基因芯片技術在結核分枝桿菌耐藥檢測及菌種鑒定中的應用

石國民 喻容 彭雪峰 石燕 聶英 齊志強 陳擁軍 向延根 劉忠泉

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基因芯片技術在結核分枝桿菌耐藥檢測及菌種鑒定中的應用

石國民 喻容 彭雪峰 石燕 聶英 齊志強 陳擁軍 向延根 劉忠泉

目的 應用基因芯片技術快速檢測結核分枝桿菌的耐藥基因型以及分枝桿菌菌種基因型，探討基因芯片技術檢測結核分枝桿菌耐藥性和基因型的臨床價值。方法 應用菌種分型基因芯片技術和間隔區寡核苷酸分型(spacer oligonucleotide typing, Spoligotyping)技術對長沙市中心醫院2011年1月至2012年12月的臨床標本分離菌株137株進行菌種鑒定。對鑒定為結核分枝桿菌的菌株應用絕對濃度法進行利福平和異煙肼藥物敏感性檢測。并進一步對結核分枝桿菌臨床分離株(利福平耐藥、異煙肼耐藥、敏感株)應用耐藥基因芯片技術對rpoB、katG、inhA基因的野生型位點及各突變位點進行檢測。即rpoB基因中1個或多個位點的堿基突變為利福平耐藥，katG、inhA基因任何基因中的1個或多個位點的堿基突變為異煙肼耐藥。Spoligotyping法和基因芯片法菌種鑒定比較應用Kappa檢驗，絕對濃度法和基因芯片法藥物敏感性比較采用χ2檢驗和Kappa檢驗，均以P<0.05為差異有統計學意義。結果 (1)與絕對濃度法比較，對利福平敏感和異煙肼敏感的菌株45株，耐藥基因芯片法檢測鑒定為敏感株、即野生型的rpoB基因42株，符合率為93.3%(42/45)(不符合的1株為511T-C突變，1株為531C-T突變, 1株為516A-T突變)；katG基因45株，符合率為100.0%(45/45)；inhA基因43株，符合率為95.6%(43/45)(不符合的2株為inhA-15C-T突變)。(2)與絕對濃度法比較，對利福平輕度耐藥的耐藥菌株18株，耐藥基因芯片檢測鑒定為rpoB基因突變型的16株，符合率為88.9%(16/18)，且與531、516、526、511位點突變相關。對利福平高度耐藥的耐藥菌株19株，耐藥基因芯片檢測全部鑒定為rpoB基因突變型，符合率為100.0%(19/19)，且與531、516、526、511位點突變相關。(3)與絕對濃度法比較，對異煙肼輕度耐藥的耐藥菌株13株，耐藥基因芯片檢測鑒定為katG基因突變型的12株，符合率為92.3%(12/13)，與315G-C和315G-A位點突變相關。inhA基因突變型0株。對異煙肼高度耐藥的耐藥菌株9株，耐藥基因芯片檢測鑒定為katG基因全部為突變型，符合率為100.0%(9/9)，與315G-C和315G-A位點突變相關。inhA基因突變型0株。(4)與Spoligotyping法比較，137株臨床分離株中104株分離株基因芯片法檢測鑒定為結核分枝桿菌復合群，33株基因芯片法檢測出7株鳥分枝桿菌、15株胞內分枝桿菌、1株偶然分枝桿菌、10株龜或膿腫分枝桿菌，與Spoligotyping法比較，結核分枝桿菌復合群一致性為100.0%(104/104)，鳥分枝桿菌一致性為77.8%(7/9)，胞內分枝桿菌一致性為93.8%(15/16)，偶然分枝桿菌一致性為0.0%(0/0)，龜或膿腫分枝桿菌一致性為100.0%(8/8)。經Kappa檢驗，Kappa=0.95,U=30.6,P<0.05。結論 耐藥基因芯片檢測法與絕對濃度法有高度的一致性，且利福平耐藥與rpoB基因的531、516、526、511位點突變相關。異煙肼耐藥與katG基因的315位點突變相關，沒有發現inhA相關的耐藥位點突變。基因芯片方法可快速、準確地檢測臨床分離株的菌種基因型和耐藥性。

