巴馬小型豬T2DM模型胰島素抵抗及瘦素、抵抗素水平的變化

于健，鄒迪莎，葉瑤，周燕，胡璟，楊帆，黃漓莉，劉曉玲，莫如芬

(1桂林醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西桂林541001;2桂林醫(yī)學院研究生院)

目前，2型糖尿病(T2DM)的確切發(fā)病機制仍未明確。研究發(fā)現(xiàn)，脂肪細胞因子瘦素、抵抗素等與T2DM、肥胖與高胰島素血癥、胰島素抵抗(IR)密切相關(guān)［1～3］。2013年5月 ～2014年5月，我們通過構(gòu)建巴馬小型豬T2DM模型，觀察其血清瘦素、抵抗素水平變化，旨在探討巴馬小型豬T2DM模型IR及與血清瘦素、抵抗素水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物:健康雄性廣西巴馬小型豬10只，2～3個月齡，體質(zhì)量10～20 kg。均給予常規(guī)飲水，每日投食3次，飼養(yǎng)條件為室溫18～25℃，每日光照約12 h，相對濕度50% ～80%，有持續(xù)空氣交換。小型豬適應性喂養(yǎng)1周后，隨機分為對照組、模型組各5只。對照組普通飼料喂養(yǎng);模型組高脂高糖飼料喂養(yǎng)(高脂高糖飼料配方為:蔗糖37%、豬油10%、膽固醇2%、普通飼料51%)。喂養(yǎng)期為10個月，實驗過程中對動物的處理方法符合中華人民共和國科學技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》。實驗藥品:瘦素、抵抗素試劑盒購自美國Phoenix Pharmaceutical公司;胰島素放射免疫分析試劑盒購自北京北方生物技術(shù)研究所;胰島素單克隆抗體購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司;豬油、蔗糖、普通飼料均購自桂林市漓源糧油飼料有限責任公司;蛋黃粉購自南通康德生物制品有限公司。

1.2 方法

1.2.1 T2DM模型的構(gòu)建 根據(jù)動物體質(zhì)量稱取適量鏈脲佐菌素(STZ)溶于0.1 mol/L檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.2～4.5)中，濃度為10 g/L，禁食空腹注射STZ溶液。實驗至11個月初給予模型組小型豬腹腔注射STZ 100 mg/kg，1周后，重復上述劑量1次。對照組小型豬腹腔注射等劑量檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液。成模標準參照1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標準:具有糖尿病典型癥狀(多尿、多飲、多食及消瘦)，且空腹血糖(FPG)≥7.0 mmol/L或隨機血糖≥11.1 mmol/L。如無糖尿病癥狀，則需空腹和餐后血糖同時達到上述標準時，才可診斷糖尿病。

1.2.2 FPG、胰島素(FINS)、瘦素、抵抗素水平檢測

禁食過夜的小型豬前腔靜脈抽血，F(xiàn)PG采用葡萄糖氧化酶法檢測;瘦素、抵抗素采用酶聯(lián)免疫分析法檢測;胰島素放射免疫分析試劑盒檢測FINS水平。胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)=FPG×FINS/22.5。

1.2.3 胰腺組織HE染色及胰島β細胞免疫組化染色 實驗結(jié)束時(12個月末)，將對禁食過夜的小型豬肌肉注射速眠新(0.2～0.25 mL/kg)，聯(lián)合10%水合氯醛(2 mL/kg)腹腔注射麻醉，股動脈放血處死，取胰腺組織，常規(guī)固定、脫水、石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察。并取胰腺組織石蠟切片，胰島素單克隆抗體作免疫組化染色(按試劑盒操作步驟進行)。

1.2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，數(shù)據(jù)行正態(tài)分布檢驗;組間計量資料比較采用t檢驗，瘦素、抵抗素水平變化及與HOMA-IR的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般情況比較 對照組精神狀況良好，毛發(fā)光澤，生長良好。模型組均成模，成模小型豬毛發(fā)粗糙、無光澤，精神萎靡，并出現(xiàn)多尿、多飲、多食及體質(zhì)量下降等糖尿病癥狀。高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個月后，模型組體質(zhì)量［(86.32±5.86)kg］較對照組［(41.54±4.54)kg］升高，差異有統(tǒng)計學意義(t=15.672，P ＜0.01)。

2.2 高脂高糖飲食對小型豬FPG、FINS及HOMAIR的影響 高脂高糖飼料喂養(yǎng)10個月后，模型組FBG、FINS及 HOMA-IR較對照組均升高(P＜0.01)。見圖1。

圖1 高脂高糖飲食對小型豬FPG、FINS及HOMA-IR的影響

2.3 STZ對小型豬FPG、FINS的影響 實驗11個月初模型組腹腔注射不同劑量STZ;實驗結(jié)束時(12月末)與對照組比較，模型組FPG水平升高，F(xiàn)INS水平降低(P均＜0.01)，且模型組FPG穩(wěn)定維持在9.8～15.6 mmol/L水平。見圖2。

2.4 兩組胰腺組織HE染色結(jié)果比較 模型組鏡下可見胰島整體形態(tài)萎縮，邊緣不規(guī)整，細胞排列紊亂，胰島及胰島內(nèi)細胞數(shù)目均減少，部分細胞核形狀不規(guī)則，胞質(zhì)內(nèi)呈空泡變性。對照組胰島呈圓形或橢圓形，邊緣規(guī)整，與腺體緊密結(jié)合在一起，胰島及胰島內(nèi)細胞數(shù)目多，胞核清晰且胞質(zhì)豐富，整個胰腺組織結(jié)構(gòu)基本正常。

