高通量結核分枝桿菌蛋白可溶表達篩選平臺的構建與應用

許靜 任百光 程海麗 劉懷鈺 魏文豐 鄧朗萍 封勝雪 畢利軍

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·論著·

高通量結核分枝桿菌蛋白可溶表達篩選平臺的構建與應用

許靜 任百光 程海麗 劉懷鈺 魏文豐 鄧朗萍 封勝雪 畢利軍

目的 為了改變結核分枝桿菌蛋白質的結構與功能研究由于受結核分枝桿菌蛋白難以可溶性表達和純化的影響而進展緩慢的問題。方法 將多個能促進可溶性表達的蛋白標簽與高通量的Gateway克隆技術相結合，構建結核分枝桿菌蛋白可溶性表達快速通量的篩選平臺。挑選46個不同分子量且已知以包涵體形式表達或者不表達的結核分枝桿菌蛋白的基因，分別克隆到帶有N-末端的氮源利用物質A(N utilization substance A, NusA)、小分子泛素樣修飾蛋白 (small ubiquitin-like modifier-1, SUMO)、麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，MBP)、硫氧還蛋白(thioredoxin A, TrxA)、酰基載體蛋白(acyl carrier protein, ACP)五種蛋白標簽基因的載體上，進行融合表達，分析比較各標簽促進可溶性表達的效果。結果 融合NusA標簽后，19個蛋白以可溶性形式表達，占總樣本的41%(19/46)；同時融合SUMO、MBP、TrxA、ACP標簽后，可溶性表達的蛋白也分別達到總樣本數的22%(10/46)、26%(12/46)、26%(12/46)、22%(10/46)。結論 結核分枝桿菌蛋白可溶性表達快速通量篩選平臺的建立，實現了結核分枝桿菌重組蛋白可溶性表達的快速通量篩選，為更進一步研究結核分枝桿菌蛋白、特別是重要藥物靶標蛋白的結構與功能創造了條件。

結核分枝桿菌； 重組融合蛋白質類； 高通量篩選分析

結核分枝桿菌的致病機理研究和關鍵藥物靶點的結構與功能研究都需要重組表達信號通路中的關鍵蛋白或者藥物靶標蛋白。在前期工作中，本實驗室將結核分枝桿菌蛋白重組到釀酒酵母表達系統中，發現幾乎所有蛋白都能可溶表達，但是表達量偏低，無法滿足多數實驗的要求[1]。大腸桿菌蛋白表達系統以其背景清晰、生長快速、表達量高、易于操作等優點，仍為最常用的表達系統[2, 3]，然而結核分枝桿菌重組蛋白以大腸桿菌為異源表達的宿主時，只有少量的蛋白能實現可溶性表達，大多數蛋白不表達或者是以不可溶的包涵體形式表達。包涵體蛋白雖然可以通過變性復性獲得一定比例的可溶蛋白[4-6]，但是這些操作很大程度上會影響目的蛋白的活性從而影響后續的功能研究。

融合標簽與目的蛋白融合表達時可增加重組蛋白的表達量或增強重組蛋白的可溶性[2, 7-8]。氮源利用物質A (N utilization substance A, NusA)、麥芽糖結合蛋白(maltose-binding protein，MBP)、硫氧還蛋白(thioredoxin A, TrxA)是發展較早的融合標簽，研究表明MBP具有很好的促溶效果，并能幫助融合蛋白正確折疊[9-10]；NusA與MBP提高可溶性表達能力相當[11]，有些研究認為TrxA也具有很好的提高重組蛋白可溶性表達的能力[12-13]。近年來有研究發現小分子泛素樣修飾蛋白(Small ubiquitin-like modifier-1,SUMO)能夠促進蛋白正確折疊和結構穩定，從而提高蛋白可溶性[14-17]。酰基載體蛋白(acyl carrier protein, ACP)極性氨基酸含量很高，本身可溶性非常高，能在一定程度上促進重組蛋白可溶表達(未發表數據)。

盡管現在融合標簽技術已得到廣泛應用，但是目前還沒有將融合標簽用于結核分枝桿菌重組蛋白表達的報道，而且缺少一個高通量的平臺能夠快速的篩選多個不同融合標簽的促溶效果。為找到能更好的表達結核分枝桿菌蛋白的重組表達系統，本研究選取上述5個融合標簽，分別與46個不同分子量且已知以包涵體形式表達或者不表達的結核分枝桿菌蛋白融合表達，比較這些融合標簽促進結核分枝桿菌重組蛋白可溶性表達的效果。 另一方面，本研究構建的載體引入了Gateway[18-19]反應位點附著點(attachment site，att) R(attR)，克服了克隆位點不一致、重組蛋白性質不同等原因不能高通量表達、純化異源蛋白的困難，實現了通量、高效的結核分枝桿菌蛋白可溶性表達篩選。本研究中所有結核分枝桿菌蛋白基因均可采用Gateway克隆技術高通量地重組到構建的載體中，實現結核分枝桿菌蛋白基因高效克隆。此外，除MBP融合蛋白外，其余融合蛋白的N端均帶有6個組氨酸標簽 (6 His)，因此可以通過鎳離子金屬螯合親和層析法(Ni-NTA)進行純化，實現結核分枝桿菌重組蛋白的高效表達篩選。