結核分枝桿菌； 抗藥性, 細菌； 微生物敏感性試驗； 寡核苷酸序列分析

近年來由于耐藥結核病、特別是耐多藥結核病的流行，使得為數不多的一線抗結核藥物很難有效，甚至二線和三線藥物也用到了治療結核病上。有文獻表明耐多藥結核病患者應用抗結核藥物治療的失敗率在15%～77%[1]。目前結核分枝桿菌耐藥檢測方法有表型檢測和基因型檢測兩大類，而表型檢測相對時間較長。Lee等[2]的研究表明結核分枝桿菌耐利福平的特性95%與rpoB基因的-85 bp范圍基因位點突變相關，耐異煙肼結核分枝桿菌大多與katG、inhA、aphC、kasA基因中1個或多個基因位點的突變相關。基因型檢測方法目前有DNA測序、單鏈構像多態性(SSCP)、雙脫氧指紋法、異源雙鏈核酸分子分析、錯位配子分析、線型擴增、分子標記序列分析、耐藥芯片檢測等。基因芯片技術是近年發展起來的一種新的分析方法，它有快速、簡便、高通量等特點，一次能檢測十幾至幾十個基因位點，適用于多位點分析。因此筆者應用基因芯片技術對本院近期結核分枝桿菌臨床分離菌株進行了耐藥基因檢測。旨在發現本地區耐利福平rpoB基因，耐異煙肼katG、inhA基因的突變特征。

材料和方法

一、材料

1.菌株來源：收集長沙市中心醫院2011年1月至2012年12月所有培養陽性且抗酸染色陽性的臨床分離株。培養方法通過Bactec MGIT 960分枝桿菌培養檢測系統獲得臨床分離株。共獲得結核分枝桿菌復合群臨床分離株104株，非結核分枝桿菌臨床分離株33株。來源患者均為本院住院患者，104株肺結核患者均符合《臨床診療指南 結核病分冊》[3]肺結核的診斷標準；臨床上已排除其他病因；經病理或細菌培養證實明確診斷為肺結核患者，在隨后觀察中對抗結核治療有效。33株非肺結核患者均符合《臨床診療指南 結核病分冊》肺結核的診斷標準；臨床上已排除其他病因；經病理或細菌培養證實診斷為肺結核患者，但在隨后觀察中對抗結核治療無效。其中男86例，女51例；年齡20～65歲，平均(46±12.5)歲；137株臨床分離株均為經痰培養陽性，并抗酸染色陽性，137株臨床分離株經Spoligotyping 菌型鑒定，并進行基因芯片法菌種鑒定。鑒定為結核分枝桿菌復合群的臨床分離株104株再進行絕對濃度法藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)、耐藥基因芯片檢測。

2.抗結核藥物、試劑以及儀器來源：分枝桿菌分離培養采用美國BD公司Bactec MGIT 960分枝桿菌培養檢測系統進行培養；絕對濃度法藥敏試驗采用自制改良羅氏培養基；利福平、異煙肼標準粉劑，均購自美國Sigma公司)；分枝桿菌菌種鑒定試劑盒Mini-blotter-MN45(Spoligotyping法)為荷蘭Isogen Life Science 公司產品；耐藥基因芯片檢測儀器(核酸快速提取儀、芯片雜交儀、芯片洗干儀、激光掃描儀)與檢測試劑盒[晶芯?分枝桿菌菌種鑒定試劑盒(基因芯片法)、晶芯?結核分枝桿菌耐藥檢測試劑盒(基因芯片法)]均為北京博奧生物有限公司產品，基因擴增采用美國ABI 7300基因擴增儀。

