溶血致新生大鼠高膽紅素血癥動物模型的建立及評價

楊李，王寶田，田克印，吳德，唐久來

(安徽醫科大學第一附屬醫院兒科，合肥 230022)

新生兒高膽紅素血癥是新生兒時期最為常見的疾病，膽紅素具有神經毒性，輕度升高，即可導致患兒神經系統損傷，達到一定濃度時，可發生核黃疸，導致聽覺障礙、腦性癱瘓，智力低下等嚴重后遺癥［1］。目前高膽紅素動物模型常見的有靜脈注射膽紅素溶液、或利用基因缺陷動物模型Gunn鼠建立高膽紅素血癥模型，或利用磺胺類藥物促使腦組織膽紅素濃度升高［2－3］;然而，上述模型并非溶血導致黃疸，結合新生兒高膽紅素血癥發病機制，并沒有良好的模擬作用，本研究通過腹腔梯度注射鹽酸苯肼，建立溶血致高膽紅素血癥模型，并測定血、腦組織膽紅素、NSE等水平，對模型進行評價。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

選擇7日齡清潔級SD大鼠60只，體重19～22 g，其中雄性28只，雌性32只，由安徽省實驗動物中心【SCXK(皖)2011－002】提供。

1.2 材料

鹽酸苯肼 (phenylhydrazine hydrochloride)(阿拉丁公司，中國)。鹽酸苯肼溶液配制［4］:避光稱取鹽酸苯肼0.5 g，溶于50 mL滅菌注射用生理鹽水中，配制成1%的鹽酸苯肼溶液;鹽酸苯肼0.75 g，溶于50 mL滅菌注射用生理鹽水中，配制成1.5%的鹽酸苯肼溶液;鹽酸苯肼0.25 g，溶于50 mL滅菌注射用生理鹽水中，配制成0.5%的鹽酸苯肼溶液。為保證在不同注射劑量下，注射總液體量相同，以上試劑均用0.22 μm過濾頭過濾除菌。

1.3 動物模型的分組及建立

隨機分為4組，每組15只，分別以25、50、75 mg/kg三種濃度腹腔注射鹽酸苯肼，作為實驗1、2、3組;對照組按體重注射等量滅菌注射生理鹽水，均連續兩天同一時間進行注射。按實驗動物使用的3R原則給予人道關懷。

1.3 實驗方法及評價

建模48 h后實驗組和對照組動物均安樂死，取頸內靜脈和頸總動脈約0.5～0.75 mL血;Roche COBAS INTEGRA 800全自動生化分析儀測定血清總膽紅素和NSE水平，Abbott Cell－Dyn 3200血細胞分析測定全血血紅蛋白水平;同時機械剝離實驗動物腦組織，稱重后10倍體積冰醋酸制成均漿等體積，丙酮抽提，同樣采用生化儀測定腦組織膽紅素濃度。

1.4 統計學處理方法

2 結果

2.1 動物模型一般情況觀察

實驗組2和實驗組3，在建立模型后陸續出現皮膚灰暗、呼吸急促、活動減少、攝食次數減少和尿色變深的情況，其中實驗組2中的1只動物、實驗組3中的2只動物在實驗過程中死亡，但至取材尚未出現自發性出血現象;實驗1組出現活動、攝食減少，尿色輕度變深，皮膚灰暗現象較實驗2、3組輕。腹腔注射生理鹽水對照組尚未出現上述情況，且無死亡情況發生。

2.2 血和腦組織膽紅素及血紅蛋白水平測定

與空白對照組相比，腹腔注射鹽酸苯肼的3個不同劑量的實驗組血清總膽紅素、腦組織的膽紅素水平顯著升高(P＜0.05)，實驗組2和實驗組3的膽紅素水平均大于實驗組1(P＜0.05)，而實驗組2和實驗組3之間差異無顯著性(P＞0.05);3個實驗組的血紅蛋白水平均低于對照組(P＜0.05);實驗組2和實驗組3血紅蛋白水平均小于實驗組1(P＜0.05)，實驗組2和實驗組3相比差異無顯著性(P＞0.05)。見表1。

2.3 血清神經特異性烯醇化酶

與空白對照組相比，腹腔注射鹽酸苯肼的3個不同劑量的實驗組血清神經特異性烯醇化酶(NSE)顯著升高(P＜0.05)，實驗組2和實驗組3的NSE水平均大于實驗組1(P＜0.05)，而實驗組2和實驗組3之間差異無顯著性(P＞0.05)。見表2。

表1 血和腦組織膽紅素水平和血紅蛋白測定()Tab.1 Measurement of brain tissue and blood bilirubin，and hemoglobin concentrations

表1 血和腦組織膽紅素水平和血紅蛋白測定()Tab.1 Measurement of brain tissue and blood bilirubin，and hemoglobin concentrations

注:＊△#:三組實驗組和對照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，實驗1組和實驗2、3組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，實驗2、3組間差異無顯著性(P＞0.05)。Note.＊△#:There was a significant difference between the three experimental groups and the control group(P ＜0.05).There was a significant difference between experimental group 1 and experimental groups 2 and 3(P＜0.05).There was no significant difference between experimental groups 1and 2(P＞0.05).

