二株不同基因型樹鼩呼腸孤病毒的分離和鑒定

劉建生，陶玉芬，李曉菲，李超Δ，李曉飛，孫曉梅，代解杰* ，劉紅旗*

(1.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所感染和免疫實驗室，云南 昆明 650118;2.中國醫學科學院/北京協和醫學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心，云南 昆明 650118)

哺乳動物呼腸孤病毒(mammalian reovirus，MRV)屬于呼腸孤病毒科呼腸孤病毒屬成員。MRV是無包膜雙鏈RNA(dsRNA)病毒，有雙層衣殼，呈20面體對稱結構，基因組由10條獨立離散的dsRNA組成。根據基因組電泳帶型分布，十個基因組片段分成L(大)、M(中)和S(小)三組，其中L組包括 L1，L2和 L3三個片段，M 組包括 M1、M2和 M3三個片段，S組包括 S1、S2、S3和S4四個片段。片段S1編碼蛋白sigma1［1］，盡管該蛋白在整個病毒粒子中僅僅含有24個分子，但由于其分布在病毒粒子的表面，因此具有很重要的作用，如:細胞受體的配體［2］、血凝素［3］、誘導中和抗體的產生［4］、決定組織噬性和毒力［5，6］、介導病毒粒子與細胞微管之間的結合［7］以及抑制宿主細胞 DNA的合成［8］等。該蛋白的另一個有趣的特征是，它是唯一一個與病毒血清型特異性有關的蛋白［9－11］，根據該蛋白可以將MRV分為3個明顯不同的血清型，而且編碼該蛋白的基因S1在進化中起重要作用。根據血清中和試驗和血凝抑制能力，呼腸病毒屬可分為3個血清型，其原型株分別為Ⅰ型 T1L、Ⅱ型 T2J、Ⅲ型T3D［12，13］。

MRV最早于1954年從健康兒童的糞便中分離得到［14］。迄今為止，MRV已在許多健康或發病的哺乳動物中發現，包括人、鼠、貓、犬、豬、牛、蝙蝠及樹鼩［15－22］等多種動物，通常情況下，該病毒能感染大多數哺乳動物，但一般僅在幼體感染者中引起疾?。?3］。猴腎細胞(Vero)是目前分離和培養該病毒最常用的細胞。

本研究在對實驗樹鼩腹瀉糞便樣本進行病毒分離培養過程中，同一樹鼩糞便樣品在不同細胞上分離獲得具有不同S1基因片段電泳帶型特征的病毒株，并以該樹鼩呼腸病毒分離株為材料，獲得了S1基因組片段的全長cDNA克隆并完成了序列測定，生物信息學分析，可確認該研究中實驗樹鼩混合感染了呼腸病毒I型和Ⅲ型病毒。

1 材料與方法

1.1 標本

實驗樹鼩腹瀉糞便樣本由中國醫學科學院醫學生物學研究所樹鼩種質資源中心采集提供。病毒保存在中國醫學科學院北京協和醫學院醫學生物學研究所感染與免疫學研究室。

1.2 病毒分離培養

用DMEM基礎培養基制備10%糞便懸液，6137 r/min離心20 min后，上清經0.22 μm濾膜過濾除菌，然后取200 μL濾液分別接種至6孔板中已長成致密單層的LLC－MK2、KMB17和Vero細胞，傳代適應培養至第3代，均產生明顯的細胞病變效應。收集細胞病毒培養物，－20℃保存備用。

1.3 病毒電鏡檢查

建立穩定的細胞－病毒培養體系后，分別收集培養上清和病毒感染的細胞進行透射電鏡檢查。培養上清直接鏡檢:取培養上清，3000 r/min離心20 min，棄沉淀;離心上清再經12000 r/min離心20 min，去上清，病毒沉淀經磷鎢酸負染后電鏡觀察。病毒感染細胞超薄切片透射電鏡觀察:收集病毒感染3～4 d的細胞，1500 r/min低速離心15 min，棄去上清，加入4℃預冷的2.5%戊二醛固定液1 mL，不沖散細胞團塊，進行超薄切片及透射電鏡檢查。

1.4 輪狀病毒檢測

按照A群輪狀病毒診斷試劑盒(膠體金法)(北京萬泰生物藥業有限公司)使用說明檢測病毒分離培養樣品。

1.5 病毒RNA提取

按Axygen Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit操作說明提取培養上清中病毒RNA。用60 μL無RNA酶的超純水重懸。保存于－80℃備用(用于RT－PCR 和 RNA－PAGE 電泳)。

