環磷酰胺致大鼠免疫抑制和免疫亢進模型的建立與評價

張俊，Yong－Seong Shin，胡安君，杜芳芳，李永亮，王學兵，，張紅英，*

(1.河南農業大學牧醫工程學院，鄭州 450000;2.河南省動物性食品安全重點實驗室，鄭州 450000)

抗癌藥環磷酰胺(cyclophosphamide，Cy)是臨床上廣泛應用的烷化劑類化療藥物之一，由于其高度且廣譜的細胞毒性作用，除了用于治療急慢性白血病、多發性骨髓瘤、惡性淋巴瘤，也常常被用作免疫抑制藥，例如在骨髓移植時的免疫抑制治療以及治療一些自身免疫性疾病［1－2］。但是研究表明，環磷酰胺作用于機體的機制是相當復雜的，往往不同劑量，不同作用時間，會引起機體免疫抑制和免疫亢進兩種不同結果［3－4］。現有文獻報道的免疫抑制模型的建立方法，有一次性大劑量(100或150 mg/kg)注射 Cy［5－7］和多次小劑量(20、40 mg/kg 或 80 mg/kg)給藥［8－11］兩種方式，但藥物的使用劑量和次數也各有差異。Cy不同劑量和給藥方式對機體的免疫指標影響到底如何，未見有系統研究。本實驗擬通過不同的給藥時間和劑量比較，建立大鼠的免疫抑制和免疫亢進模型，并通過對第7天和第15天大鼠的免疫學和血液學指標的分析，確定建立大鼠免疫模型的最佳劑量和給藥方式，為臨床藥物篩選動物模型建立提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

注射用環磷酰胺，美國Baxter公司，購于鄭州大學第一附屬醫院;RPMI－1640培養基(Gibco);ConA，Sigma公司產品;雞卵清白蛋白(ovalbumin，OVA)，Solarbio 公司產品;CCK－8 日本同仁;YAC－1細胞(ATCC，B04005，購自上海復祥生物科技有限公司);大鼠OVA－sIgG抗體檢測試劑盒，卡爾文生物科技進口分裝試劑盒;Drewe大鼠IL－6預包被ELISA檢測試劑盒;Drewe大鼠 TNF－α預包被ELISA檢測試劑盒。

1.2 儀器

酶聯免疫檢測儀(FC 型，Thermo)，BC－2800Vet Mindray血液全自動分析。

1.3 動物分組與處理

SPF級SD大鼠64只，體重(120±20)g，雌雄不拘，購自河南省實驗動物中心【SCXK(豫)2010－0002】，實驗于河南省中醫學院進行【SYXK(豫)2010－0001】，實驗動物隨機分為A、B、C三組，A 組為對照組，B組又分為B1、B2、B3三個小組，C組分為C1、C2、C3、C4四個小組，每組各8只。各組均腹腔注射10%OVA 1 mL進行免疫。B組在注射OVA后6 h腹腔注射Cy，各組劑量分別為:B1組125 mg/kg，一次注射;B2組100 mg/kg，一次注射;B3組每日40 mg/kg，每天一次連續3 d。C組在免疫OVA前3 d腹腔注射Cy，每日劑量分別為:C1組225 mg/kg;C2組80 mg/kg;C3組20 mg/kg;C4組5 mg/kg，連續3d。對照組注射等量生理鹽水。

1.4 血液學指標檢測

OVA免疫后第7天和第15天大鼠尾靜脈采血，血液全自動分析儀對大鼠血液進行分析。

1.5 免疫學指標檢測

1.5.1 免疫器官指數的測定

SD大鼠OVA免疫后第7天和第15天各組分別處死4只，取脾臟和胸腺，剔除脂肪，稱重，按公式計算免疫器官指數:免疫器官指數(mg/g)=臟器質量(mg)/體重(g)。