腦組織膽紅素△Brain tissue bilirubin/nmol/g組別Groups血清膽紅素*Serum bilirubin/μmol/L 2.8±0.56 0.10±0.04 137.8±11.6血紅蛋白#Hemoglobin/g/L Experimental group 1實驗組1(n=15) 31.5±5.8 5.25±0.41 61.5±8.1 Experimental group 2實驗組2(n=14) 61.1±5.7 14.8±0.49 40.5±3.2 Experimental group 3實驗組3(n=13) 63.1±7.0 14.91±0.51 41.2±2.6 Control group對照組(n=15)

表2 血清神經特異性烯醇化酶測定()Tab.2 Measurement of serum NSE

表2 血清神經特異性烯醇化酶測定()Tab.2 Measurement of serum NSE

注*:三組實驗組和對照組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，實驗1組和實驗2、3組相比差異具有顯著性(P＜0.05)，實驗2、3組相比差異無顯著性(P＞0.05)。Note. ＊△#:There was a significant difference between the three experimental groups and control group(P＜0.05).There was a significant difference between experimental group 1 and experimental groups 2 and 3(P＜0.05).There was no significant difference between experimental groups 1 and 2(P＞0.05).

組別Groups 血清神經特異性烯醇化酶*/ng/mL Serum NSE

3 討論

動物模型應盡可能模擬出疾病的特點及病理生理機制。國內學者采用不同劑量膽紅素聯合脂多糖頸靜脈注7日SD齡大鼠方式建立動物模型，結果顯示模型出現不同程度的皮膚黃染，1 h后皮膚黃染均出現減退，提示膽紅素在體內存留時間過短，不能模擬高膽紅素持續損害的過程［5］。王曉麗等［6］以3日齡 SD新生大鼠為對象，進行連續6次膽紅素注射，從而建立相對穩定的高膽紅素血癥模型，但是靜脈置管方法對新生鼠操作難度相對較大。現較多采用的是腹腔注射膽紅素建模方法［7］，具有操作簡便，建模成功率高特點，但存在膽紅素腹腔吸收入血濃度不穩定，血清膽紅素濃度偏低問題，同靜脈注射方法存在共同的缺點是均不能良好的模擬新生兒高膽紅素血癥是紅細胞破壞增加的致病原因。Gunn大鼠多被用于開展對遺傳性葡萄糖醛酸轉移酶缺陷的模型研究，其血液中膽紅素的濃度達不到核黃疸的程度，因此，有研究應用磺胺類藥物通過置換結合膽紅素方法，加強了膽紅素對腦的損害作用［8］，或采用腹腔注射鹽酸苯肼的方法，誘發溶血來增加膽紅素水平濃度［9］，但是此類研究動物模型成本較高，且基因缺陷是否造成免疫系統缺陷尚不明確。有報道采用新生大鼠小腦延髓池注射膽紅素溶液的方法制作膽紅素腦病的動物模型，該方法雖受血腦屏障功能狀態的影響較小，可更直接地研究膽紅素的神經毒性。但是對新生大鼠小腦延髓池注射本身即對中樞神經系統是一種外傷性損害，操作難度較大，易誘發出血損傷，動物建模成功率較低［10］。

目前采用鹽酸苯肼或乙酰苯肼建立的溶血動物模型多是采用成年大鼠或其他成年動物，腹腔注射濃度報道也多不一致，從40 mg/kg到75 mg/kg均有報道［3，11］，對7日齡溶血致高膽紅素血癥的研究國內外較少。本研究采用25、50、75 mg/kg三種梯度的鹽酸苯肼腹腔注射7日齡大鼠，結果發現:三實驗組均出現溶血，與對照組相比較血、腦組織膽紅素水平和NSE均大于對照組，差異具有顯著性(P＜0.05)，而血紅蛋白含量均小于對照組，差異具有顯著性(P＜0.05);其中，50 mg和75 mg劑量組的腦、血膽紅素水平均大于25 mg劑量組(P＜0.05)，50 mg/kg和75 mg/kg劑量腹腔注射組相比各項指標差異無顯著性(P＞0.05)，提示50 mg/kg濃度已達溶血高峰，隨著鹽酸苯肼的濃度增高并未出現溶血增加;腹腔注射鹽酸苯肼誘發溶血，其機制是進入腹腔后吸收入血，能迅速與Hb形成MHb并生成海因茲(Heinz)小體，海因茲小體沉積在細胞膜上，使其流動性下降，滲透性增加，其并可裂解部分細胞膜功能，導致溶血發生，而鹽酸苯肼本身并無明顯神經毒性，故能較好的模擬新生兒溶血致高膽紅素血癥病理生理過程，尤其研究對中樞神經系統的損傷研究［12］。

模型鑒定中檢測的血清標志物神經特異性烯醇化酶(NSE)和神經細胞的分化和成熟有關，其特異性地存在于神經元和神經內分泌細胞中，腦組織缺氧缺血時神經元細胞可發生變性壞死，同時其血腦屏障通透性增加，NSE可釋放到血和腦脊液中，因此NSE可判斷神經元損傷的程度和對預后的估計，且具有較高的特異性，可作為模型鑒定的指標之一［13］。本研究中50 mg/kg和75 mg/kg劑量組的腦組織NSE水平均大于對照組及25mg劑量組(P＜0.05)，50mg和75mg劑量腹腔注射組相比NSE指標差異無顯著性(P＞0.05)，隨著鹽酸苯肼的濃度增高并未出現腦組織NSE增加，提示NSE與溶血性黃疸致神經系統損傷程度呈正相關，與鹽酸苯肼水平無明顯相關性。

綜上所述，本實驗選取7日齡大鼠腹腔內注射鹽酸苯肼的方法能夠制作出模擬臨床病理生理過程的高膽紅素血癥動物模型，其中50 mg/kg鹽酸苯肼是較為合適的建模濃度，從而建立理想的高膽紅素動物模型，為開展高膽紅素血癥致核黃疸及相關神經損傷機制研究提供實驗平臺。

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