二、方法

(一)菌種鑒定

1.Spoligotyping分型檢測：對137株臨床分離株采用Spoligotyping法菌種鑒定試劑盒進行檢測，嚴格按照說明書進行操作。以結核分枝桿菌基因組內DR區和16S rDNA為靶序列, 設計特異性引物, 5′末端采用地高辛(digoxigenin， DIG)標記。PCR 反應條件: 96 ℃ 預變性3 min，96 ℃變性1 min, 55 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 30 s，20個循環， 72 ℃ 延伸5 min，擴增整個DR區和16S rDNA。將PCR產物與結合有間隔區寡核苷酸探針及非結核分枝桿菌特異性探針的Biodyne 尼龍轉印C膜進行雜交。地高辛化學發光檢測系統進行檢測。通過間隔區寡核苷酸探針斑點的顯色和非結核分枝桿菌特異性探針斑點顯色來判斷分枝桿菌菌型。Mycobacterium tuberculosis strain H37Rv和Mycobacterium bovis BCG P3標準株作為陽性控制，蒸餾水(double distilled water，DDW)為陰性控制。

2.基因芯片分型檢測：采用北京博奧生物有限公司菌種檢測試劑盒進行檢測(DNA微陣列芯片法)進行檢測，操作嚴格按照說明書進行。取培養狀況良好的臨床分離株配制菌液(濃度為：1×106CFU/ml)后，加入核酸提取液采用核酸快速提取儀提取結核分枝桿菌DNA，取試劑盒中PCR反應體系18 μl加入2 μl樣本DNA，PCR擴增結核分枝桿菌基因組DNA上的重復元件DR之間的序列，引物為DRa：5′-GGTTTTGGGTCTGACGAC-3′； DRb：5′-CC-GAGAGGGGACGGAAAC-3′，按照擴增程序進行PCR擴增；PCR 反應條件: 96 ℃ 預變性5 min，96 ℃變性1 min, 55 ℃退火 1 min, 72 ℃延伸 30 s，30個循環， 72 ℃ 延伸5 min，將擴增產物變性(96 ℃ 變性5 min)后，取10 μl與雜交緩沖液配制雜交混合物后加入芯片點陣中進行雜交(表1)；雜交后的芯片用芯片洗干儀洗滌、甩干后，運用激光掃描儀，運行分枝桿菌菌種鑒定基因芯片判別系統，進行芯片掃描和根據配套軟件分析雜交結果。北京博奧生物有限公司菌種檢測試劑盒內包含表面化學質控探針(QC)、雜交陽性外對照探針(EC)、空白對照(BC)、陰性對照探針(NC)、內對照探針(IC)作為芯片質量控制。

我國城市化建設速度，呈現出日益上升的趨勢，在經濟不斷發展，人們生活水平不斷提高的新時期，我國電力企業為了適應時代發展的要求，其施工技術與施工機械，也在逐步的變革中，電力自動化在電力工程中的運用，使電力工程的工作效率得到了很大的提高。但是，受到種種因素的制約，電力自動化系統，在運行時，還存在一些問題。這些問題對我國電力系統的整體質量產生了不同程度影響，因此，國家有關部門應該高度重視起來，在電力工程實現電力自動化的過程中，不斷的加大工程監管力度和施工人員的技術水平，使得我國的電力工程自動化進程可以不斷的加快。我國居民也會因此得到實惠，工業以及各項社會事業的建業也會因此得到更好的發展。

表1 分枝桿菌菌種鑒定芯片的探針排布

注 QC：表面化學質控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內對照探針。探針1、探針2：芯片中兩排不同突變位點檢測探針；1、2、3、4、5代表做5次平行試驗

(二)104株結核分枝桿菌復合群藥物敏感性試驗

1. 絕對濃度法：藥物檢測濃度、具體的檢測方法和結果判定標準均參照文獻[4]。藥敏檢測培養基藥物濃度：異煙肼(1 μg/ml，10 μg/ml)，利福平(50 μg/ml，250 μg/ml)。耐藥結果的判定：異煙肼抑菌濃度，1 μg/ml以下細菌生長為敏感株；1～10 μg/ml為輕度耐藥株；10 μg/ml以上為高度耐藥株。利福平抑菌濃度，50 μg/ml以下細菌生長為敏感株； 50～250 μg/ml為輕度耐藥株； 250 μg/ml以上為高度耐藥株。