1.5.2 淋巴細胞轉化實驗

免疫后第7天和第15天處死大鼠后，無菌取脾臟，PBS洗兩遍，后置于含有5mL PBS的滅菌平皿中，在200目不銹鋼網上研磨并過篩制成單細胞懸液。收集細胞懸液于滅菌離心管中，1200 r/min離心6min，棄上清。加入10倍體積的 Tris－NH4Cl，混勻，并于37℃放置5 min，使紅細胞充分裂解后，1200 r/min離心6 min，棄上清。用PBS洗細胞兩次后，用含10%胎牛血清的1640完全培養液洗細胞一次，然后用1640完全培養液重懸細胞，調整細胞濃度為2×106個/mL。將上述細胞懸液加入96孔板中，每孔200 μL，每組6個重復，同時每孔加入20 μL ConA，使其終濃度為5μg/mL。37℃ 5%CO2培養箱中培養48 h，于培養結束前3 h，每孔加CCK－8試劑20 μL，并用酶標儀檢測各孔A450nm吸光度。

1.5.3 NK細胞活性檢測

淋巴細胞懸液的制備同1.5.2，制備的淋巴細胞作為效應細胞;取培養24h并處在對數生長期的YAC－1細胞作為靶細胞，用1640完全培養液洗細胞兩次，0.5%臺盼蘭染色檢測細胞活性大于95%，調整細胞濃度，使其與效應細胞比值為1∶20。96孔板每孔加效應細胞和靶細胞各100 μL，同時設效應細胞對照孔和靶細胞對照孔，每組6個重復，37℃ 5%CO2培養箱中培養4h，每孔加 CCK－8 試劑20 μL，繼續培養3 h后，酶標儀檢測各孔A450nm吸光度。NK細胞活性計算公式:NK細胞活性%=［1－(A實驗孔 －A效應孔)/A靶細胞］×100%

1.5.4 OVA抗體檢測(ELISA法)

免疫后第7天和第15天，大鼠眼球采血，37℃溫箱至血清析出，2500 r/min，離心10 min后小心抽取上清液，按試劑盒說明檢測各組血清OVA抗體水平。

1.5.5 IL－6和TNF－含量的檢測(ELISA法)

免疫后第7天和第15天，大鼠眼球采血，分離血清，按試劑盒說明檢測各組血清IL－6和TNF－α含量。

1.5.6 各組免疫指標綜合得分

檢測的免疫指標顯著高于對照組按1分計算，顯著低于對照組按－1分計算，與對照組差異不顯著按0分計算，各指標得分相加為各組的免疫指標綜合得分。

1.6 數據處理和統計學分析

采用SPSS 18.0統計分析軟件處理，數據以均數±標準差表示，組間比較采用方差分析統計分析，P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

2.1 不同處理Cy對大鼠免疫器官指數的影響

B組(免疫OVA后當天注射不同劑量Cy)與對照組相比，在第7天，大鼠脾臟和胸腺指數均顯著降低;第15天，脾臟指數又顯著升高，胸腺指數各組差異無顯著性。

C組(免疫OVA前3d注射不同劑量Cy)與對照組相比，第7天，C2和C3兩組脾臟指數明顯升高，而C2組胸腺指數卻明顯下降，C1組脾臟和胸腺指數顯著降低;第15天，C1和C4組脾臟指數明顯增高，而胸腺指數明顯降低。結果見表1。

2.2 不同處理Cy對大鼠血液學指標的影響

B組(免疫OVA后當天注射不同劑量Cy組)與對照組相比，在第7天，大鼠外周血白細胞(WBC)和血小板(PLT)數量顯著下降，紅細胞數量無差異;第15天B3組白細胞數量顯著增多，B1和B2組白細胞數目恢復正常，血小板數目各組明顯升高，紅細胞數量呈現降低趨勢。

