3-methyladenine下調(diào)自噬對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響

鄭超波 吳 炯 李雅國

3-methyladenine下調(diào)自噬對小鼠腦缺血再灌注損傷的影響

鄭超波 吳 炯 李雅國

目的 探討自噬對腦缺血再灌注損傷的影響。方法 54只CD-1小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組6只，缺血再灌注組24只，鹽水對照組9只和3-MA組15只。缺血再灌注組再分為6、12、24和48h組，每組6只。采用線拴法建立t-MCAO模型。假手術(shù)組和缺血再灌注組小鼠不給藥，鹽水對照組小鼠給予5μL生理鹽水；3-MA組小鼠麻醉后置于立體定位架，術(shù)前30min用Hamilton注射器于左側(cè)側(cè)腦室定位后分別注射5μL濃度為2、10、50mM的3-MA。采用Western blot半定量檢測再灌注后缺血側(cè)/左側(cè)皮層、海馬和紋狀體LC3Ⅱ蛋白表達(dá)變化，TTC染色觀察3-MA（10mM）組和對照組缺血再灌注后24h腦梗死體積及水腫率。結(jié)果 缺血再灌注組6、12、24、48h皮層、海馬和紋狀體LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)均有升高趨勢，其中皮層和海馬區(qū)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)于24h升高最為明顯，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而缺血再灌注組各個時間點(diǎn)紋狀體區(qū)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量與假手術(shù)組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與鹽水對照組比較，3-MA（10mM）組小鼠腦梗死體積明顯減少[（26.72±1.53）mm3對（51.80±2.85）mm3，P＜0.001]，水腫率明顯降低[（7.82±0.75）%對（16.55±4.47）%，P＜0.01]。結(jié)論 自噬的下調(diào)對腦缺血再灌注損傷有神經(jīng)保護(hù)作用。

小鼠；缺血再灌注；自噬；3-methyladenine；LC3Ⅱ

自噬是一個可調(diào)控的溶酶體介導(dǎo)的通過清除細(xì)胞內(nèi)的異常蛋白和已被損壞細(xì)胞器來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的過程[1]。因此，在生理情況下機(jī)體內(nèi)存在自噬，并且自噬可以被細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外信號進(jìn)一步激活如饑餓、病原體的感染和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2-3]，自噬的過度激活可以導(dǎo)致細(xì)胞的程序性凋亡，被稱為Ⅱ型程序性細(xì)胞凋亡，可引起一系列疾病發(fā)生[4]。短暫性局灶性腦缺血引起細(xì)胞死亡的主要方式有壞死、凋亡和自噬。近年研究證實(shí)，腦缺血損傷可以激活自噬，但是對于自噬在腦缺血再灌注損傷中所起的作用目前尚不清楚。本實(shí)驗通過小鼠腦缺血再灌注模型探討自噬對腦缺血再灌注損傷的影響，為腦卒中的臨床研究提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗材料

1.1 動 物 雄性CD1小鼠54只，購自上海斯萊克實(shí)驗動物有限公司，合格證號SCXK（滬）2013-0016，二級，體質(zhì)量25～30g。每籠6只，室溫（23± 1）℃，濕度（50±10）%，自然光照，自由攝食飲水。

1.2 藥物與試劑 cocktail、PMSF、Ripa和SDS等蛋白提取試劑均購自上海時代生物科技有限公司，BCA試劑盒購自上海索萊寶生物科技有限公司，LC3II多克隆一抗、化學(xué)發(fā)光底物、自噬抑制劑3-MA購自美國Sigma生物試劑公司，其中3-MA使用前配置成所需濃度，HRP-偶聯(lián)二抗購自碧云天生物技術(shù)研究中心，β-Actin購自美國santa cruz生物公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購自上海時代生物科技有限公司。

1.3 儀 器 Hamilton注射器購自北京勃朗寧科技有限公司，動物立體定位架購自北京馳博康有限公司，6-0栓線購自美國Dermolon公司，高溫?zé)破髻徸悦绹?Bovie公司，PE-10管購自美國BD公司，熱毯、動物顯微鏡購自深圳瑞奧德生命科技公司，電泳設(shè)備、轉(zhuǎn)膜儀及化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)購自美國Bio-rad公司。

