馬西利亞分枝桿菌臨床分離株的多位點序列鑒定和藥物敏感性試驗分析

魏劍浩 郭倩 李桂蓮 劉海燦 李馬超 吳移謀 樓永良 呂建新 萬康林

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·論著·

馬西利亞分枝桿菌臨床分離株的多位點序列鑒定和藥物敏感性試驗分析

魏劍浩 郭倩 李桂蓮 劉海燦 李馬超 吳移謀 樓永良 呂建新 萬康林

目的 對單基因比對不能區分的馬西利亞分枝桿菌(M.massiliense)臨床分離株進行菌種鑒定，補充其藥物敏感譜，為臨床診治提供依據。 方法 2013年中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病室共收集了47例疑似非結核分枝桿菌(NTM)感染的臨床樣本，用對硝基苯甲酸、噻吩-2-羧酸肼培養基和多位點PCR方法區分鑒別得到的分枝桿菌，采用基因序列比對進行NTM菌種鑒定，其中未能準確鑒定菌種的6株臨床分離株進一步通過多位點序列分析(MLSA)方法進行定種鑒定。采用微孔板阿爾瑪藍測定法(MABA)對馬西利亞分枝桿菌菌株開展36種藥物的藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗“)。 結果 47例臨床樣本中鑒定出34株NTM，其中6株臨床分離株綜合5個管家基因(16S rRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA)的單基因比對結果仍不能鑒定菌種，因此本研究采用MLSA方法構建鄰位相加法進化樹確認6株均為馬西利亞分枝桿菌。藥敏試驗結果顯示M.massiliense對阿米卡星為敏感(16 μg/ml)或中度敏感(32 μg/ml)，對利福平、異煙肼、乙胺丁醇、環丙沙星、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對氨基水楊酸、氧氟沙星、卡那霉素、環絲氨酸、美羅培南、米諾環素12種藥物耐藥。 結論 MLSA方法能有效鑒定馬西利亞分枝桿菌；馬西利亞分枝桿菌耐藥程度較高。

分枝桿菌屬; 多位點測序分型； 微生物敏感性試驗

馬西利亞分枝桿菌(Mycobacteriummassiliense，M.massiliense)屬于膿腫分枝桿菌復合群(Mycobacteriumabscessuscomplex)，首次報道于2004年，由Adékambi等[1]從一位50周歲的女性患者的血痰中分離到該菌并對其命名。目前有報道的馬西利亞分枝桿菌感染患者并不多見，相關的試驗研究也不甚清楚，因此少數臨床分離株仍有比較分析的必要。多位點序列分析(multilocus sequence analysis，MLSA)是近年來興起的一種新的分類學方法，國內外已有報道應用于各類細菌的菌種鑒定[2-6]，但國內用于非結核分枝桿菌(non-tuberculous Mycobacteria，NTM)的研究卻少有報道。MLSA通過多基因位點的組合，能夠更加直觀、準確地將種類繁多的NTM進行菌種鑒定。本研究以2013年間中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病室鑒定分離的NTM臨床分離株中疑似馬西利亞分枝桿菌的樣本為研究對象，擴增測序16S rRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA5個管家基因位點[5, 7]，采用MLSA的方法最終確定6株馬西利亞分枝桿菌，并進一步結合馬西利亞分枝桿菌標準株DSM 45103進行微孔板阿爾瑪藍測定法(microplate Alamarblue assay，MABA)對36種抗結核藥物進行體外藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)，補充了馬西利亞分枝桿菌對這些藥物的敏感性數據。

