羅布麻浸膏微生物限度檢查方法的驗證

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【摘要】 目的：應用試驗驗證羅布麻浸膏微生物限度檢查的方法。方法：選用平皿法與培養(yǎng)基稀釋法測定該藥品對5株驗證菌的回收率，同時驗證控制菌（大腸埃希菌）的檢驗方法。結果：5株人工污染菌的回收率均達到70%以上，符合驗證要求。結論：該方法有效排除了樣品抑菌作用的干擾，適用于羅布麻浸膏的微生物限度檢查。

【關鍵詞】 羅布麻浸膏；微生物限度檢查；驗證試驗

【中圖分類號】R927.11【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2015）08-0035-02

羅布麻浸膏曾用名為羅布麻霜，收載于《國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準》，具有祛痰、降血壓、止咳、降血脂、抗菌消炎、抗衰老等功效[1]。其作用效果顯著，尚未見毒副作用。由于羅布麻浸膏具有明顯的抑菌作用，采用常規(guī)的微生物限度檢查方法不能反映出樣品被微生物污染的情況，因此選擇合適的方法除去自身既有的抑菌作用才能進行微生物限度檢查。為了確定該藥品的抑菌活性及檢驗方法的可靠性，本文按照微生物限度檢查法的現(xiàn)行標準（《中國藥典》2010年版一部）的相關要求[2]，制定了羅布麻浸膏的微生物限度檢查法，驗證結果表明檢驗方法簡便易行、準確、可靠，為同類藥物的微生物限度檢查提供了科學的試驗依據(jù)。

1儀器與材料

1.1儀器（見表1）

1.2培養(yǎng)基及試劑（見表2）

1.3供試品羅布麻浸膏（新疆尉犁縣金興甘草制品有限公司）。

1.4試驗用菌株（見表3）

以上菌株均為第三代，由新疆維吾爾自治區(qū)食品藥品檢驗所提供。

2方法學驗證與結果[2]

2.1菌液制備方法分別取適量枯草芽孢桿菌、大腸埃希菌（ECO）、金黃色葡萄球菌（sau）標準菌株，轉移至10ml滅菌后的營養(yǎng)肉湯中，恒溫（37℃）下培養(yǎng)18～24h；取白色念珠菌（cal）適量，接種于改良馬丁培養(yǎng)基中，在25℃下恒溫培養(yǎng)24～48h。分別取1ml上述培養(yǎng)物，置于盛有加9ml的0.9%無菌NaCl溶液的試管中稀釋使為10-5～10-7的菌懸液[2]。

將黑曲霉培養(yǎng)物轉移在改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基上，25～28℃培養(yǎng)7d，用3ml 0.9%無菌NaCl溶液洗脫孢子，之后取1ml孢子液，倒入9ml的0.9%無菌NaCl溶液中稀釋使為10-5～10-7的孢子懸液[2]。

2.2供試液制備取樣品10g，置錐形瓶中，加無菌NaC-蛋白胨緩沖液（pH7.0）至100ml，4000r/min振搖5min，使充分溶解混勻，便可（1∶10）。

2.3細菌、霉菌及酵母菌檢查方法的驗證

2.3.1試驗組①平皿法：取“2.2”項下的供試液1ml，及各“2.1”項下的五種試驗菌，分別注入平皿中，迅速倒入45℃完全溶化的相應培養(yǎng)基20ml，為減少誤差每株菌平行制備2個平皿，待冷凝后，置所需溫度下倒扣培養(yǎng)至規(guī)定的時間，觀察計數(shù)。②培養(yǎng)基稀釋法：取0.2ml“2.2”中的供試液/皿，每皿加入驗證菌各10-5～10-7，其余方法同平皿法。

2.3.2菌液組不添加供試液，分別取“2.1”項下的五種試驗菌，操作方法同試驗組測定所加入的試驗菌數(shù)。

2.3.3供試品對照組不加試驗菌之外，其余方法同試驗組，測定供試品本底菌數(shù)。平皿法與培養(yǎng)基稀釋法各菌回收率試驗結果見表4。

2.4大腸埃希菌檢查方法的驗證取供試液（1∶10）10ml及1ml10-5～10-7大腸埃希菌，接種在預先制備好的100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基（BL）中，于37℃下恒溫培養(yǎng)24h，觀察培養(yǎng)基澄清度的變化；之后取渾濁管中的培養(yǎng)物適量做熒光反應與靛基質試驗。另取培養(yǎng)物劃線接種于MacC平板上，恒溫（37℃）培養(yǎng)24h后觀察其菌落的生長形態(tài)特征[2]。同時取金黃色葡萄球菌替代大腸埃希菌，其余操作方法同試驗組。結果見表5。

3討論

從表4結果可以看出，羅布麻浸膏經常規(guī)平皿法驗證可以使人工污染的黑曲霉菌、大腸埃希菌和白色念珠菌的回收率在80%～99%，提示該藥品對以上菌株無抗菌作用或抗菌作用很弱，回收率的結果滿意（規(guī)定大于70%），證明平皿法可用于該藥物的霉菌及酵母菌數(shù)檢查。表4中還可知，羅布麻浸膏對枯草芽孢桿菌非常敏感，完全被抑制，回收率僅為0；而對金黃色葡萄球菌較敏感，回收率為44%～55%，說明羅布麻浸膏對細菌的生長繁殖有一定的抑制作用，不能采用常規(guī)法測定細菌數(shù)，必須改用其它的方法消除自身對細菌的抑制作用。但羅布麻浸膏對細菌的抑制作用不是很強，本試驗選用了培養(yǎng)基稀釋法。實驗結果顯示，每皿0.2ml，可基本去除抑菌成分對細菌生長的影響，回收率均大于70%。為此，培養(yǎng)基稀釋法（每皿0.2ml）可用于羅布麻浸膏的細菌數(shù)檢查。

從表5可知，在控制菌的驗證中，試驗組MUG呈現(xiàn)熒光，MUG陽性，靛基質試液液面呈玫瑰紅色，結果檢出大腸埃希菌；陰性菌對照組結果為未生長（表示未檢出金黃色葡萄球）。故控制菌（大腸埃希菌）用常規(guī)方法檢查。

通過方法驗證試驗，羅布麻浸膏的微生物限度檢查可采用培養(yǎng)基稀釋法（0.2ml/皿）測定細菌數(shù)；霉菌及酵母菌數(shù)采用平皿法測定；控制菌檢查采用常規(guī)法即可達到效果。

參考文獻

[1] 國家藥典委員會.國家藥品標準化學藥品地方標準上升國家標準（第11冊）[M].國家藥品監(jiān)督管理局，2002：76-77.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）[M].北京：中國中醫(yī)藥科技出版社，2010：附錄79-88.

（收稿日期：2015.01.26）