2 實(shí)驗方法

2.1 分 組 采用隨機(jī)數(shù)字表法將54只小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組6只，缺血再灌注組24只，鹽水對照組9只和3-MA組15只，除假手術(shù)對照組外，其余各組均建立腦缺血再灌注模型。缺血再灌注組再隨機(jī)分為6、12、24及48h組，每組6只，分別于再灌注后6、12、24、48h處死小鼠，用于研究缺血再灌注后腦組織中自噬的變化；3-MA組再隨機(jī)分為2mM濃度組3只，10mM濃度組9只和50mM濃度組3只，用于3-MA對缺血再灌注后梗死體積及缺血側(cè)水腫影響的研究。

2.2 模型制備 將6-0栓線的尖頭靠近高溫?zé)破鳠蓤A頭，切割1.5cm，然后將栓線伸入含有硅橡膠的PE-10管中，包裹長度約2.0mm，沾有硅橡膠的線拴直徑約為0.25mm，自然晾干。手術(shù)方法參考文獻(xiàn)[5]，將線栓從左側(cè)頸外動脈處逆行插向頸總動脈的分叉處，再將線栓轉(zhuǎn)至頸內(nèi)動脈腔，動作輕緩地將線栓小心經(jīng)顱內(nèi)段頸內(nèi)動脈插入至感到輕微阻力，進(jìn)線深度為（0.9±0.05）cm，用套線將線栓固定在頸外動脈殘端，60min后拔出線栓。手術(shù)過程中，利用熱毯將小鼠的體溫保持在37℃左右。手術(shù)成功模型標(biāo)準(zhǔn)：線栓阻塞后血流為未阻塞前的20%以下，拔出后恢復(fù)至原來的80%以上；動物蘇醒后表現(xiàn)為下列體征之一：站立和爬行時出現(xiàn)右側(cè)傾倒和右側(cè)劃圈，左側(cè)的Horner征（左側(cè)的眼裂減小），提尾時出現(xiàn)右側(cè)前肢的內(nèi)收及屈曲。假手術(shù)對照組小鼠僅進(jìn)行頸部血管分離和頸外動脈結(jié)扎。

2.3 給 藥 假手術(shù)組和缺血再灌注組小鼠不給藥，鹽水對照組小鼠給予5μL的生理鹽水；3-MA組小鼠麻醉后置于立體定位架，術(shù)前30min用Hamilton注射器于左側(cè)側(cè)腦室定位（前囟后0.7mm，旁開1.5mm，進(jìn)針2.0mm），分別注射5μL濃度為2、10、50mM的3-MA（3-MA用生理鹽水稀釋并加熱至65°C）。

2.4 Western blot檢測LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá) 處死小鼠后，斷頭取腦，在顯微鏡下分離出左側(cè)皮層、紋狀體和海馬，隨后放入EP管，最后加入Cocktail、PMSF、RIPA和0.1%SDS抽提總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度后進(jìn)行電泳。電泳時用5%濃縮膠，12%分離膠。電壓首先用50V，待指示條帶越過濃縮膠后將電壓調(diào)制120V，指示帶到達(dá)分離膠底部時終止電泳，隨后取膠轉(zhuǎn)膜，半干轉(zhuǎn)13V 20min，用5%的脫脂牛奶常溫封閉1h，TBST×3次，每次15min，加入多克隆一抗（LC3Ⅱ：兔抗小鼠，1∶1000；β-actin：羊抗小鼠，1∶1000），4℃搖晃過夜，TBST×3次，每次15min，加入HRP偶聯(lián)的二抗（羊抗兔，1∶5000；兔抗羊，1∶5000）常溫下?lián)u晃1h，TBST×3次，每次15min，隨后在膜表面加入化學(xué)發(fā)光底物（1∶1混合），1min后在化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)中顯影。

2.5 再灌注后24h梗死體積計算及水腫率測定 再灌注后24h，過量麻醉處死小鼠，取腦組織切成2mm的冠狀腦片，共5片。將腦片放入2%的2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）中，37°C，孵育20min，置于4%多聚甲醛中；梗死部位顯現(xiàn)白色，而鮮紅色代表未缺血的部位，梗死面積=對側(cè)面積-同側(cè)未梗死面積，用Image J軟件分析，梗死體積計算：第一片和最后一片的體積按照圓錐體來算則V=2/3×（S+√S），中間部分則按梯形體來計算V=2/3×[Sn+S2+√（Sn+Sn+ 1）]，梗死總體積則將兩部分相加。水腫率計算公式[6]：水腫率=（梗死體積+同側(cè)未損傷體積-對側(cè)體積）× 100/對側(cè)體積（100%）。