2.5 兩組胰島β細胞免疫組化染色結(jié)果比較 模型組每視野下(×200)可見散在數(shù)個胰島細胞團，細胞排列紊亂，高倍鏡(×400)下胰島β細胞團整體形態(tài)結(jié)構(gòu)破壞，胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒明顯減少。對照組每視野下(×200)可見多個胰島細胞團，細胞排列整齊，高倍鏡(×400)下胰島β細胞團整體形態(tài)完整，占胰島細胞絕大部分，胞質(zhì)內(nèi)棕黃色顆粒著色深且含量豐富。

圖2 STZ注射不同時間點兩組FPG及FINS水平比較

2.6 T2DM小型豬瘦素、抵抗素水平變化及與HOMA-IR相關(guān)性分析 實驗結(jié)束時，模型組血清瘦素水平［(24.78±6.80)μg/L］較對照組［(13.68±6.04)μg/L］升高(t=2.729，P=0.026)。模型組血清抵抗素水平［(53.52±9.16)μg/L］較對照組［(38.95 ±10.39)μg/L］升高(t=0.351，P=0.047)。HOMA-IR與血清瘦素水平呈正相關(guān)(r=0.893，P=0.042)，與血清抵抗素水平呈正相關(guān)(r=0.933，P=0.020)。

3 討論

本實驗首先采用高糖高脂飼料喂養(yǎng)小型豬，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組出現(xiàn)明顯肥胖，胰島素水平逐漸升高，并產(chǎn)生IR，表現(xiàn)T2DM的病理特征，與Torres-Rovira等［4］研究結(jié)果一致。為進一步誘導典型T2DM模型，實驗11個月初腹腔注射STZ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)模型組在高糖高脂飲食基礎(chǔ)上聯(lián)合STZ注射可以成功構(gòu)建T2DM模型，成模小型豬均表現(xiàn)出典型“三多一少”糖尿病癥狀，且FPG水平顯著上升，F(xiàn)INS水平下降。胰腺病理切片及免疫組化均提示，成模組胰島β細胞破壞嚴重，數(shù)目明顯減少。結(jié)果提示應用高脂高糖喂養(yǎng)聯(lián)合STZ注射可以成功構(gòu)建小型豬T2DM模型，與既往研究結(jié)果一致［5］。

瘦素是由肥胖基因編碼、脂肪組織分泌的蛋白質(zhì)類激素。瘦素通過降低食欲、提高能量代謝效率、增加能量消耗、減少脂肪儲存而減輕體質(zhì)量;瘦素與脂肪代謝相關(guān)的疾病，如肥胖、T2DM、高脂血癥、高血壓、心腦血管病等密切相關(guān)，是聯(lián)系免疫系統(tǒng)和神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的重要橋梁。抵抗素也是一種由脂肪細胞分泌的多肽類激素，被認為是T2DM、肥胖、IR、糖尿病血管并發(fā)癥及其血脂異常的重要聯(lián)系因素。抵抗素引起IR的機制尚不明確，可能通過降低骨骼肌細胞、脂肪細胞、胰島β細胞胰島素敏感性，抑制肝臟糖代謝及增加FFA水平等誘導IR［6］。本研究結(jié)果表明，與對照組比較，模型組小型豬存在明顯IR，血清瘦素、抵抗素水平升高，且HOMA-IR與瘦素、抵抗素呈正相關(guān)，與其他研究一致［7］。

綜上所述，采用高脂高糖飼料聯(lián)合STZ可以成功誘導巴馬小型豬T2DM動物模型，模型組小型豬血清瘦素及抵抗素水平升高，且HOMA-IR與瘦素、抵抗素呈正相關(guān)。

［1］劉才華.2型糖尿病病人血清TNF-α、瘦素及抵抗素水平與心腦血管并發(fā)癥相關(guān)性［J］.青島大學醫(yī)學院學報，2014，50(2):136-138.

［2］石柯，張暢，段朝軍，等.高脂性肥胖小鼠脂肪細胞大小與其血清胰島素、瘦素水平相關(guān)性研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志，2013，23(28):11-14.

［3］楊冰，顏海青，夏振雄.肥胖兒童血清抵抗素與胰島素抵抗的相關(guān)性［J］.檢驗醫(yī)學與臨床，2014，11(12):1694-1695.

［4］Torres-Rovira L，Astiz S，Caro A，et al.Diet-induced swine model with obesity/leptin resistance for the study of metabolic syndrome and type 2 diabetes［J］.Scientific World J，2012，5(2):1-8.

［5］肖國華，張素君，余堅，等.高糖高脂聯(lián)合低劑量STZ誘導版納微型豬2型糖尿病模型的建立［J］.中南醫(yī)學科學雜志，2012，40(4):351-356.

［6］張艷紅，楊偉，馮明.抵抗素與胰島素抵抗、肥胖及2型糖尿病的關(guān)系［J］.中國全科醫(yī)學，2010，13(36):4158-4160.

［7］黃映光，孫若飛，王昆華，等.糖尿病動物建模前后脂肪細胞因子水平變化［J］.昆明理工大學學報(自然科學版)，2013，38(1):77-79.