烏司他丁對腦出血模型兔血清基質金屬蛋白酶-9、半胱天冬氨酸蛋白酶-3的影響

佟麗妍胡才寶許 莉馮為民

烏司他丁對腦出血模型兔血清基質金屬蛋白酶-9、半胱天冬氨酸蛋白酶-3的影響

佟麗妍1胡才寶2許 莉3馮為民1

目的 觀察烏司他丁對腦出血模型兔血清基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的影響，探討烏司他丁的腦保護作用。方法 將造模成功的20只新西蘭兔隨機分為腦出血模型組（模型組）和烏司他丁治療組（治療組），每組10只。分別給予生理鹽水和烏司他丁注射液，靜脈推注，共7天。應用ELISA法測定各組兔腦出血后第1、3、5、7天動脈血基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）含量。結果 與模型組比較，治療第1天治療組MMP-9[（951.72±216.35）ng/L]、Caspase-3[（58.11±5.07）μmol/mL]差異無統計學意義（P＞0.05）；治療第3、5、7天，治療組MMP-9[分別為（887.02±205.77）ng/L、（892.79±123.94）ng/L、（858.90± 97.37）ng/L]及Caspase-3[分別為（58.00±4.99）μmol/mL、（49.05±9.30）μmol/mL、（48.22±10.28）μmol/ mL]含量均明顯下降，差異有統計學意義（P均＜0.05）。結論 烏司他丁可下調腦出血模型兔血清MMP-9及Caspase-3含量，對腦出血具有一定的腦保護作用。

兔；腦出血；烏司他丁；基質金屬蛋白酶-9；半胱天冬氨酸蛋白酶-3

腦出血（cerebral hemorrhage，CH）后出血灶周圍腦組織水腫是導致繼發性神經元損害的重要因素。其中主要為血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）的破壞和神經細胞凋亡。研究[1]發現，基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）在腦組織損傷后明顯升高，是導致血管源性腦水腫和繼發性腦損傷的重要環節。半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）是凋亡信號傳導途徑中重要的調控基因[2]。烏司他丁（ulinastatin，UTI）是從人類尿液中提取精制而成的糖蛋白，具有抑制多種酶、穩定細胞膜和溶酶體膜，抑制溶酶體酶的活性及釋放等作用。研究表明，UTI對缺血性再灌注后腦組織損傷具有腦保護作用，本實驗旨在探討UTI在腦出血方面的腦保護作用。

表1 兩組血清MMP-9水平比較（ng/L，±s）

表1 兩組血清MMP-9水平比較（ng/L，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05

組別模型組治療組只數10 10 1d 1080.54±165.90 951.72±216.35 3d 1745.65±133.48 887.02±205.77△5d 1576.69±129.85 892.79±123.94△7d 1271.37±109.31 858.90±97.37△

1 實驗材料

1.1 動 物 選用健康成年新西蘭兔20只，雌雄不限，體質量（3.0±0.2）kg，由浙江省農業科學院提供，許可證號：SCXK（浙）2010-0047。飼養期間給予嚙齒類動物標準顆粒飼料及飲水，自主進食。溫度（23± 10℃），濕度50%～70%，正常晝夜節律，噪音＜50dB，通風，單籠飼養。實驗過程中對動物的處置符合動物倫理學標準。

1.2 藥 物 烏司他丁注射液（規格：10萬U/支，批號031301064）購自廣東天普生化醫藥股份有限公司。兔基質金屬蛋白酶9（MMP-9）酶聯免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號Ra45991L）及兔半胱天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）酶聯免疫檢測試劑盒（R&D公司，批號Ra34851L）均購自杭州達文生物有限公司。