3 實(shí)驗結(jié)果

3.1 腦缺血再灌注損傷后自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ表達(dá) 缺血再灌注組6、12、24、48h皮層、海馬和紋狀體LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)均有升高趨勢，其中皮層和海馬區(qū)LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白表達(dá)于24h升高最為明顯，與假手術(shù)組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而缺血再灌注組各個時間點(diǎn)紋狀體區(qū)LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ蛋白表達(dá)量與假手術(shù)對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 缺血再灌注后缺血側(cè)/左側(cè)腦組織LC3Ⅱ蛋白的表達(dá)。注：A：W estern blot檢測缺血再灌注后缺血側(cè)/左側(cè)腦組織皮層、海馬和紋狀體中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白的表達(dá)；B：與假手術(shù)組比較，缺血再灌注后皮層和海馬區(qū)域LC3Ⅱ/LC3Ⅰ在24h明顯升高，而在紋狀體中表達(dá)差異不明顯（n=6，*P＜0.05）；cortex：皮層；hippocampus：海馬；striatum：紋狀體；sham：假手術(shù)組。

3.2 缺血再灌注24h梗死體積、水腫率測定和神經(jīng)功能損傷評定 術(shù)前30min在左側(cè)側(cè)腦室注射2、10和50mM的自噬抑制劑3-MA 5uL，對照組注射相同體積生理鹽水。發(fā)現(xiàn)當(dāng)3-MA濃度為10mM時對缺血再灌注24h皮層和海馬LC3Ⅱ蛋白表達(dá)的抑制最為明顯（圖2C）；隨機(jī)將術(shù)前30min在左側(cè)側(cè)腦室注射10mM 5μL 3-MA的小鼠，于缺血再灌注24h后立即處死進(jìn)行TTC染色計算梗死體積和水腫率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與鹽水對照組比較，3-MA（10mM）組小鼠腦梗死體積明顯減少 [（26.72±1.53）mm3vs（51.80± 2.85）mm3，P＜0.001]，水腫率明顯降低[（7.82±0.75）% vs [16.55±4.47]%，P＜0.01]（圖2A-D）。

圖2 3-MA對于LC3Ⅱ表達(dá)及腦缺血再灌注損傷的影響注：側(cè)腦室定位注射10mM 3-MA 5μL能夠顯著減少缺血再灌注后24h皮層和海馬中的自噬水平（n=3，圖C）；對3-MA組和鹽水組進(jìn)行TTC染色（圖A），3-MA能夠顯著減少在灌注后24h梗死體積（圖 B）和水腫程度（n=6，**P＜0.01，***P＜0.001，圖D）；S：假手術(shù)組；I/R：缺血再灌注組；L：2mM 3-MA組；M：10mM 3-MA組；H：50mM 3-MA組

4 討 論

自噬包括宏觀自噬、微觀自噬和伴侶分子介導(dǎo)的自噬三種，其中后者與溶酶體的生理功能以及作用途徑都不相同[4，7]。一般認(rèn)為自噬即指宏觀自噬。

為了更好地了解自噬的不同的功能，Mizushima等將自噬分為“Induced自噬”和“Basal自噬”兩種[8-9]，前者主要是在饑餓的情況下產(chǎn)生氨基酸來維持細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)和存活，后者主要是對細(xì)胞質(zhì)的組分進(jìn)行更新。在酵母菌中，有31種自噬相關(guān)基因（Atg）參與自噬的調(diào)節(jié)，在這31種基因中，有18種基因參與自噬溶酶體的形成，被稱為AP-Atg蛋白[10]：包括Atg1-10、Atg12-14、Atg16-18、Atg29和Atg31。自噬的分子機(jī)制有高度保守性，在哺乳動物中這些基因的功能和在原核動物中相似。

