桂花多糖體外免疫活性的研究

尹 偉，陶阿麗，戴 一，施伶俐，張國升

（安徽新華學院 藥學院，安徽 合肥 230088）

多糖作為天然生物體大分子物質，具有多種多樣的生物活性，如增強機體免疫功能、抗氧化作用，并在抗腫瘤方面發揮著重要的生物活性作用.據報道[1]，植物多糖的免疫調節作用可能是通過激活機體免疫細胞活性，以促進這些細胞對IL-2、IFN-γ、TNF-α 等細胞因子的分泌，從而產生一定的免疫調節作用.亦有報道表明[2]，植物多糖的這些免疫作用可能與抗腫瘤作用密切相關.目前報道較多的植物多糖，如半夏多糖、青蒿多糖等均具有調節機體細胞免疫功能以及抑制腫瘤細胞作用[3].

桂花(Osmanthus fragrans Lour.)，為木犀科木犀屬植物，是木犀科常綠灌木或小喬木.《本草綱目》記載：桂花，味甘、辛，性溫，能暖胃、益胃、驅寒，并具有疏肝理氣、祛痰止咳和順肺開胃的功效[4].現代研究表明[5]，桂花具有降血糖、抗炎、抑菌、體內外抗氧化和清除自由基等生物活性.桂花多糖是桂花的重要成分之一，但是目前對桂花的研究主要集中在桂花精油方面，而對桂花多糖的免疫活性則尚未見報道.

本課題在前期研究的基礎之上，擬使用前期得到的桂花多糖作為原料，考察桂花多糖的體外免疫活性，旨在為臨床新藥研發提供一定的參考.具體報道如下：

1 材料

1.1 主要試劑

二甲基亞砜(DMSO，上海市欣誠試劑有限公司)；RPMI-1640(上海元龍生物技術有限公司)；胎牛血清(江蘇澤雨生物科技有限公司)；刀豆蛋白A(ConA，上海豐壽生物科技有限公司)；MTT(噻唑藍，上海豐壽生物科技有限公司)；臺盼藍(上海恒遠生物科技有限公司)

1.2 主要儀器

CO2細胞培養箱(上海百典儀器廠)；HZS-H水浴振蕩器(金壇市精達儀器制造有限公司)；

96孔細胞培養板(上海研拓生物科技有限公司)；550型酶標儀(無錫華衛德朗儀器有限公司)

1.3 實驗動物

SPF級昆明種小鼠，購自安徽醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號：SCXK(皖)2011-002號.

2 方法

2.1 制備鼠脾淋巴細胞

取SPF級昆明種小鼠，處死(頸椎脫臼方法)，乙醇(75%)中浸泡(5min)，無菌手術將其脾臟取出，使用PBS洗3次.用消毒無菌鑷子輕輕捻碎脾臟，過篩(200目)，最終得到細胞懸液，離心，加入0.85%NH4Cl裂解紅細胞，沖打，靜置約10min，離心，收集細胞，沖洗，檢測細胞存活率(臺盼藍方法)>96%.用RPMI-1640(RoswellParkMemorialInstitute)培養基，轉至培養板中(96孔)，于培養箱(37℃，5% CO2)中培養.

2.2 測定細胞濃度和存活率(臺盼藍法)

將細胞懸浮液(100ul)與0.2%(100ul)的臺盼藍溶液混勻，加入500mlNaCl(0.9%)，鏡檢.其中，細胞數(每毫升)=大個中平均或細胞的數目×104/ml×稀釋倍數；細胞存活率=活細胞數目/總細胞數目×100%，細胞存活率應>90%.

2.3 桂花多糖的毒性試驗(脾淋巴細胞)

將小鼠脾細胞懸液加至細胞培養板(96孔)，100ul/孔；加樣品，100ul/孔；相關陰性對照組中只加培養基(RPMI-1640).平行三復孔.放置細胞培養箱中(37℃，5%CO2)48h.取出細胞板，加MTT(噻唑藍)，20ul/孔，放置培養箱中繼續培養5h.取出，離心(2500r/min，5min)，去除上清液，每孔加DMSO 100ul，同時震蕩5min.用酶標儀測定(OD570nm).

