該診斷方法診斷的穩定性好；又因基因芯片方法檢測方便快速，檢測效率高，所以基因芯片方法是鑒別診斷Mtb是否耐RFP的比較好的手段。

Steingart等[38]以傳統藥敏試驗為金標準，對應用Xpert?Mtb/RIF試劑盒檢測Mtb耐RFP的耐藥基因進行了系統評價，納入研究555株耐RFP菌株和2411株敏感菌株，其敏感度為0.95[95%CI(0.90～0.97)]，特異度為0.98[95%CI(0.97～0.99)]。Boehme等[39]用Xpert Mtb/RIF試劑盒對來自秘魯、阿塞拜疆、南非、和印度等4個結核病高負擔國家的Mtb標本進行檢測，以傳統藥敏試驗作為金標準，對耐RFP菌株的檢出率達97.6%(200/205)，對RFP敏感菌株的檢出率達98.1%(504/514)。上述研究結果與本研究結果相似。另有報道提示，基因芯片方法與傳統藥敏試驗檢測Mtb對RFP耐藥的一致性高，但因Mtb生長緩慢，傳統藥敏試驗檢測周期需要4周以上，無法為臨床提供及時的用藥參考，其臨床應用存在一定的局限性；而快速培養儀測定系統盡管可以將檢測時間縮短到5～7 d，但需特殊儀器設備，價格昂貴；分子生物學方法如PCR-SSCP(單核苷酸鏈構象多態性)簡便、快速、價廉，但只能判斷基因有無突變，不能確定具體突變的部位及性質，某些耐藥基因呈天然多態性或某些基因突變與耐藥無關，可能導致假陽性；PCR-RFLP(基因型之間限制性片段差異)只能用于分析已知序列特定位點的基因突變，應用范圍相對局限；DNA序列測定儀器設備價格昂貴，需在專業實驗室進行，限制了其推廣應用[32]。相比較而言，基因芯片方法能夠可靠，可以快速地檢測是否為Mtb感染及其菌型，為臨床提供明確的診斷，具有較好的應用前景[13]。另外，應用基因芯片方法檢測時的通量較高，可以同時將大量探針固定于支持物上，可以一次性對樣品大量序列進行檢測和分析，從而解決了傳統核酸印跡雜交技術的復雜性、自動化低、操作序列少、檢測效率低等缺陷；而且通過設計不同的探針陣列，使用特定的分析方法使該技術具有不同的使用價值。將基因芯片技術用于檢測分子突變，不僅可以明確突變位點和突變的類型，更重要的是其快速高效是目前其他方法無法比擬的，并且它可以同時檢測多個基因乃至整個基因組的突變。總之，基因芯片方法作為新的檢測方法，檢測Mtb是否對RFP耐藥具有廣闊的應用前景，它具有簡便、快速和敏感度、特異度高等特點。因此，基因芯片方法可作為臨床傳統藥敏試驗的補充，用于耐藥Mtb的初篩試驗，為臨床制定合理的治療方案提供參考，對控制耐藥Mtb的傳播、降低耐藥率和死亡率有重要意義。

筆者對國內與國外實驗結果進行了比較，結果顯示：國內外研究在應用基因芯片測定Mtb對利福平耐藥的敏感度、特異度、DOR、AUC、Q值均較高，異質性低，結果相對一致，說明基因芯片檢測Mtb是否對利福平耐藥的準確率高、假陽性和假陰性率低。

當然，本研究也存在一定的局限性：①納入文獻為不同國家和地區的研究，可能存在一定的發表偏移；②納入論文的研究測量儀器之間有所不同，可能會因為儀器的改進更新和系統誤差而影響到測量結果；③由于Mtb對培養環境要求較高，實驗室條件和操作者水平有一定要求，不同地區研究難以達到技術的統一性。

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(本文編輯：范永德)

Diagnostic accuracy of gene chip in identifying rifampicin resistanceMycobacteriumtuberculosis: a Meta-analysis

RAN Bing, CAI Lin.

Fourth Department of Orthopedics, Zhongnan Hospital of Wuhan University, Wuhan 430071, China

Corresponding author: CAI Lin, Email: guke3559@aliyun.com

Objective To systematically review the diagnostic accuracy of gene chip in identifying rifampicin (RFP) resistance Mycobacterium tuberculosis (Mtb)，and to provide the evidence for the clinical use of gene chip in detection of RFP-resistance Mtb． Methods We electronically searched The Cochrane Library (Issue 1, 2014), PubMed, EMbase, Wanfang Data, CNKI from the date that the database was established to February 2014. In order to find any publications which are related to detection of RFP-resistance Mtb by using gene chip, the search key terms in English and Chinese were designed as follows: tuberculosis, tuberculosis and drug resistance, tuberculosis and drug resistance and gene chip, tuberculosis and drug resistance and gene chip and rifampicin. Two reviewers independently screened literatures according to the inclusion and exclusion criteria, extracted data and assessed the quality of methodology of the included studies according to the QUADAS items. The Meta-DiSc software (version 1.4) was used to conduct pooling on sensitivity (SEN), specificity (SPE), positive likelihood ratio (+LR), and negative likelihood ratio (-LR). Heterogeneity test was performed and the summary receiver operating characteristic (SROC) curve was drawn and area under curve (AUC) was calculated． Results A total of 223 publications were found. Finally, 22 articles (including one article from multicenter study) and 25 studies were included into the review，which involved 4 879 Mtb isolates (including 1314 RFP-resistant strains, 3565 susceptible strains and the standard strain H37Rv). The results of Meta-analysis showed that, compared with the traditional drug sensitivity test, SEN of gene chip in detection of RFP-resistance Mtb was 0.89 (95%CI(0.87-0.91)), SPE was 0.98 (95%CI(0.97-0.98)), +LR was 30.89 (95%CI(22.15-43.06)), -LR was 0.10 (95%CI(0.07-0.15)), diagnostic OR was 354.06 (95%CI(212.09-591.07)), AUC was 0.9833. Conclusion Gene chip has a good value in detection of RFP-resistance Mtb. If the traditional drug sensitivity test is regarded as a gold standard, gene chip has high sensitivity, high specificity and high diagnosticORvalue. It can be used as a clinical supplementary method of drug sensitivity test.

Mycobacterium tuberculosis； Rifampin； Oligonucleotide array sequence analysis； Tuberculosis, multidrug-resistant； Bacterial proteins； Meta-analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.012

430071 武漢大學中南醫院骨四科

蔡林，Email:guke3559@aliyun.com

2014-05-30)