2.基因芯片法：采用北京博奧生物有限公司的基因芯片法藥敏檢測試劑盒進行此項檢測，芯片探針分布見表2和表3，操作嚴格按照說明書進行。對104株結核分枝桿菌復合群提取DNA進行檢測，檢測基因包括：rpoB基因(引物為R1 5′-AGGACGTGGAGGCGATCA-3′； R2 5′-AACGGGTTGACCCGCGCGTA-3′)；katG基因(引物：K1 5′-GCGGCGGTCGACATT-3′；K2 5′-CTCGAGGA-AACTGTTGTCCC-3′)；inhA基因(引物為I1 5′-CGCAGCCAGGGCCTCGCTG-3′；I2 5′-CTCCGGTAACCAGGACTGA-3′)。芯片掃描后根據配套軟件分析雜交結果，以突變信號值超過野生信號值2倍以上為陽性。北京生物有限博奧公司基因芯片法藥敏檢測試劑盒內包含QC、EC、BC、NC、IC作為芯片質量控制。

表2 利福平耐藥相關rpoB基因的探針排列

注 QC：表面化學質控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內對照探針；WT：野生型。探針1、探針2：芯片中兩排不同突變位點檢測探針；1、2、3、4、5代表做5次平行試驗

(三)質量控制

絕對濃度法和Spoligotyping法均設有H37Rv作為陽性對照，作為質量控制。每份標本分二批做同一實驗，檢驗實驗方法的重復性。批內每個樣本設2個復孔。基因芯片法有QC、EC、BC、NC、IC作為質量控制。并且每塊芯片中每個探針重復做 5次平行試驗。

表3 異煙肼耐藥相關katG基因和 inhA基因的探針排列

注 QC：表面化學質控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內對照探針；WT：野生型。探針1、探針2：芯片中兩排不同突變位點檢測探針；1、2、3、4、5代表做5次平行試驗

(四)統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行統計學分析，Spoligotyping法和基因芯片法菌種鑒定比較應用Kappa檢驗，絕對濃度法和基因芯片法藥物敏感性比較采用χ2檢驗和Kappa檢驗。均以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1.基因芯片法檢測104株結核分枝桿菌復合群對利福平、異煙肼耐藥的結果。基因芯片掃描圖譜見圖1、2。

2.基因芯片檢測法與Spoligotyping法基因型分析的比較：具體見表4。137株臨床分離株中，104株分離株基因芯片法檢測鑒定為結核分枝桿菌復合群，與Spoligotyping法檢測比較(以Spoligotyping法為金標準)，符合率為100.0%(104/104)。 基因芯片法檢測鑒定7株鳥分枝桿菌，與Spoligotyping法檢測為9株比較，符合率為77.8%(7/9)。15株胞內分枝桿菌，與Spoligotyping法檢測為16株比較，符合率為93.8%(15/16)。基因芯片法檢測鑒定出1株偶然分枝桿菌，而Spoligotyping法未檢測出偶然分枝桿菌，符合率為0.0%(0/0)。基因芯片法檢測鑒定出10株龜或膿腫分枝桿菌，而Spoligoty-ping 法僅檢測出其中8株，符合率為100.0%(8/8)。經Kappa檢驗，Kappa=0.95,U=30.6,P<0.05。表明兩方法結果具有極強的一致性。

3.藥敏試驗基因芯片檢測法與絕對濃度法對利福平耐藥檢測結果：104株結核分枝桿菌復合群中絕對濃度法有45株為利福平和異煙肼敏感株；37株為利福平耐藥株；22株為異煙肼耐藥株。共82株結核分枝桿菌分離株，其中絕對濃度法和基因芯片法均為利福平耐藥分離株有35株，與之相關的rpoB基因突變位點分布(表5)表明：531位點突變42.9%(15/35)，其中531 TCG→TTG 為37.1%(13/35)；516位點突變54.3%(19/35)，其中516 GAC→GTC為31.4%(11/35)；511 CTG→CCG 14.3%(5/35)；526位點突變17.1%(6/35)，其中CAC→TAC為 8.6%(3/35)。