2.4 桂花多糖誘導的淋巴細胞增殖測定

將小鼠脾細胞懸液加至細胞培養板(96孔)，100ul/孔；加樣品，100ul/孔；分別設置陽性和陰性對照，其中，ConA濃度為10ug/ml.平行三復孔.放置細胞培養箱中(37℃，5%CO2)72h.

取出細胞板，加MTT(噻唑藍)，20ul/孔，放置培養箱中繼續培養5h.取出，離心(2500r/min，5min)，去除上清液，每孔加DMSO 100ul，同時震蕩5min.用酶標儀測定(OD570nm).

2.5 ConA誘導的脾淋巴細胞增殖測定

將小鼠脾細胞懸液加至細胞培養板(96孔)，150ul/孔；在空白組中加25ulPRMI-1640培養基，陽性對照組加ConA 25ul，相關試驗組加ConA溶液分別為25ul，且濃度相同，再加樣品溶液25ul，最終用培養基將體積補充至200ul.檢測方法同上.

2.6 桂花多糖與ConA聯合誘導淋巴細胞增殖測定

將小鼠脾細胞懸液加至細胞培養板(96孔)，100ul/孔；隨后加入樣品與Con A，50ul/孔，濃度為5ug/ml.同時設置陰性、陽性與空白對照組.檢測方法同上.

2.7 桂花多糖對Con A誘導IL-2、IFN-γ 及TNF-α 分泌的作用

2.7.1 桂花多糖聯合ConA誘導淋巴細胞分泌IL-2、IFN-γ 的細胞培養液上清的制備

將小鼠脾細胞懸液加至細胞培養板(96孔)，100ul/孔；加樣品、ConA，100ul/孔，其中，ConA濃度為5ug/ml.同時設置陰性、陽性與空白對照組.平行三復孔.放置細胞培養箱中(37℃，5%CO2)48h.取出，合并培養液，離心(2500rpm，5min)，過濾沉淀，上清液備用(-20℃保存).

2.7.2 桂花多糖聯合Con A誘導巨噬細胞分泌TNF-α 的細胞培養液上清的制備

將巨噬細胞懸液加至細胞培養板(96孔)，1ml/孔，放置細胞培養箱中(37℃，5%CO2)2h，并去除上清液，洗去非黏附細胞(Hank’s溶液)；加樣品、Con A，50ul/孔，其中，ConA濃度為5ug/ml.同時設置陰性、陽性與空白對照組.平行三復孔.放置細胞培養箱中(37℃，5%CO2)48h.取出，合并培養液，離心(2500rpm，5min)，過濾沉淀，上清液備用(-20℃保存).

2.7.3 細胞培養液上清中IL-2、IFN-γ 及TNF-α的測定

根據ELISA試劑盒程序測定OD492值，繪制標準曲線，算出IL-2、IFN-γ 及TNF-α 的濃度.

2.8 統計學方法

所有研究數據均采用SPSS17.0統計學軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，并采用t檢驗.

3 實驗結果

3.1 桂花多糖的細胞毒性作用

研究結果顯示，桂花多糖1μg/ml、10μg/ml及100μg/ml的OD570nm值分別為 (0.264±0.04)、(0.341±0.01)、(0.502±0.02)，顯著優于陰性對照組的數值(0.113±0.02)，表明桂花多糖對淋巴細胞轉化增值，效果明顯，無顯著細胞毒性.