材料和方法

一、菌株來源

2013年間中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所結核病室共接收到47例高度疑似NTM感染(分離培養后得到NTM、線型探針等技術檢測疑似為NTM及診斷為“結核病”后治療無效或效果不佳等情況)患者的臨床樣本，經初步培養鑒定后，分離到8株結核分枝桿菌，1株牛分枝桿菌(Mycobacteriumbovis)，34株NTM。NTM臨床分離株中最終確定了6株馬西利亞分枝桿菌。其中湖南省結核病防治所2例，長春市傳染病醫院、福建省胸科醫院、北京市胸科醫院、北京協和醫院各1例。馬西利亞分枝桿菌標準株DSM 45103購自德國微生物菌種保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganis-men und Zellkulturen，DSMZ)。所有菌株均由本實驗室培養保存并提供。

二、方法

(一)NTM篩選

本室接收的樣本經過前處理后接種于改良羅氏培養基(L-J培養基)上，37 ℃培養4周后累計分離到43株臨床分離株。挑選生長狀態良好的菌落，經磨菌比濁制備成10-2mg/ml菌懸液，分別接種0.1 ml于對硝基苯甲酸(p-nitrobenzoic acid，PNB)和噻吩-2-羧酸肼(2-thiophene carboxylic acid hydrazide，TCH)培養基上并記錄生長情況，同時能在PNB和TCH培養基上生長的菌株劃歸為NTM[8]。同時結合多位點PCR方法進行菌種鑒定[9]，綜合2種方法的結果分離到34株NTM。

(二)初步鑒定菌種

采用水煮法提取NTM菌株DNA，并于-20 ℃保存備用[10]。擴增測序hsp65和rpoB2個管家基因位點的序列信息，擴增引物見表2。PCR擴增體系為50 μl：10 μmol/L引物各2 μl，2×Taq Master Mix 25 μl，DNA模板5 μl，雙蒸水(ddH2O)16 μl；陰性對照體系中不加DNA模板，ddH2O 21 μl，其他不變。擴增產物由北京天一輝遠生物科技有限公司測序，并將基因序列提交美國國立生物技術信息中心(NCBI)數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比對。

表1 馬西利亞分枝桿菌感染患者情況

(三)多位點序列分析定種鑒定

選取疑似馬西利亞分枝桿菌的臨床分離株以16S rRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA5個管家基因位點為目的片段進行擴增，擴增引物見表2。擴增體系同前文述。將各位點的序列拼接后用分子進化遺傳分析(MEGA)5.10軟件建立系統進化樹，并選取膿腫分枝桿菌標準株CIP 104536、馬西利亞分枝桿菌標準株CCUG 48898(與DSM 45103為同一菌株，此處為瑞典G?teborg大學菌物保藏中心編號，見文獻[1])及2株龜分枝桿菌(Mycobacteriumchelonae，M.chelonae)標準株ATCC 19237和CIP 104535作為參照，采用多位點序列分析方法確定菌種。膿腫分枝桿菌、馬西利亞分枝桿菌、龜分枝桿菌4株標準株的序列信息獲取自NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)。

表2 各基因的引物序列[5, 7]

注 “F”表示上游引物，“R”表示下游引物

(四) 藥敏試驗

制備稀釋菌液：刮取羅氏培養基上生長良好(約3周)的菌落，用生理鹽水混懸成1個麥氏濃度(約為1 mg/ml)，然后再以1∶20的比例用液體培養基稀釋菌液，制成終濃度約為107CFU/ml的接種菌懸液。構建藥物濃度梯度：在96孔板中除邊緣各孔外，每孔加入100 μl液體培養基，并在板中對測試藥物進行倍比稀釋，制成表4所示相應藥物的測試范圍。最后每孔加入100 μl接種菌懸液。同時設置不含藥物的生長對照孔及空白對照孔。實驗結果判讀：37 ℃培養3 d后每孔加入70 μl顯色劑(20 μl阿爾瑪藍和50 μl 5%吐溫-80)后再孵育1 d判讀結果，其中阿米卡星、頭孢西丁和阿奇霉素藥敏試驗于37 ℃孵育2 d后判讀結果；而克拉霉素孵育時間應延至14 d后判讀結果。96微孔板中顏色由藍變紅提示有菌株生長，沒有變色的實驗孔中讀取到的最小藥物濃度和已發生變色的實驗孔中讀取到的最大藥物濃度即為該實驗菌株對此藥物的最小抑菌濃度(minimum inhibitory concentrations，MIC)[11-13]。數值大小反映藥物對菌株的抑菌活性，數值越小，對應藥物的抑菌活性越高。