QC：基因芯片法有表面化學質控探針；EC：雜交陽性外對照探針；BC：空白對照；NC：陰性對照探針；IC：內對照探針。白色斑點為強信號(陽性)，綠色斑點為弱信號，無色斑點為無信號(陰性)。CAC-CTC表示堿基A突變為堿基C，其他依此類推圖1，2 圖1為katG、inhA基因芯片掃描圖譜；圖2為rpoB基因芯片掃描圖譜

表4 基因芯片法與Spoligotyping法對137株臨床分離株的菌種鑒定比較(株)

藥敏試驗基因芯片檢測法與絕對濃度法對利福平耐藥檢測結果的比較具體見表6。表明18株絕對濃度法輕度耐藥株中有16株基因芯片法rpoB基因突變，符合率即敏感度為88.9%(16/18)。19株高度耐藥菌株中全部基因芯片法rpoB基因突變,符合率即敏感度為100.0%(19/19)。45株絕對濃度法敏感株中有42株基因芯片法為野生型，特異度93.3%(42/45)，經χ2檢驗，絕對濃度法檢測結果與基因芯片法檢測耐藥株檢測結果相比差異有統計學意義(χ2值分別為41.3、51.6，P值均<0.01)。經Kappa檢驗，Kappa=0.81，U=10；Kappa=0.887，U=14.8，P<0.05。表明兩方法結果具有極強的一致性。

表5 35株利福平耐藥相關的rpoB基因突變位點分布

注 突變率=耐藥菌株某位點突變株數/耐藥菌株株數×100%

表6 基因芯片法與絕對濃度法對利福平耐藥檢測結果的比較

注 “+”：耐藥；“-”：敏感

4.藥敏試驗基因芯片檢測法與絕對濃度法對異煙肼耐藥性檢測的結果：104株結核分枝桿菌復合群中絕對濃度法有45株為利福平和異煙肼敏感株；22株為異煙肼耐藥株；37株為利福平耐藥株。共67株結核分枝桿菌分離株，其中絕度濃度法和基因芯片法均為異煙肼耐藥分離株有21株， 與異煙肼耐藥相關的katG、inhA基因突變位點分布(表7)：katG基因315位點突變率100.0%(21/21)，其中katG315 AGC→ACC突變率為85.7%(18/21)；inhA基因15位點突變率0.0%(0/21)，15 C→T。

表7 21株異煙肼耐藥株(絕度濃度法和基因芯片法)相關的katG、inhA基因突變位點分布

注 突變率=耐藥菌株某位點突變株數/耐藥菌株株數×100%

藥敏試驗基因芯片檢測法與絕對濃度法對結核分枝桿菌臨床分離株異煙肼耐藥性檢測的結果的比較具體見表8。13株絕對濃度法輕度耐藥株(1～10 μg/ml)中有12株基因芯片法katG基因突變，敏感度92.3%，0株基因芯片法inhA基因突變，敏感度0.0%。9株絕對濃度法檢測為高度耐藥株(10 μg/ml以上)中全部基因芯片法katG基因突變，敏感度100.0%；0株基因芯片法inhA基因突變，敏感度0.0%。45株絕對濃度法檢測為敏感株中，45株基因芯片法katG基因為野生型，特異度為100.0%；43株基因芯片法inhA基因為野生型，特異度95.6%。基因芯片法katG基因突變與絕對濃度法比較，經χ2檢驗，基因芯片法檢測與絕對濃度法比較差異有統計學意義(χ2值分別為46.9、36.5，P值均<0.01)。經Kappa檢驗，Kappa=0.94，U=17.1；Kappa=1,U=∞，P值均<0.05；表明兩種方法結果一致性好。經χ2檢驗，基因芯片法inhA突變與絕對濃度法檢測結果相比較差異無統計學意義(χ2值分別為0.01、0，P值均>0.05。經Kappa檢驗，Kappa=-0.08，U=-0.33;Kappa=0，U=0，P值均>0.05)。