C組(免疫OVA前3d注射Cy)與對照組相比，在第7天，C2和C4組白細胞數和血小板數量明顯升高，各組紅細胞數均有升高趨勢;第15天各組白細胞和紅細胞數均恢復正常，血小板數，除C3組外均顯著高于對照組。結果見表2。

表1 不同Cy處理對大鼠臟器指數的影響()Tab.1 Effect of different cyclophosphamide treatment on the rat organ indexes()

表1 不同Cy處理對大鼠臟器指數的影響()Tab.1 Effect of different cyclophosphamide treatment on the rat organ indexes()

注:同列數據肩標相同字母表示差異無顯著性(P＞0.05)，肩標不同字母表示差異有顯著性(P＜0.05)。下同。Note.The same letters in the same row mean no significant difference(P＞0.05)，different letters mean significant difference(P＜0.05).The same as below.

組別 免疫后第7天Groups胸腺指數Thymus index A 3.54±0.55b 3.12±0.35A 2.49±0.21a 3.14±0.74A B1 1.49±0.20a 1.47±0.34BC 6.24±0.83b 2.55±0.33AB B2 1.89±0.74a 1.49±0.26BC 6.39±1.18b 2.72±0.31AB B3 1.67±0.148a 0.67±0.09D 7.75±0.68c 2.81±0.11AB C1 1.97±0.37a 0.72±0.11D 4.91±1.16d 2.32±0.40B C2 6.75±0.33d 2.04±0.23B 2.93±0.15a 2.92±0.30AB C3 4.49±0.14c 3.21±0.57A 2.51±0.16a 2.93±0.33AB C4 3.62±0.47b 3.16±0.77A 7.75±0.68c 2.35±0.157days after immunization 免疫后第15天15 days after immunization脾臟指數Spleen index胸腺指數Thymus index脾臟指數Spleen index B

表2 不同Cy處理對大鼠血液學指標的影響()Tab.2 Effect of different cyclophosphamide treatments on the rat hematologic indexes()

表2 不同Cy處理對大鼠血液學指標的影響()Tab.2 Effect of different cyclophosphamide treatments on the rat hematologic indexes()

注:*表示同列數據中與對照組(A)相比，差異有顯著性(P＜0.05)，下同。Note.*means significant difference(P＜0.05)compared with the control group(A)in the same row.

組別 免疫后第7天Groups 7days after immunization 免疫后第15天15 days after immunization WBC(109/L) RBC(1012/L) PLT(109/L) WBC(109/L) RBC(1012/L) PLT(109/L)A 4.80±0.85b 3.69±0.27BC 414.75±108.10 11.30±0.79a 5.32±0.44AB 590.25±56.05 B1 0.28±0.15a 3.14±0.12AB 67.25±12.53* 12.60±1.84a 2.41±0.45D 1615.50±54.45*B2 0.30±0.082a 4.05±0.98CD 96.33±7.51* 10.00±0.85a 4.60±0.32B 1224.67±75.87*B3 0.87±0.15a 4.4±0.30CD 140.00±24.04* 27.93±10.34b 3.40±0.75C 870.00±203.58*C1 0.88±0.94a 2.52±0.49A 38.00±11.43* 18.10±5.17a 4.27±0.72BC 1349.67±236.58*C2 12±2.10d 3.95±0.45BCD 667.33±214.65* 10.47±1.40a 5.89±0.26A 1062.33±195.15*C3 6.27±1.92bc 4.73±0.45D 286.67±55.08 11.63±1.46a 5.25±0.89AB 825.00±63.51 C4 7.23±1.19c 5.75±0.24E 547.67±74.65* 11.67±0.90a 6.31±0.72A 955.67±172.26*

2.3 不同處理Cy對大鼠淋巴細胞轉化的影響

B組(免疫OVA后當天注射不同劑量Cy組)與對照組相比，在第7天，淋巴細胞轉化能力無差異;第15天，B1組淋巴細胞轉化能力顯著低于對照組，而B2組淋巴細胞轉化能力顯著高于對照組。