1.6 病毒RNA電泳及硝酸銀染色

配制聚丙烯酰胺凝膠:10%分離膠和5%濃縮膠，病毒RNA上樣每孔15 μL，在1× TBE緩沖液中，于90 V電壓電泳9 h后進行硝酸銀染色分析。

1.7 引物設計及合成

依據呼腸病毒原型株T1L株(GenBank登錄號EF494445)，T2J株(GenBank登錄號 M10261)和T3D株(GenBank登錄號HM159619)，設計針對哺乳動物呼腸病毒基因組片段S1全長的引物(表1)。引物Invitrogen上海公司合成。

表1 呼腸病毒S1全長基因序列引物Tab.1 Primers used for RT－PCR of reovirus S1 complete sequences

1.8 病毒基因組S1節段全長基因RT-PCR擴增

RT－PCR試劑購自TaKaRa寶生物大連有限公司。RT反應:在PCR反應管中依次加入下列成分:病毒RNA模板5 μL，滅菌蒸餾水3 μL，下游特異引物 1 μL(20 μmol/L)，dNTP mix 1 μL(10 μmol/L)，混勻，65℃作用5 min，冰上急冷2 min;再加入5×PrimeScript buffer 4 μL，RNase inhibitor 0.5 μL，PrimeScript Transcriptase 1 μL，滅菌蒸餾水4.5 μL，混勻，42℃ 45 min，70℃ 15 min。PCR 反應采用25 μL體積體系，依次加入 TaKaRa Premix Taq 12.5 μL，上下游引物各1 μL(20 μmol/L)，病毒cDNA模板5 μL，滅菌超純水補足至25 μL。按如下反應程序擴增:94℃ 預變性 5 min;94℃ 30 s，55℃ 40 s，72℃1min 40 s，進行30個循環;72℃延伸10 min。取擴增產物5 μL，于1.0%瓊脂糖電泳分析。

1.9 病毒S1全長基因克隆

PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，將預期目的條帶膠回收，克隆到pMD－T載體，經藍白斑篩選，挑取陽性克隆菌落在氨芐抗性培養基中搖菌過夜，提取質粒。鑒定陽性的質粒交由上海生工生物工程有限公司序列測定。

1.10 生物信息學分析

通過MEGA6.0軟件中blast功能收集與本研究相關的序列，選擇具有S1基因片段全長的序列用于后續分析。根據Genbank的信息和發表的文獻所得到的信息，給每個分離株序列一個名稱:血清型/分離株/分離地點/分離年代－Genbank號(gi號)。通過MEGA6.0軟件中Maximum Likelihood方法繪制遺傳發生樹。

2 結果

2.1 腹瀉樹鼩糞便樣品能引起明顯的細胞病變

不同的病毒可能適應不同的細胞株，為了能夠盡可能多地分離到樹鼩腹瀉糞便中的病毒。我們將處理后的糞便樣品分別在 KMB17、Vero和 LLCMK2細胞上進行3次盲傳后，發現3個細胞系均出現了明顯的細胞病變(圖1)。

圖1 樹鼩糞便T28致3種細胞病變效應Fig.1 Cytopathic effects of the fecal sample T28 on the three cell lines

2.2 樹鼩病毒的電鏡檢查

為了確定細胞病變是由病毒感染所致，我們收集有細胞病變的細胞上清，濃縮，磷鎢酸負染后電鏡觀察病毒粒子形態。如圖2A所示，病毒粒子呈輪狀，具有雙層衣殼結構，直徑約為70 nm，具有呼腸孤病毒科的形態特征。感染了病毒的細胞電鏡檢查結果表明病毒主要在胞質內大量增殖(圖2B)。

2.3 輪狀病毒檢測

A群輪狀病毒是臨床引起腹瀉的一種主要輪狀病毒，而該病毒在形態和大小上與MRV非常相似。因此，我們用A群輪狀病毒特異性的試劑盒檢測有病變的細胞上清。結果顯示A型輪狀病毒陰性。