表8 基因芯片法與絕對濃度法對異煙肼耐藥的檢測結果比較

注 “+”：耐藥；“-”：敏感

討 論

基因突變是導致結核分枝桿菌產生耐藥性的重要原因，有研究表明95%的結核分枝桿菌利福平耐藥株有RNA聚合酶β亞單位編碼基因rpoB507-533位密碼子發生堿基突變[5]，至高度保守的氨基酸置換，空間構象發生變化，最常見突變位點為531、526、516。結核分枝桿菌異煙肼耐藥株主要有KatG基因和inhA基因堿基突變[6-7]，常見的為KatG基因315位密碼子AGC-ACC的突變，從而引起細胞過氧化氫-過氧化物酶活性降低，導致異煙肼活化效率降低，甚至不能活化。分枝桿菌酸細胞壁的合成所需成份之一為NADH依賴的enoyl-ACP還原酶，即inhA基因編碼的脂肪酸轉動蛋白，活化的異煙肼能與NADH結合，抑制依賴的enoyl-ACP還原酶，從而阻止分枝桿菌酸細胞壁的合成，導致細胞的死亡。如果inhA基因堿基突變，enoyl-ACP還原酶分泌受阻，活化的異煙肼不能與NADH結合，而導致耐藥。

基因芯片技術始創于20世紀90年代，是目前結核分枝桿菌菌種分型和耐藥分子診斷的先進方法之一，很多學者應用基因芯片方法報道了不同地區結核分枝桿菌菌種類型和耐藥基因突變位點，并與測序比較有很好的一致性，大多數是對耐利福平的rpoB基因和耐異煙肼的KatG基因和inhA基因突變位點的檢測。

筆者應用基因芯片技術對收集的絕對濃度法耐利福平耐藥株37株，異煙肼耐藥株22株，全敏感株45株進行了rpoB(19個位點)、katG(4個位點)、inhA(3個位點)檢測，表明利福平輕度耐藥株敏感度為88.9%，高耐藥株敏感度為100.0%，特異度為93.3%，rpoB基因位點突變主要有42.9%的為531，17.1%為526，54.3%為516，14.3%為511位點突變。突變位頻率較高有531TCG→TTG 37.1%，516GAC→GTC 31.4%，511CTG→CCG 14.3%，與Huang等[5]對中國、日本、韓國等國家大多數結核分枝桿菌耐利福平菌株rpoB基因突變位點在Ser-531，Yao等[8]對重慶地區結核分枝桿菌臨床株rpoB、katG、inhA基因位點突變檢測表明突變頻率較高的基因位點為rpoB 531、rpoB 513，Mokrousov等[9]對北京地區結核分枝桿菌臨床株rpoB基因位點突變主要有58.9%的為531，12.4%為526，2.7%為516位點，Zhang等[10]對河南省耐多藥結核分枝桿菌菌株基因突變檢測表明53.8%為rpoB 531點突變，Deng等[11]對武漢地區60株確診為肺結核患者的臨床分離株應用基因芯片技術分析rpoB基因型，結果表明531TCG→TTG突變率為47.3%，526CAC→TAC突變率為12.7%，516GAC→GTC突變率為5.5%比較有高度的一致性，表明各地區之間結核病利福平耐藥rpoB基因突變位點和頻率區別不大。

基因芯片法檢測表明異煙肼輕度耐藥敏感度為92.3%，高耐藥敏感度為100.0%，特異度為95.6%，katG基因位點突變有95.4%的為315位點突變，突變位點頻率較高有315AGC→ACC 81.8%。本研究的結果與報道的重慶、北京、河南、武漢結核分枝桿菌異煙肼耐藥的敏感度、特異度相似[8-11]。