目現(xiàn)有很多方法檢測自噬的活性，其中免疫印跡法測微管相關(guān)蛋白1輕鏈3（LC3）是最常用的檢測方法。LC3是與酵母菌中Atg8類似，是自噬體的標(biāo)志蛋白[11]。在合成后不久，在靠近C末端的甘氨酸殘基的部位LC3就會被Atg4B切斷變成細(xì)胞質(zhì)中的LC3Ⅰ[12]，在自噬激活的條件下LC3Ⅰ的C末端甘氨酸殘基連接上磷脂酰乙醇胺后轉(zhuǎn)變成細(xì)胞膜結(jié)合的LC3Ⅱ[11]。LC3的這種修飾受到泛素化樣連接系統(tǒng)的調(diào)控，其中Atg7和Atg3在這個過程中分別發(fā)揮著類似于E1和E2功能[13]，因此，在應(yīng)激情況下LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ的比值可以反映自噬被激活的程度。既往研究證實(shí)，在新生和成年鼠中，腦缺血損傷可以誘導(dǎo)海馬錐體神經(jīng)元自噬激活[14]。本實(shí)驗觀察發(fā)現(xiàn)，在缺血急性期，與假手術(shù)組相比小鼠的缺血側(cè)的海馬和皮層中的自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ在再灌注24h時明顯上調(diào)（P＜0.05），但在紋狀體中與假手術(shù)組相比無明顯差異（P＞0.05）。

自噬可以通過清除細(xì)胞內(nèi)損壞的細(xì)胞器、有毒的代謝產(chǎn)物和細(xì)胞內(nèi)病原體，并且在缺少營養(yǎng)時可以產(chǎn)生氨基酸和能量等來維持活體的機(jī)能，促進(jìn)細(xì)胞的存活[15]。在Atg7敲除的小鼠的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以發(fā)現(xiàn)皮層神經(jīng)元的缺失和軸突中泛素化聚集物的蓄積導(dǎo)致神經(jīng)元的變性、異常的神經(jīng)癥狀和死亡[16-17]，但是在Atg7敲除的小鼠中蛋白酶體功能是正常的，提示自噬功能的障礙可能參與神經(jīng)退行性疾病的過程。但是，過度的自噬往往降解重要的細(xì)胞組分，并且參與凋亡級聯(lián)反應(yīng)途徑促進(jìn)細(xì)胞死亡，近年研究發(fā)現(xiàn)在小鼠的缺血缺氧模型中，一些受損害的神經(jīng)元表現(xiàn)出自噬樣細(xì)胞死亡[18]。因此，推測自噬激活的特異性和程度可能決定細(xì)胞的命運(yùn)。本實(shí)驗結(jié)果顯示，3-MA通過影響PI3K的功能來阻斷自噬小泡的轉(zhuǎn)運(yùn)功能從而抑制自噬水平；與對照組相比，用3-MA下調(diào)缺血后自噬，腦組織缺血再灌注損傷減輕，提示自噬參與腦缺血再灌注的病理損傷過程。

［1］Klionsky DJ，Cuervo AM，Seglen PO.Methods formonitoring autophagy from yeast to human［J］.Autophagy，2007，3（3）：181-206.

［2］Dreux M，Chisari FV.Viruses and the autophagy machinery［J］.Cell Cycle，2010，9（7）：1295-1307.

［3］Virgin HW，Levine B，et al.Autophagy genes in immunity［J］.Nat Immunol，2009，10（5）：461-470.

［4］Klionsky DJ，Emr SD.Autophagy as a regulated pathway of cellular degradation［J］.Science，2000，290（549）：1717-1721.

［5］鄭超波，江靜雯，劉建榮.SIRT2對腦缺血再灌注損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究［J］.中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011， 28（11）：1002-1005.

［6］Hara H，Huang PL，Panahian N，etal.MoskowitzMA Re duced brain edema and infarction volume in mice lacking the neuronal isoform of nitric oxide synthase after transient MCA occlusion［J］.JCereb Blood Flow Metab，1996，16（4）：605-611.

［7］Massey AC，Zhang C，Cuervo AM，et al.Chaperone-mediat ed autophagy in aging and disease［J］.Curr Top Dev Biol，2006，73：205-235.

［8］Mizushima N.The pleiotropic role of autophagy:from protein metabolism to bactericide［J］.Cell Death DiVer 12（suppl 2），2005：1535-1541.