2.4 病毒RNA電泳及硝酸銀染色

呼腸孤病毒科的病毒基因組為分節段RNA，該家族成員的基因組RNA經PAGE電泳后，呈現出特異性的條帶模式。因此，我們用RNA電泳的方法對分離到的病毒進一步鑒定。結果發現，3種細胞分離到的病毒RNA都呈現出哺乳動物正呼腸孤病毒基因組3個L節段，3個M節段和4個S節段的特征性模式(見圖3A)。然而，我們發現，從3個細胞系中分離到的病毒基因組RNA的短片段S的S1節段表現出2種不同的遷移率，LLC－MK2和Vero細胞上擴增到的病毒S1節段遷移率較KMB17細胞上的病毒的快，這暗示該樹鼩糞便樣品中可能存在2種不同基因型的正呼腸孤病毒。

注:A.培養上清負染(1 cm=100 nm);B.細胞超薄切片(1 cm=2 μm)。圖2 病毒感染的KMB17細胞及其培養上清透射電鏡Note.A.Culture supernatant by negative staining，scale bar 1 cm=100 nm;B.Ultra－thin section of infected KMB17 cells，scale bar 1 cm=2 μm.Fig.2 The viral particles in culture supernatant and in the cytoplasm of infected KMB17 cells revealed by transmission electron microscopy

2.5 病毒S1全長基因RT-PCR擴增

為了進一步確定分離到的病毒的基因型，根據已報道的型特異性S1基因節段序列設計了分別針對I、II和III型病毒的特異性引物，對病毒基因組RNA進行RT－PCR擴增。結果發現，只有I和III型特異性引物能擴增出預期大小的片段，未見II引物擴增出的產物(圖3B)。與RNA的電泳結果類似，LLC－MK2和Vero細胞上擴增到的病毒RNA只有Ⅲ型引物能擴增得到預期大小的目的片段，且二者的大小一致;而KMB17細胞上擴增得到的病毒RNA只有I型引物能擴增得到預期大小的片段(圖3B)。這一結果不僅表明了我們從樹鼩中分離到了呼腸孤病毒，而且可能存在2種不同基因型。

2.6 樹鼩呼腸病毒S1全長基因序列分析

為進一步研究分離到的樹鼩呼腸孤病毒與已報道的呼腸孤病毒之間的遺傳關系，我們對擴增得到的S1全長基因進行克隆、測序和序列分析。結果表明，KMB17培養上清中，通過I型引物能擴增得到全長1463 bp的血清型別特異性S1基因片段，比對結果表明，該序列與GenBank中哺乳動物呼腸病毒I型原型株T1L(EF494445)同源性最高，核苷酸序列同源性為85%，氨基酸序列同源性為90%，因此將該病毒定型為樹鼩呼腸孤病毒I型，命名T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013 (GenBank，登 錄 號KP185123)。LLC－MK2和Vero細胞上清中的病毒，通過III型引物能擴增得到1416 bp的S1全長基因，比對結果表明，這兩株適應培養病毒S1基因完全同源，與GenBank庫中哺乳動物呼腸孤病毒Ⅲ型原型株T3D(HM159619)核苷酸同源性為85%，氨基酸同源性為92%，因此該病毒定型為樹鼩呼腸孤病毒III型，分別命名 T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013(Gen－Bank，登錄號 KP185124)和 T3/T28－3/Tupaia/Kunming/2013(GenBank，登錄號 KP185124)。

注:A.病毒基因組RNA聚丙烯酰胺凝膠電泳;B.病毒基因組S1片段RT－PCR分析。圖3 樹鼩糞便樣品T28細胞培養上清病毒基因組分析Note.A.RNA PAGE analysis of viral genomes;B.RT－PCR analysis of genomic S1 fragment of virusesFig.3 Genomic analysis of viruses in the supernatant of Tupaia fecal sample T28－inoculated cells.

采用Maximum Likelihood方法，對本研究獲得的2株病毒的S1節段基因序列分別與GenBank中具有全長S1基因序列的哺乳動物呼腸病毒I型和III型病毒進行遺傳進化分析。結果表明，我們分離到的I型病毒株T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013單獨成簇，與T1L原型株和中國2011年雪貂分離株的關系較近，而與2011年中國豬源分離株SHR－A遺傳距離相對遠一些(圖4A)。III型病毒S1基因片段可以明顯地分2個大組，第一組(GI)分別由美國分離株(GIa)和亞洲分離株(GIb)組成，第二組(GII)的病毒全部來自歐洲。我們分離到的III型病毒株T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013雖然與亞洲的其他分離株形成了明顯的一簇，但它也單獨形成一個進化分支(圖4B)。這些結果表明我們分離到的2株不同基因型的MRV均已進化適應了樹鼩宿主。