實驗中2株inhA基因15突變均為敏感株，而耐藥株無inhA基因15突變，因此可以說INH耐藥至少在本地區可能與inhA基因15位突變無關，也可能為絕對濃度法定義的耐藥濃度高于比率法原因所致。與Yao等[8]報道的18%的inhA-15突變不一致，這可能是我國各地區結核病流行菌型差異所至。與Aragón 等[12]報道的31.6% inhA-15、10.5% inhA-8突變相差很大，可能是與西班牙巴塞羅那地區所在的國際環境結核分枝桿菌流行趨勢大相徑庭的緣故。也有中國研究人員在對本地區耐多藥結核病耐藥基因檢測研究中沒有把inhA基因選入檢測中[13]，這大概也是inhA在中國某些地區突變率低的緣故。表明異煙肼耐藥可能與inhA突變無關，也可能為絕對濃度法定義的耐藥濃度高于比率法的原因。

本研究對高耐藥結核分枝桿菌(利福平250 μg/ml以上；異煙肼10 μg/ml以上)芯片法檢測發現全部菌株都有耐藥基因突變。因此可以認為高耐藥與結核分枝桿菌耐藥基因突變呈強相關。

王峰等[14]利用基因芯片法檢測了21株結核分枝桿菌標準株和50 株臨床分離株，結果表明：與PCR測序方法比較，兩種方法具有很好的一致性，且基因芯片鑒定分枝桿菌具有快速、特異、準確率高的特點，筆者應用北京博奧生物有限公司基因芯片與Spoligotyping方法對照檢測結果與王峰等的結果一致。可見基因芯片檢測方法與PCR測序和Spoligotyping方法均有較好的一致性，且基因芯片方法有檢測時間短(當天可以出結果)、人為影響因素少、重復性好等特點，更適合臨床應用。

張俊仙等[15]利用基因芯片法檢測了30株利福平、異煙肼敏感株和50株利福平、異煙肼耐藥株，結果表明，與基因測序比較，敏感株特異度為100%，利福平耐藥株rpoB基因突變率為86%，異煙肼耐藥株katG基因突變率為62%、inhA基因突變率僅為10%。本研究利用基因芯片法與傳統絕對濃度法檢測利福平和異煙肼耐藥性，比較結果與張俊仙等的結果一致，且本研究檢測inhA基因突變率為0%，與張俊仙等的僅10%突變率結果相近，表明異煙肼耐藥與inhA基因突變相關性不大。且基因芯片法結果的快速、準確更是值得在臨床檢測中應用。施美華等[16]應用北京博奧生物有限公司基因芯片檢測了21株臨床標本對INH的藥敏試驗表明基因芯片法檢測菌株INH耐藥與傳統藥敏檢測方法比較，準確率為73.8%,與DNA測序比較，芯片法檢測katG基因突變準確率為88.9%。筆者基因芯片法檢測為絕對濃度法輕度耐藥株(1～10 μg/ml)中katG基因突變的敏感度92.3%(12/13)，絕對濃度法高耐藥株(10 μg/ml以上)中全部芯片法katG基因突變，敏感度100.0%(9/9)。高于施美華等的檢測結果。表明絕對濃度法結果比羅氏耐藥培養結果更準確，因此新方法的驗正應以絕對濃度法為金標準。

總之，基因芯片法有較高的敏感度和特異度，且檢測時間短，檢測費用一樣。基因芯片法是值得推廣應用的一種耐藥檢測方法。但基因芯片法需要昂貴的芯片、芯片雜交儀、芯片洗干儀、激光掃描儀等耗材和設備，不易在基層推廣，需要進一步改進。

[1] Heymann SJ, Brewer TF, Wilson ME,et al. The need for global action against multidrug-resistant tuberculosis. JAMA,1999,281(22):2138-2140.

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(本文編輯：王然 張曉進)

Identification ofMycobacteriumtuberculosisand its drug resistance with gene chip

SHI Guo-min, YU Rong, PENG Xue-feng, SHI Yan, NIE Ying, QI Zhi-qiang, CHEN Yong-jun, XIANG Yan-gen,LIU Zhong-quan.