本研究共選取了文獻中有較多報道用于分枝桿菌病治療的36種藥物開展試驗，并將接種菌懸液濃度稀釋為107CFU/ml。試驗中所用藥物均購自美國Sigma-Aldrich集團公司。

結 果

一、分枝桿菌分離鑒定

47例疑似NTM感染患者的臨床樣本經過前處理后接種培養，累計成功分離到43株臨床分離株。經PNB/TCH鑒別培養基和多位點PCR方法鑒定后，34株為NTM，8株為結核分枝桿菌，1株為牛分枝桿菌。測序34株NTMhsp65、rpoB2個管家基因位點的序列，并與NCBI數據庫(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行同源性比對分析，發現6株臨床分離株疑似為馬西利亞分枝桿菌。

表3中，hsp65基因不能有效區分鑒定馬西利亞分枝桿菌與膿腫分枝桿菌，rpoB基因僅能有效地將馬西利亞分枝桿菌和膿腫分枝桿菌與龜分枝桿菌區分鑒定。在進一步補充測序16S rRNA、sodA和recA3個管家基因位點的序列并分析后，綜合5個管家基因的比對結果仍不足以確認6株臨床分離株均為馬西利亞分枝桿菌。

因此，本研究采用MLSA方法進一步對疑似為馬西利亞分枝桿菌的臨床分離株進行菌種確定。綜合16S rRNA、hsp65、rpoB、sodA和recA5個管家基因位點的序列分析，采用鄰位相加法(Neighbor-joining method)建立進化樹，迭代次數(bootstrap values)設定為1000，結果顯示6株臨床分離株與馬西利亞分枝桿菌標準株CCUG 48898具有高度的同源性，聚類于同一簇，見圖1。因此確定6株臨床分離株均為馬西利亞分枝桿菌。

表3 hsp65與rpoB基因比對結果

注 MM：M.massiliense；MA：M.abscessus；MC：M.chelonae

圖1 MLSA方法菌種鑒定鄰位相加法進化樹

分析6例馬西利亞分枝桿菌感染患者情況后發現，咳嗽、咯痰、咯血、咽痛、頭痛、發熱是最常見的疾病癥狀，其中咳嗽和咯痰是這些馬西利亞分枝桿菌感染患者共有的臨床表現。

二、藥敏試驗

參照快速生長分枝桿菌(rapidly growingMycobacterium，RGM)體外藥物敏感試驗參考界值[17-20]，馬西利亞分枝桿菌對氧氟沙星、卡那霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇、環丙沙星、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對氨基水楊酸、環絲氨酸、美羅培南、米諾環素12種藥物均耐藥，對阿米卡星為敏感或中度敏感，對克拉霉素、利奈唑胺、頭孢西丁的敏感率較高(>50%)。其中6株馬西利亞分枝桿菌臨床分離株(M1～M6)對力克菲蒺、頭孢哌酮、氨硫脲、氨苯砜4種藥物高度不敏感；對氧氟沙星、卡那霉素、莫西沙星、異煙肼、利福平、乙胺丁醇、環丙沙星、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對氨基水楊酸、多西環素、復方新諾明、環絲氨酸、美羅培南、米諾環素15種藥物均耐藥，羅紅霉素、司帕沙星、四環素、加替沙星、頭孢美唑、阿奇霉素、紅霉素、利福噴丁8種藥物對臨床分離株有不同的抑制作用。與標準株的結果相比，臨床分離株對莫西沙星、利奈唑胺、利福平、多西環素、復方新諾明、氨苯砜6種藥物的敏感度均較馬西利亞分枝桿菌標準株差，對異煙肼、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對氨基水楊酸、力克菲蒺、環絲氨酸、頭孢哌酮、米諾環素8種藥物的敏感度與馬西利亞分枝桿菌標準株一致且均為耐藥或高度不敏感，M3、M4、M5菌株對頭孢吡肟的敏感度優于標準株，M1、M6菌株對紅霉素的敏感度優于標準株(表4)。