注:A.I型病毒;B.III型病毒;代表本研究的分離株。圖4 呼腸病毒S1基因全長核苷酸序列的種系進化分析Note.A.Serotype I;B.Serotype III;Represents viruses isolated in this study.Fig.4 Phylogenetic trees based on full length of S1 nucleotide sequences of mammalian orthoreovirus

3 討論

本研究通過 KMB17、Vero和 LLC－MK2三種不同的細胞系對一個腹瀉樹鼩的糞便樣品進行病毒分離，結果發現3個細胞均表現不同程度的細胞病變。經透射電子顯微鏡觀察、病毒基因組RNA PAGE電泳和病毒基因組S1片段的序列分析，證實我們從腹瀉樹鼩的糞便樣品中分離到的是I型和III型哺乳動物正呼腸孤病毒。

細胞是病毒分離的常用工具，不同的細胞適合分離不同類型的病毒。Vero細胞適于多種病毒的分離，包括:正呼腸孤病毒、輪狀病毒、腸道病毒等。另外，同一病毒在不同細胞中復制情況可能不一樣。以前報道顯示通過Vero細胞從樹鼩糞便樣品中分離到正呼腸孤病毒［21］。多種病毒可以引起腹瀉性疾病，為了弄清可能引起樹鼩腹瀉的病毒，我們采用了3個常用于病毒分離的細胞系KMB17、Vero和LLC－MK2對糞便樣品里的病毒進行擴增和鑒定，發現了2種基因型正呼腸孤病毒存在于樹鼩的腹瀉樣品中，其中I型分離株T1/T28－1/Tupaia/Kunming/2013能在KBM17細胞上適應增殖，而III型分離株T3/T28－2/Tupaia/Kunming/2013則能在 Vero、LLC－MK2細胞上適應增殖。KMB17細胞為人胚肺二倍體成纖維細胞，而Vero細胞為非洲綠猴腎上皮細胞，LLC－MK2為獼猴腎上皮細胞，這對以后通過組織培養進行哺乳動物呼腸病毒分離鑒定和選用適宜的細胞具有指導借鑒意義。

血清中和試驗和血凝抑制試驗是對哺乳動物呼腸孤病毒I型、II型和III型進行血清型別鑒定的傳統實驗方法。我們參考相關文獻設計引物擴增了哺乳動物呼腸病毒型特異性抗原的編碼基因S1片段全長，并通過克隆、測序及核苷酸同源性分析，發現我們分離到的病毒株為哺乳動物呼腸孤I型和III型病毒。因為S1蛋白是唯一一個與病毒血清型特異性有關的蛋白［9－11］，所以本研究 RT－PCR 方法對于樹鼩MRV的血清型鑒定起非常重要的作用。

S1基因片段有2個 ORFs，編碼黏附蛋白 σ1和非結構蛋白 σ1s。σ1蛋白呈纖維狀，其球狀頭部有兩個獨立的細胞表面受體結合區域，分別為連接粘附分子結合域和唾液酸分子結合域［23］。σ1蛋白是病毒黏附蛋白，介導病毒對宿主細胞的入侵。σ1蛋白的這兩個結合域，在不同毒株之間的分布和結構不同。本實驗研究中，I型毒株與III型毒株之間σ1蛋白氨基酸同源性僅為27%，而 I型毒株在KMB17人二倍體成纖維細胞上有選擇性的適應生長，III型毒株則在Vero、LLC－MK2猴腎上皮細胞上適應生長，可能與它們的S1基因所編碼的σ1病毒黏附蛋白的結構及細胞表面受體特征有關，有待進一步的研究。

呼腸孤病毒S1基因片段與病毒的血清型密切相關，本研究通過BLAST找到了12株已知的I型病毒S1基因全長序列，分析發現我們的分離株與我國最近報道從雪貂分離到的3株病毒以及T1L型原型株關系較近，而與中國的豬分離株關系相對較遠一些。然而由于I型病毒的S1基因片段序列的數目較少，不能發現各個分離株之間明顯的關系。

綜上所述，本研究首次通過多種細胞對腹瀉樹鼩的糞便樣品進行病毒的分離和鑒定，并且同時獲得了I型和III型的正呼腸孤病毒，這些結果一方面為診斷樹鼩的腹瀉提供了強有力的證據，然而確定哪型病毒與樹鼩的腹瀉有關，還需要更深入的研究，另一方面對于將來通過細胞培養分離鑒定正呼腸孤病毒時細胞的選擇有很好的指導作用。

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