［9］Mizushima N.Autophagy：process and function［J］.Genes Dev，2007，21：2861-2873.

［10］Kabeya Y，Kawamata T，Suzuki K，et al.Cis1/Atg31 is required for autophagosome formation in Saccharomyces cerevisiae［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，356（2）：405-410.

［11］Kabeya Y，Mizushima N，Ueno T，et al.LC3，a mammalian homologue of yeast Apg8p，is localized in autophagosome membranes after processing［J］.EMBO J，2000，19（21）：5720-5728.

［12］Yoshimura K，Shibata M，Koike M，et al.Vects of RNA interference of Atg4B on the limited proteolysis of LC3 in PC12 cells and expression of Atg4B in various rat tissues［J］.Autophagy，2006，2（3）：200-208.

［13］Tanida I，Tanida-Miyake E，Ueno T，et al.The human homolog of Saccharomyces cerevisiae Apg7p is a Protein-activating enzyme for multiple substrates including human Apg12p，GATE-16，GABARAP，and MAP-LC3［J］.J Biol Chem，2001，276（3）：1701-1706.

［14］Adhami F，Liao G，Morozove M，et al.Cerebral ischemi a-hypoxia induces intravascular coagulation and autophagy［J］. Am JPathol，2006，169（2）：566-583.

［15］Cuervo AM.Autophagy:in sickness and in health［J］.Trends Cell Biol，2004，14（2）：70-77.

［16］Komatsu M，Waguri S，Ueno T，et al.Impairment of starvation-induced and constitutive autophagy in Atg7-deWcientmice［J］.JCell Biol，2005，169（3）：425-434.

［17］Komatsu M，Waguri S，Chiba T，et al.Loss of autophagy in the central nervous system causes neurodegeneration in mice［J］.Nature，2006，441（7095）：880-8844.

［18］Uchiyama Y，Koike M，Shibata M，et al.Autophagic neuron death in neonatal brain ischemia/hypoxia.Autophagy［J］. Autophagy，2008，129（4）：404-408.

（收稿：2014-12-06 修回：2015-04-08）

Effect of Autophagy Down-regulation by 3-methyladenine on Focal Ischem ia-Reperfusion Injury in M ice

ZHENG Chaobo,WU Jiong,LI Yaguo.Department of Neurology,Zhejiang Hospital,Hangzhou(310013),China

Objective To investigate the effect of autophagy on the brain of mice with focal ischemia-reperfusion（IR）injury.M ethods Fifty-four CD-1 mice were random ly divided into sham operation group（n=6）,IR group（n=24）,saline control group（n=9）,and 3-methyladenine group（n=15）.Every 6 mice in IR group were sacrificed at 6h,12h,24h,and 48h after reperfusion.T-MCAO model in mice was established with left middle cerebral suture occlusion.Saline control group was given 5μL saline.Mice from 3-methyladenine group was put on anesthesia and was injected 5μL 3-methyladenine at the concentrations of 2,10,and 50mM to left venticle with Hamilton syringe 30min before operation.The expression of LC3Ⅱprotein in the cortex,hippocampus and striatum were detected by western blot.TTC staining method was used to observe cerebral infarction area and edema in the brain of mice at 24h after reperfusion in 10mM 3-methyladenine group and saline control group.Results Comparing to sham operation group,the expression of LC3II/LC3 I protein in the cortex,hippocampus and striatum at 6,12,24, and 48h after reperfusion increased;the level of LC3II/LC3 I protein in the cortex and hippocampus at 24h after reperfusion was the highest and significantly different（P＜0.05）,but no significant difference in he level of LC3II/ LC3 I protein in the striatum was found at any time point between IR group and sham operation group（P＞0.05）. 3-methyladenine（10mM）group had smaller infarction area and lighter swelling than saline control group did（26.72±1.53mm3vs 51.80±2.85mm3,P＜0.001;7.82%±0.75%vs 16.55%±4.47%,P＜0.01）.Conclusion Down-regulation of autophagy plays an neuroprotective role in cerebral ischemia reperfusion injury.

mice;ischemia reperfusion;autophagy;3-methyladenine;LC3Ⅱ

浙江醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科（杭州 310013）

鄭超波，Tel：15168378038；E-mail：xingchenjing40123@163. com