C組(免疫OVA前3d注射Cy)與對照組相比，在第7天，C2組淋巴細胞轉化能力顯著升高，其他各組差異不顯著;第15天，C2組淋巴細胞轉化能力顯著下降，C1和C3組淋巴細胞轉化能力顯著升高。結果見表3。

2.4 不同處理Cy對大鼠NK細胞活性的影響

B組(免疫OVA后當天注射不同劑量Cy組)與對照組相比，在第7天，B1、B2、B3組NK細胞活性均降低，但差異無顯著性;在第15天，B1、B2、B3各組NK細胞活性均顯著升高。C組(免疫OVA前3d注射Cy)與對照組相比，在第7天，C3組的NK細胞活性顯著高于對照組，然而C1組顯著低于對照組，在第15天，C1組NK細胞活性較對照組升高，C2、C3和C4組NK細胞活性與對照組相比變化不大。結果見表3。

2.5 不同處理Cy對大鼠OVA抗體生成的影響

與對照組相比，第7天，C3和C4兩組抗體水平顯著高于對照組，其余各處理組差異無顯著性;第15天，C1組抗體水平顯著低于對照組，其他各組抗體水平雖都低于對照組，但差異無顯著性。B組與對照組無差異，結果見表3。

2.6 不同處理Cy對大鼠IL-6生成的影響

B組(免疫OVA后當天注射不同劑量Cy組)與對照組相比，在第7天，各組大鼠血清IL－6的含量降低，B1、B2組差異有顯著性;第15天時，各組雖仍低于對照組，但有恢復趨勢，B2組差異有顯著性。

C組(免疫OVA前3d注射Cy)與對照組相比，第7天，C1組IL－6含量顯著低于對照組;第15天，B2組顯著降低，其余各組IL－6含量差異均不顯著。結果見表4。

表3 不同Cy處理對大鼠免疫功能的影響()Tab.3 Effect of different cyclophosphamide treatments on the rat immune function()

表3 不同Cy處理對大鼠免疫功能的影響()Tab.3 Effect of different cyclophosphamide treatments on the rat immune function()

免疫后第7天7 d after immunization 免疫后15天15 d after immunization組別Groups抗體IgG/ng/mL Levels of IgG antibody A 0.20±0.018AB 31.58±0.78bc 429.25±13.78 0.23±0.004C 35.10±2.01ab 301.43±7.07 B1 0.18±0.049A 26.71±0.58ab 509.00±7.07 0.19±0.014AB 50.72±8.93cd 279.52±13.09 B2 0.19±0.005AB 28.08±1.28b 526.17±7.25 0.30±0.023D 48.38±9.11cd 268.93±29.80 B3 0.18±0.008A 26.93±0.96ab 429.83±154.07 0.21±0.020BC 52.19±3.32d 264.46±19.95 C1 0.16±0.061A 21.02±3.12a 543.83±67.78 0.45±0.039F 53.96±6.04d 249.05±33.60*C2 0.28±0.008C 37.44±6.61cd 491.17±39.03 0.15±0.030A 26.27±6.45a 260.60±16.54 C3 0.20±0.004AB 39.59±1.42d 616.75±85.21* 0.34±0.038E 28.62±1.82a 257.62±21.45 C4 0.23±0.01B 37.05±4.56cd 593.33±39.12* 0.25±0.046C 39.80±0.68bc淋巴細胞(A450)Lymphocyte proliferation NK細胞/%Activity of the NK cells抗體IgG/ng/mL Levels of IgG antibody淋巴細胞(A450)Lymphocyte proliferation NK細胞/%Activity of the NK cells 284.88±13.77

表4 不同處理環磷酰胺對大鼠血清細胞因子含量的影響(，pg/mL)Tab.4 Effect of different cyclophosphsamide treatments on levels of serum cytokines in the rats(，pg/mL)