討 論

一、菌種鑒定與菌株分析

長期以來，因為分枝桿菌特殊的生長特性，一直使其快速分離鑒定較為困難。隨著分子生物學研究和基因測序技術的發展，基于基因序列檢測的菌種鑒定技術已開始應用于分枝桿菌的菌種鑒定。近年來有研究表明，單個基因測序比對或基因的組合比對，已不能滿足現有的菌種鑒定需求[18-19]。單個基因序列所攜帶的遺傳信息有限，用于菌種鑒定時分辨能力也受到限制，對于該基因同源性較高的菌種甚至不能有效區分[如西瓦堤分枝桿菌(M.silvaticum)與副結核分枝桿菌(M.paratuberculosis)][20]；而基因的組合比對則可能面臨比對結果不一致的局面，特別是近些年來的研究證實在NTM菌種間存在著橫向基因轉移(lateral gene transfer，LGT)事件[如永宮分枝桿菌(M.yongonense)與副瘰疬分枝桿菌(M.parascrofulaceum)][21]。隨著hsp65、rpoB等基因在菌種鑒定中的廣泛應用，sodA、recA等管家基因也被證明能通過片段比對區分和鑒定菌種，并有文獻報道了一種多位點序列分析(MLSA)方法鑒定分枝桿菌的新思路[2-6]。與基因位點的單獨比對相比，MLSA的結果更加真實高效的反應了細菌基因組的特征，能有效避免基因單獨比對時掩蓋其他基因特征的情況，又同時避免全基因組測序的高昂成本和時間損失，因此對于種類繁多且同源性較高的NTM有較高的鑒別區分能力。針對本研究所遇到的菌種不易區分鑒定的問題，我們選取了MLSA方法鑒定菌種。由表3可見，不論是初次鑒定選取的hsp65和rpoB基因還是后來補充的其他3種基因均不能區分馬西利亞分枝桿菌與膿腫分枝桿菌，嘗試對5個管家基因序列進行組合也僅能將馬西利亞分枝桿菌和膿腫分枝桿菌與龜分枝桿菌進行有效的鑒定區分，并不能準確將6株臨床分離株鑒定到種，而MLSA方法則直觀準確的解決了這一問題。由圖1可以看出，各臨床分離株之間雖互有差異，但仍有較高的同源性；而臨床分離株所在的分支與馬西利亞分枝桿菌標準株聚類于同一簇且同源性可信度高(自展值99)，由此確認6株臨床分離株均為馬西利亞分枝桿菌。

表4 馬西利亞分枝桿菌臨床分離株及標準株DSM 45103藥敏試驗結果

注 以上表中數據(除明確標注外)單位均為：μg/ml；MIC：最小抑菌濃度；RGM：快速生長分枝桿菌；“-”表示未找到該數據；M1、M2、M3、M4、M5、M6分別表示6株臨床分離株；DSM 45103為馬西利亞分枝桿菌標準株；復方新諾明的參考界值表示抑制80%細菌生長的藥物濃度；藥敏試驗參考界值詳見參考文獻[14-17]

在目前的文獻報道中，對RGM的研究日益增多，但馬西利亞分枝桿菌的相關資料卻并不充分，這可能與馬西利亞分枝桿菌的低感染率和菌種鑒定方法滯后有關[22]。僅就本次研究而言，馬西利亞分枝桿菌感染與年齡和性別無明顯關系，而咳嗽和咯痰則是這些患者共有的臨床表現。