Clinical Laboratory, Changsha Central Hospital, Changsha 410004, China

Corresponding author: LIU Zhong-quan, Email: Liuzq6608@tom.com

Objective Study on gene chip technique in detection of drug resistance of Mycobacterium tuberculosis and its clinical value. Methods (1) One hundred and thirty-seven strain identification of Mycobacterium clinical isolates from Changsha Central Hospital by gene chip and Spoligotyping technology from 2011-01 to 2012-12. (2)Drug-susceptibility test of rifampin and isoniazid to Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by absolute concentration method. (3) Drug-susceptibility test of rifampin and isoniazid to Mycobacterium tuberculosis clinical isolates by DNA chips for rpoB, KatG, inhA. Rifampin resistant is one or a plurality of site mutation of rpoB gene, isoniazid resistance is one or a plurality of site mutation of katG gene and inhA gene. Compared Spoligotyping with gene chip method of species identification byKappatest, Compared the absolute concentration method with gene chip method of drug sensitivity byχ2test andKappatest. Results (1)For 45 rifampin sensitive (under 50 μg/ml) and isoniazid sensitive(under 1 μg/ml) isolates tested by absolute concentration method, 42 are wild type for rpoB gene with the sensitivity of 93.3%(1 for 511T-C mutations, 1 for 531C-T mutations, 1 for 516A-T mutations), 45 are wild type for KatG gene with the sensitivity of 100.0% and 43 are wild type for inhA gene with the sensitivity of 95.6%(2 for15C-T mutation) by DNA chip method, respectively. (2)For 18 rifampin-resistant (50-250 μg/ml) isolates tested by absolute concentration method, 16 has mutation in rpoB gene with the sensitivity of 88.9% by DNA chip method. Those mutations happened at 531,516,526,511 amino acid sites of rpoB. For 19 rifampin-resistant (above 250 μg/ml) isolates tested by absolute concentration method, 19 has mutation in rpoB gene with the sensitivity of 100% by DNA chip method. Those mutations happened at 531,516,526,511 amino acid sites of rpoB. (3)Compare the DNA chips with the absolute concentration method, for 13 isoniazid- resistance(1-10 μg/ml) isolates, 12 has mutation in KatG gene with the sensitivity of 92.3% by DNA chip method, which mainly happened at 315 site. No mutation related to the drug resistance was found in inhA gene. Compare the DNA chips with the absolute Concentration method, For 9 isoniazid- resistance(above 10 μg/ml) isolates, 9 has mutation in KatG gene with the sensitivity of 100% by DNA chip method, which mainly happened at 315 site. No mutation related to the drug resistance was found in inhA gene. (4)For 137 clinical isolates tested by Spoligotyping, 104 are Mycobacterium tuberculosis with the sensitivity of 100.0%(104/104), 7 are Mycobacterium avium complex with the sensitivity of 77.8%(7/9), 15 are Mycobacterium intracellulare with the sensitivity of 93.8%(15/16), 1 are Mycobacterium fortuitum with the sensitivity of 0.0%(0/0), 10 are Mycobacterium chelonei with the sensibility of 100.0%(8/8) by DNA chip method, respectively.Kappa=0.95,U=30.6,P<0.05. Conclusion The drug-sensitive test by DNA chips method matched the absolute concentration method very well. RFP-resistance was related to the mutations at the sites of 531,516,526,511 for rpoB gene, and INH-resistance was related to the mutations at the site of 315 for KatG gene. No mutation was found in inhA gene in INH-resistant isolates. DNA chip method might be a rapid and effective method for the detection of Mtb drug-resistant isolates and mycobacterium species.

Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance, bacterial； Microbial sensitivity tests； Oligonucleotide array sequence analysis

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.01.013

“十二五”國家科技重大專項(2012ZX10005011-003-001)；首都衛生發展科研專項(2011-1010-01)

410004 長沙市中心醫院檢驗科(石國民、喻容、彭雪峰、石燕、聶英、齊志強、陳擁軍、向延根)；北京市結核病胸部腫瘤研究所 耐藥結核病北京市重點實驗室 (劉忠泉)

劉忠泉，Email：Liuzq6608@tom.com

2014-05-04)