2 實驗方法

2.1 動物分組 將造模成功的20只新西蘭兔根據隨機數字表法隨機平行分為腦出血模型組（模型組）和烏司他丁治療組（治療組），每組10只。

2.2 模型制備 將符合實驗標準的新西蘭兔，參照文獻[3]的方法加以改良：以戊巴比妥鈉（30mg/kg）耳緣靜脈麻醉,頭部剃毛,俯臥位固定于兔腦立體定位儀上。手術暴露顱骨十字縫和人字縫。參照Sawyer兔腦立體定位圖譜確定內囊位置：AP1mm，R6mm，H13mm。選取十字縫交叉點為基點沿冠狀縫向右旁開6mm再平行矢狀縫向前1mm為穿刺進針點。在兔耳中央動脈采取自體未凝動脈血0.5mL，用9號腰穿針快速垂直于顱骨穿入腦實質，進針深度13mm，3min之內緩慢注入，停針5min后緩慢拔針。局部壓迫止血，縫合皮膚，造模完成。

2.3 給 藥 模型組造模成功后連續7天，予以生理鹽水2mL，靜脈推注，1天3次；治療組造模成功后連續7天予以烏司他丁注射液1.7萬U/kg（相當于成人用藥量3倍劑量）加入2mL生理鹽水中，靜脈推注，1天3次。

2.4 觀察指標及方法 于造模后第1、3、5、7天，分別為各組動物采集動脈血，離心后收集血清，嚴格按照試劑盒說明書采用ELISA法檢測血清MMP-9、Caspase-3水平。

2.5 統計學方法 應用SPSS17.0軟件進行統計分析，數據用表示，采用單因素方差分析及t檢驗法，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 兩組血清基質金屬蛋白酶-9水平比較 與模型組比較，治療第1天治療組MMP-9略低，但兩組無統計學差異（P＞0.05）；治療第3、5、7天，治療組MMP-9水平均下降，與同時段模型組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表1。

3.2 兩組血清半胱天冬氨酸蛋白酶-3水平比較

與模型組相比，治療第1天治療組Caspase-3略上升，但無統計學差異（P＞0.05）；治療第3、5、7天，治療組Caspase-3水平下降，與同時段模型組比較，差異有統計學意義（P均＜0.05）。見表2。

表2 兩組血清Caspase-3水平比較（μmol/mL，±s）

表2 兩組血清Caspase-3水平比較（μmol/mL，±s）

注：與模型組比較，△P＜0.05

模型組治療組10 10 58.01±6.28 58.11±5.07 76.58±13.05 58.00±4.99△68.25±11.71 49.05±9.30△66.09±10.55 48.22±10.28△

3 討論

近年研究表明，基質金屬蛋白酶（MMPs）對神經系統的作用和影響十分廣泛。MMPs是一組降解細胞外基質蛋白（extracellular matrix，ECM）的鋅依賴蛋白酶，正常狀態下以酶原形式存在，且被控制在較低水平，在某些病理生理情況下，其活性明顯增加，參與組織的損傷與修復。Gao等[4]發現,腦缺血及再灌注后出現MMPs增加，而Yang等[5]發現在此過程中MMP-9增加最明顯。MMP-9通過降解基底膜的ECM破壞血腦屏障，導致腦損傷，同時還通過誘導神經細胞變性死亡等機制造成腦損害。研究發現，腦出血（CH）后MMP-9水平變化與CH患者腦水腫的演變規律相一致[6]。CH能誘導內源性的MMP-9在腦組織中表達，破壞血腦屏障，使得循環中的大、小分子包括血漿蛋白、多種毒性物質、代謝產物及炎性細胞等進入腦內，進一步促進血管源性腦水腫的形成[7]。給予外源性MMP抑制劑,可在一定程度上減輕缺血和再灌注損傷,緩解繼發于腦出血時的血管源性腦水腫[8]。

烏司他丁具有穩定溶酶體膜，減少炎癥因子（IL-8、IL-6、TNF-α等）釋放，抑制炎癥反應的作用[9]。在對重癥急性胰腺炎相關性腦損傷的實驗研究中證實有較好的腦保護作用[10]。本實驗結果顯示，兔腦出血后，MMP-9明顯升高，應用UTI治療第3天后MMP-9明顯下降，至第7天，降至接近正常水平，與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05）。實驗中UTI可能通過抑制溶酶體酶，穩定細胞膜和溶酶體膜的作用，保護ECM，抑制了MMP-9對ECM的破壞作用，從而維持血腦屏障的完整。因而，UTI可能通過上述途徑起到腦保護作用。