二、藥敏試驗結果分析

由于NTM對常見的抗結核藥物的普遍耐藥和馬西利亞分枝桿菌感染患者的報道相對匱乏，臨床對馬西利亞分枝桿菌感染患者的治療仍未形成統一標準，實際工作中常對患者采取經驗性用藥控制癥狀[22-23]。為了篩選出對馬西利亞分枝桿菌感染患者有效的治療藥物，本次試驗除按照美國臨床和實驗室標準化協會(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)(M24-A2，2011)[14]方案中推薦的藥物開展試驗外，我們另選取了文獻中有較多報道用于NTM病治療的26種藥物同時開展試驗。在制定試驗方法時，為更好的對藥敏實驗結果進行判讀，我們結合參考文獻[11-17]最終選定終濃度約為107CFU/ml的菌懸液開展試驗，并在判讀結果時使用阿爾瑪藍作為顯色劑。在本次試驗中，馬西利亞分枝桿菌臨床分離株對力克菲蒺、頭孢哌酮、氨硫脲、氨苯砜4種藥物在最高測試濃度時仍顯示耐藥，因此判定其為高度不敏感。羅紅霉素、司帕沙星、四環素、加替沙星、頭孢美唑、阿奇霉素、紅霉素、利福噴丁 8種藥物雖未查閱到可參考的藥敏界值，但均在試驗濃度范圍內對部分臨床分離株有抑制作用，特別是阿奇霉素在較低濃度范圍時即有抑制作用，可成為今后進一步驗證的目的藥物。馬西利亞分枝桿菌臨床分離株與標準株的藥物敏感度有所不同，且各臨床分離株之間對藥物的敏感度也各有差異，這可能與患者在疾病過程中的治療經歷有關[22]。結合馬西利亞分枝桿菌標準株的藥敏試驗結果，馬西利亞分枝桿菌對氧氟沙星、卡那霉素、利福平、異煙肼、乙胺丁醇、環丙沙星、乙硫異煙胺、卷曲霉素、對氨基水楊酸、環絲氨酸、美羅培南、米諾環素12種藥物均耐藥，對力克菲蒺、頭孢哌酮和氨硫脲在最高試驗濃度仍高度不敏感，以上藥物均應在臨床治療時謹慎使用。

韓國學者Lyu等[24]在對比分析了26株膿腫分枝桿菌肺病患者與22例馬西利亞分枝桿菌肺病患者的治療效果后認為：馬西利亞分枝桿菌肺病患者的療程相對較短且愈后較好；并結合體外藥敏試驗的結果認為一種大環內酯類藥物(如克拉霉素)與阿米卡星、頭孢西丁等藥物的聯合應用對馬西利亞分枝桿菌肺病有較好的療效(21/22，治愈率95.5%)。我國學者聶文娟等[12]對21株馬西利亞分枝桿菌的藥敏試驗表明：阿米卡星、阿奇霉素、亞胺培南和頭孢西丁的體外抑菌活性較好。韓國學者Choi等[25]的研究則表明大環內酯類藥物(克拉霉素和阿奇霉素)在治療馬西利亞分枝桿菌感染方面效果較好。盡管現階段難以確定體外藥敏試驗結果與臨床治療效果的相關性，但在制定NTM病的治療方案時，仍應盡可能結合藥敏試驗結果和用藥史[8]。綜合本次藥敏試驗結果，在對確診為馬西利亞分枝桿菌感染的患者進行治療時，可考慮一種大環內酯類藥物(如克拉霉素或阿奇霉素)與阿米卡星、頭孢西丁等藥物的聯合應用。

2010年我國第五次結核病流行病學抽樣調查結果顯示：NTM在分枝桿菌分離株中占比高達22.9%[26]。在實際工作中，如何快速準確的將日益增多的NTM分離株鑒定菌種仍是一個亟需解決的問題。本研究受限于樣本菌株數量較少，未能對馬西利亞分枝桿菌的流行特征和致病機制做更多分析，但MLSA方法最終成功的將基因序列相似較高的馬西利亞分枝桿菌與膿腫分枝桿菌區分鑒定，為日后開展NTM菌種鑒定特別是基因相似度較高的“復雜”菌株的鑒定提供了新的參考和思路。

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(本文編輯：郭萌)

Species identification with multilocus sequence analysis and drug-sensitivity test inMycobacteriummassilienseclinical isolates

WEIJian-hao*,GUOQian,LIGui-lian,LIUHai-can,LIMa-chao,WUYi-mou,LOUYong-liang,LüJian-xin,WANKang-lin.

*SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325035,China(*NowinStateKeyLaboratoryforInfectiousDiseasePreventionandControl,NationalInstituteforCommunicableDiseaseControlandPrevention,ChineseCenterforDiseaseControlandPrevention,Beijing102206,China)Correspondingauthor：WANKang-lin,Email：wankanglin@icdc.cn;LüJian-xin,Email：jxlu313@163.com

Objective To confirm the species of the clinical isolates suspectedMycobacteriummassiliense(M.massiliense) which could not be identified by the single gene comparison, and test their drug-sensitivity spectrum to provide the basis of clinical diagnosis and treatment. Methods In 2013，we collected 47 clinical samples of the patients suspected with non-tuberculous Mycobacteria (NTM) infection in Tuberculosis Laboratory of National Institute for Communicable Disease Control and Prevention, Chinese Center for Disease Control and Prevention. TheMycobacteriaisolates were determined with the media containing p-nitrobenzoic acid (PNB) and 2-thiophene carboxy-lic acid hydrazide (TCH) respectively and multilocus PCR. Five house-keeping genes (16S rRNA,hsp65,rpoB,sodAandrecA) were analyzed by DNA sequencing, and compared by Basic Local Alignment Search Tool (BLAST) to identifying the species of NTM, in which the species of 6M.massilienseisolates were confirmed by means of multilocus sequence analysis (MLSA). The drug-sensitivities ofM.massilienseisolates to 36 antibiotics were tested with the minimal inhibitory concentrations (MICs) by Microplate AlamarBlue Assay(MABA). Results Of 47 clinical samples from the patients suspected with NTM infection, 34 NTM strains were isolated, in which 6 strains could not be identified by DNA sequencing and BLAST using the single gene sequence comparison with five house-keeping genes. These strains were confirmed asM.massilienseby MLSA with a Neighbor-joining tree. The drug sensitive spectrum to 36 antibiotics showed thatM.massilienseisolates were sensitive to Amikacin (16 μg/ml or 32 μg/ml), resistant to 12 kinds of anti-tuberculosis drugs, rifampin, isoniazid, ethambutol, ciprofloxacin, ethionamide, capreomycin, para-aminosalicylic acid, ofloxacin, kanamycin, cycloserine, meropenem, and minocycline; and extremely insensitive to isoniazid aminosalicylate, cefoperazone and thioacetazone. Conclusion The MLSA method is effective in identification ofM.massiliensestrain.M.massiliensestrains had a higher degree of drug resistance.

Mycobacterium； Multilocus sequence typing； Microbial sensitivity tests

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.03.016

“十二五”國家科技重大專項(2013ZX10003006-002-001)；傳染病預防控制國家重點實驗室重點項目(2014SKLID104)

325035 溫州醫科大學檢驗醫學院生命科學學院[魏劍浩、樓永良、呂建新、萬康林(特聘教授)]；中國疾病預防控制中心傳染病預防控制所 傳染病預防控制國家重點實驗室[魏劍浩(研究生)、郭倩(研究生)、李桂蓮、劉海燦、李馬超、萬康林]；南華大學病原生物學研究所[郭倩、吳移謀、萬康林(特聘教授)]；感染性疾病診治協同創新中心[萬康林(特聘研究人員)]

萬康林，Email：wankanglin@icdc.cn；呂建新，Email：jxlu313@163.com

2014-12-01)