表4 不同處理環磷酰胺對大鼠血清細胞因子含量的影響(，pg/mL)Tab.4 Effect of different cyclophosphsamide treatments on levels of serum cytokines in the rats(，pg/mL)

組別521.5±30.69ab 31.6±2.14AB 560.33±26.90a 17.39±2.17A B1 410.67±38.11c 32.05±1.24A 461.7±27.86ab 15.19±1.08A B2 387.30±15.41c 28.29±5.35AB 435.4±16.40b 16.57±1.43A B3 454.00±17.25bc 28.07±0.56AB 492.2±37.05ab 19.43±0.33AB C1 388.00±22.34c 26.07±3.33AB 488.9±12.87ab 16.05±5.39A C2 586.80±34.51a 36.21±2.32B 538.8±66.19ab 23.64±2.32B C3 518.50±60.10ab 29.57±2.93AB 546.8±70.71ab 37.79±1.92C C4 521.10±64.63ab 30.11±2.58AB 511.9±61.52ab 35.43±0.617d after immunization 免疫后第15天15d after immunization IL－6 TNF－α IL－6 TNF－α A Groups 免疫后第7天C

2.7 不同處理Cy對大鼠TNF-α生成的影響

與對照組相比，在第7天各組TNF－α的含量差異無顯著性。第15天，B組(免疫OVA后當天注射不同劑量Cy組)與對照組相比差異均無顯著性，C組(免疫OVA前3 d注射Cy)與對照組相比，C2、C3、C4組均顯著升高，C1組差異無顯著性。結果見表4。

2.8 各組免疫指標綜合得分

各實驗組免疫指標得分見表5。B1、B2和B3組免疫指標綜合得分，7 d分別為 －4、－4、－4，15 d分別為1、1、2;C1、C2、C3 和 C4 組免疫指標綜合得分，7 d分別為 －4、3、5、4，15 d 分別為2、1、2、2。

表5 不同處理Cy組大鼠各免疫指標綜合得分Tab.5 The composite scores of all immune indexes in the rats treated by different doses of cyclophosphamide

3 討論

3.1 Cy對大鼠免疫器官的影響

免疫器官是淋巴細胞和其他免疫細胞發生、分化、成熟、定居和增殖以及產生免疫應答的場所，其中胸腺是機體的中樞免疫器官，是T細胞分化成熟的場所。脾臟是最大的外周免疫器官，受抗原刺激后，參與機體細胞和體液免疫的T細胞、B細胞和巨噬細胞大量增生，致脾濾泡增大，脾體積增大;而受到免疫抑制影響時，淋巴組織萎縮，致脾體積縮小。因此免疫器官指數說明了免疫器官的發育狀況，間接體現了機體的免疫狀態。本實驗結果表明免疫后當天注射不同劑量Cy或者多次小劑量注射Cy(B組)，以及免疫前3 d超大劑量注射Cy(C1組)在免疫后第7天，均能顯著抑制大鼠脾臟指數，但其抑制作用，在15 d時消失，脾臟指數出現代償性增高。免疫前3 d注射適當劑量(80、20 mg/kg)Cy(C2、C3組)時均能引起大鼠脾臟指數的升高，但維持時間較短暫，在免疫后兩周基本上消失，進入機體的代償期。對于胸腺指數，除了免疫前3 d超大劑量注射Cy(C1組)在7、15 d能顯著影響胸腺指數外，其他各組差異不大。

3.2 Cy對大鼠淋巴細胞的影響

淋巴細胞根據表型和功能的不同可以分為很多群體，包括T細胞、B細胞、NK細胞、LAK細胞等等。其中T淋巴細胞在體外經PHA或ConA刺激后，可轉化為淋巴母細胞，其轉化情況，可反應機體的細胞免疫水平［12］。NK細胞介導天然的免疫應答，它無需抗原或有絲分裂原刺激，也無需抗體或補體參與，即可殺傷腫瘤細胞或溶解被病毒和胞內寄生菌感染的細胞，在抗腫瘤和早期抗感染過程中起重要作用。