腦損傷后細胞凋亡過程中最終都會激活細胞的半胱天冬氨酸蛋白酶。Jiang等[11]發現UTI能抑制失血性休克大鼠回腸組織Caspase-3蛋白的表達，抑制組織細胞凋亡，產生細胞保護作用。對CH大鼠腦片進行TUNEL染色的研究[12]發現，TUNEL染色陽性凋亡細胞在CH后6h開始出現，1～3天大量形成，3天達高峰，推測凋亡的內皮細胞可能促進血腦屏障破壞和血管神經源性水腫。吳倩佳等[13]研究顯示，UTI可明顯降低腦缺血再灌注中腦組織Caspase-3蛋白的表達，減少腦細胞凋亡。近年研究表明，在腦缺血再灌注損傷的過程中Caspase-3蛋白參與了腦缺血后神經元損傷的病理過程，并起著重要的作用[14]。UTI可能使細胞線粒體破壞程度減輕，從而減慢凋亡進程，及早應用可以有效保護腦細胞。本實驗結果顯示，兔腦出血后應用UTI，血清Caspase-3下降明顯，并與模型組比較差異有統計學意義（P＜0.05），提示UTI可能抑制Caspase-3的激活，減少出血灶周圍神經細胞的凋亡，產生腦保護作用。

綜上所述，烏司他丁可下調腦出血模型兔動脈血MMP-9及Caspase-3含量，可減輕血管源性腦水腫，維持血腦屏障完整，減少細胞凋亡，對腦出血具有一定的腦保護作用。烏司他丁對腦出血后腦細胞保護的作用機制尚需進一步研究。

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（收稿：2015-01-15 修回：2015-01-27）

Effect of Ulinastatin on M atrix M etallopeptidase 9 and Caspase-3 in Rabbits w ith Cerebral Hemorrhage

TONG Liyan1,HU Caibao2,XU li3,FENG Weimin1. 1Department of Neurology,Hangzhou Traditional Chinese Medical Hospital,Hangzhou (310007),China;2Department of Cardiology,Zhejiang Hospital,Hangzhou(310000), China;3ICU Ward&Department of Cardiology,First People's Hospital of Yuhang District,Hangzhou,Hangzhou (310000),China

Objective To investigate the effect of ulinastatin（UTI）on matrix metallopeptidase 9（MMP-9）and caspase-3 in cerebral hemorrhage model of rabbits,in an attempt to explore the neuroprotective effect of UTI. M ethods Twenty New Zealand rabbits with cerebral hemorrhage were randomly divided into 2 groups:model group and UTI group,with 10 rabbits in each group.Model group was given intravenous normal saline（2mL,b.i.d）and UTI group received intravenous injection of UTI（17000U/kg,b.i.d）for 7d.Blood samples were obtained to measure the contents of MMP-9 and caspase-3 with ELISA on Day 1,3,5,and 7.Results Compared with model group,the contents of MMP-9（951.72±216.35ng/L）and caspase-3（58.11±5.07μmol/mL）in UTI group on Day 1 were not significantly different（P＞0.05）,while those on Day3,5,and 7 were decreased significantly（MMP-9: 887.02±205.77ng/L,892.79±123.94ng/L,858.90±97.37ng/L;caspase-3:58.00±4.99μmol/mL,49.05±9.30μmol/mL, 48.22±10.28μmol/mL;all P＜0.05）.Conclusion UTI can reduce the contents of MMP-9 and caspase-3 during cerebral hemorrhage in model rabbits,indicating that UTI has cerebral protective effect on cerebral hemorrhage.

rabbits;cerebral hemorrhage;ulinastatin;matrix metallopeptidase 9;caspase-3

天普科學研究基金資助項目（No.01200919）；浙江省科技廳重癥醫學科技創新團隊項目（No.2011R50018-02）

1杭州市中醫院神經內科（杭州 310007）；2浙江醫院心內科（杭州 310000）；3杭州市余杭區第一人民醫院ICU重癥監護室（杭州 311100）

胡才寶，Tel：13958169315；E-mail：zjicu1996@163.com