表1 桂花多糖以及聯合誘導的淋巴細胞增殖試驗

表1 桂花多糖以及聯合誘導的淋巴細胞增殖試驗

試驗組樣品單一誘導 聯合誘導陰性對照組 0.126±0.01 0.109±0.01 ConA對照組 0.315±0.03 0.302±0.01 1 0.298±0.01 0.333±0.02桂花多糖(ug/ml)10 0.366±0.03 0.373±0.03 100 0.440±0.02 0.444±0.03 1 0.281±0.01 0.286±0.02香菇多糖(ug/ml)10 0.356±0.02 0.348±0.03 100 0.418±0.03 0.397±0.04

3.2 桂花多糖及桂花多糖聯合誘導的淋巴細胞增殖測定

通過試驗數據可得出，桂花多糖試驗組的OD570nm數值均大于對照組，提示桂花多糖對鼠脾淋巴細胞有較好的增殖作用，同時依據劑量的加大(1μg/ml、10μg/ml、100μg/ml)，誘導作用亦逐漸加強.另，桂花多糖與香菇多糖OD570nm值較為接近，顯示了桂花多糖對小鼠脾淋巴細胞的增殖作用方面，與香菇多糖效果相當，同時均大于ConA的作用效果.詳見表1.

3.3 細胞培養液上清中IL-2、IFN-γ 及TNF-α的測定

3.3.1 標準曲線的繪制

IL-2含量測定標準曲線：

y=1.4421x-1.9934(r=0.9992)；

IFN-γ 含量測定標準曲線：

y=1.6001x-1.5329(r=0.9939)；

TNF-α 含量測定標準曲線：

y=1.6044x-1.7171(r=0.9992)；

3.3.2 桂花多糖對ConA誘導的IL-2、IFN-γ 及TNF-α 指標分泌的影響對比

通過試驗數據得出，桂花多糖實驗組的細胞因子濃度顯著優于對照組，顯示了桂花多糖對Con A誘導的細胞因子(IL-2、IFN-γ、TNF-α)分泌促進效果顯著，同時與劑量大小在一定范圍內，保持一定的正相關.且同香菇多糖對細胞因子分泌的促進作用相比，在一定程度上，效果優于香菇多糖.

表2 桂花多糖聯合Con A誘導的IL-2、IFN-γ 及TNF-α 指標情況對比

4 小結

研究顯示[6-8]，植物多糖在抗腫瘤、免疫、心血管、抗衰老等方面都具有較為重要的作用，目前已經成為廣大醫藥學工作者的研究熱點.隨著分子生物學，生物化學等學科研究的發展，植物多糖的研究也越來越深入.同時，科學家們亦將多糖的研究提到了生命科學的前沿，提出了“二十一世紀是多糖的世紀”的概念.

本研究結果顯示，桂花多糖無顯著的細胞毒性，對淋巴細胞誘導的增殖轉化效果明顯，并且對IL-2、IFN-γ、TNF-α 的分泌有很強的促進作用，同時在一定程度上，隨著劑量增大，效果亦顯著，與香菇多糖的作用效果相當.

綜上，系統的研究桂花多糖的免疫活性，對其抗腫瘤作用的研究，奠定一定的基礎.

〔1〕苗晶，東方，季宇彬，等.多糖抗腫瘤作用機制研究進展[J].河北科技師范學院學報，2012，26(2)：42-45.

〔2〕牛廣財，朱丹.植物多糖的生物活性及其制備技術研究進展[J].食品研究與開發，2005，26(6)：191-194.

〔3〕李松，吳青華，陳暢，等.多糖抗腫瘤活性的最新研究進展[J].中國生化藥物雜志，2007，28(3)：213-215.

〔4〕任全進，朱洪武，于金平.桂花資源的利用價值[J].中國野生植物資源，1983，18(4)：32-33.

〔5〕劉龍昌，向其柏.木犀屬植物的研究進展[J].南京林業大學學報（自然科學版），2013，27(2)：84-85.

〔6〕劉衛軍，顧振綸，周文軒.植物多糖抗腫瘤活性研究進展[J].中國野生植物資源，1997，12(1)：1-4.

〔7〕Witkowski B,Lelièvre J,Barragán MJL,et al.Increased tolerance to artemisinin in plasmodium falciparum is mediated by a quiescence mechanism[J].Antimicrobial Agents Chemotherapy,2010,54(5):1872-1877.

〔8〕王章姐，郁萬楊，張夢茹.植物多糖研究進展[J].亞太傳統醫藥，2014，10(6)：39-40.