本實驗結果表明，免疫OVA后當天注射不同劑量的Cy或者免疫前3 d超大劑量注射Cy第7天對T淋巴細胞的轉化無影響，但大鼠NK細胞活性有下降趨勢而且在第15天NK細胞活性明顯增強;而免疫前3 d一次注射80 mg/kg Cy第7天能促進淋巴細胞增殖，一次注射20 mg/kg Cy第7天能促進NK細胞活性。說明Cy對大鼠淋巴細胞的活性有影響，但其影響作用與Cy劑量和作用時間相關。

3.3 Cy對大鼠體液免疫的影響

體液免疫是機體特異性免疫的一個重要組成部分，血清抗體的高低在一定程度上反映機體對疾病的抵抗能力，也即抗體效價的高低一定程度上能反映機體免疫狀態。已有文獻報道Cy對體液免疫呈現小劑量促進和大劑量抑制的雙向作用［4］。本實驗結果顯示Cy大劑量(總劑量在100～125 mg/kg)對大鼠抗體生成的影響在15d內不明顯;225 mg/kg在15 d時可抑制抗體產生;注射較低劑量的Cy(總劑量15、20 mg/kg)對抗體生成在第7天時有一定的促進作用。說明Cy對體液免疫確實有雙向調節作用，其作用與劑量密切相關，但作用持續時間不長。

3.4 Cy對大鼠IL-6和TNF-α的影響

多種淋巴細胞如T細胞、B細胞、單核細胞和某些非淋巴細胞如成纖維細胞、內皮細胞等均能產生細胞因子IL－6，IL－6對多種細胞的生長和分化都有調節作用，可促進T淋巴細胞活化和增生，輔助B淋巴細胞促使抗體合成和分泌，參與體液免疫過程。TNF－α主要是由巨噬細胞和T細胞產生的促炎因子，在許多生理的免疫應答中有重要作用。研究表明促炎因子IL－6和TNF－α與一些自身免疫性疾病的發生和轉歸密切相關，例如類風濕性關節炎病人可在滑膜和血清中檢測到高水平表達的IL－6［13］，銀屑病病損局部和血清中IL－6和TNF－α水平均見升高［14］。本實驗結果表明大劑量注射Cy(總劑量100～225 mg/kg)能顯著抑制大鼠血清IL－6的含量，但作用時間有限，而免疫前3 d注射Cy(總劑量在15、20或者80 mg/kg)能顯著提高TNF－α的含量。

3.5 Cy對大鼠免疫功能調節作用的劑量與時效

有文獻報道用低劑量(20、80 mg/kg)多次腹腔注射的方式建立免疫抑制模型［8，15－16］，我們在前期預實驗時(分別以125、100 mg/kg的劑量腹腔一次注射，以每日80、40 mg/kg劑量連續3 d腹腔注射)發現，以每日80 mg/kg的劑量連續3 d腹腔注射大鼠，從免疫后第12天開始大鼠出現不同程度的死亡，可能由于抑制作用過強超出了大鼠自身的調節范圍。

本實驗結果顯示，Cy不同劑量、使用次數對機體的免疫功能會有影響，且其影響持續時間有限，在使用Cy建立免疫抑制或免疫亢進模型時，應綜合考慮各項免疫指標和其作用時效。免疫抑制模型可選用B1、B2模型，即注射OVA后6 h腹腔一次性注射Cy(125 mg/kg或100 mg/kg)，兩組模型免疫指標綜合得分一樣。免疫亢進模型，實驗周期7 d以內，C3、C4模型均可(即免疫OVA前3 d腹腔一次性注射Cy劑量20 mg/kg或每日5 mg/kg，連續3 d)，C3要更好些;實驗周期大于7 d小于15 d，C3組模型更合適(即Cy劑量20 mg/kg)。

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