材料和方法

一、材料

1.質粒和菌株：Gateway pDEST17 vector(簡稱“pDEST17”)購自Thermo scientific公司；pET32a通用質粒、pET50b通用質粒購自Novagen公司；實驗中所使用的入門(entry)克隆菌為美國克雷格·文特爾研究所(J. Craig Venter Institute) 下設的病原體功能基因組學資源中心(Pathogen Functional Genomics Resource Center，PFGRC)免費提供；Gateway pET32a-ACP vector(簡稱“pET32a-ACP”)、PKMV-SUMO 質粒為北京六合華大基因科技有限公司構建；Rosetta(DE3)、E.coilDH5α、E.coilDB3.1菌株購自天根生化科技(北京)有限公司。

2.主要試劑：限制性內切酶、T4連接酶購自美國New England Biolabs(NEB)公司； Gateway?LR Clonase Ⅱ Enzyme Mix購自美國Invitrogen生命技術公司；BugBuster購自德國默克公司；質粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、PCR回收試劑盒均購自美國Axygen公司；DNA分子量標準購自北京全式金生物技術有限公司；蛋白分子量標準購自美國賽默飛世爾科技公司(Thermo Fisher Scientific)； Ni-NTA樹脂購自德國默克公司；直鏈淀粉樹脂(amylose resin)購自美國New England Biolabs(NEB)公司；其他分子生物學和常規生化試劑購自生工生物工程(上海)股份有限公司。

3.DNA測序：寡核苷酸引物的合成、重組質粒的測序由華大基因科技股份有限公司廣州分公司完成。

二、方法

1.融合標簽載體構建：以pDEST17為模板，attR-p1、attR-p2為引物(表1)，擴增得到1730 bp的Gateway反應位點序列，經HindⅢ、SacⅠ酶切后，連接入同樣酶切的pET50b載體中，轉化E.coilDB3.1感受態細胞，經測序驗證得到重組載體Gateway pET50b vector；隨后經NdeⅠ、XhoⅠ切出3467 bp的NusA+Gateway反應位點序列，連接入同樣酶切的pET32a通用質粒中，轉化E.coilDB3.1感受態細胞，經測序驗證得到融合標簽載體Gateway pET32a-NusA vector(簡稱“pET32a-NusA”)。

提取載體pET32a-NusA，用NdeⅠ和SacⅡ酶切回收大片段，和帶有相同酶切位點的組氨酸標簽(His-tag)編碼基因連接，His-tag編碼基因雙鏈由兩條寡核苷酸單鏈退火形成，連接產物轉化E.coilDB3.1感受態細胞，經測序驗證得到融合標簽載體Gateway pET32a vector(簡稱“pET32a”)。

編碼his-tag的寡核苷酸單鏈為：5′-TATGGGCAGCAGCCATCACCACCATCACCATTCT-AGTTCCGC-3′，5′-GGAACTAGAATGGTGATGGTGGTGATGGCTGCTGCCCA-3′

PKMV-SUMO 質粒用NdeⅠ和SacⅡ切出376 bp的SUMO片段，連接入同樣酶切的pET32a-NusA載體中，轉化E.coilDB 3.1感受態細胞，隨機篩選陽性克隆接種于5 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)的溶菌肉湯(lysogeny broth，LB)液體培養基，37 ℃振蕩培養6 h，取菌液送華大基因科技股份有限公司廣州分公司測序，經驗證得到融合標簽載體Gateway pET32a-SUMO vector(簡稱“pET32a-SUMO”)。

以pET32a通用質粒為模板，TrxA-p1、TrxA-p2(表1)為引物擴增得到328 bp的TrxA片段，經NdeⅠ和SpeⅠ酶切后，連接入同樣酶切的pET32a-ACP載體中，同上轉化E.coilDB3.1感受態細胞，篩選陽性克隆接種LB液體培養基，取菌液經測序驗證得到融合標簽載體Gateway pET32a-TrxA vector(簡稱“pET32a-TrxA”)。

以pMAL-c2x質粒為模板，MBP-p1、MBP-p2(表1)為引物擴增得到1102 bp的MBP片段，經NdeⅠ和SacⅡ酶切后，連接入同樣酶切的pET32a-ACP載體中，同上轉化E.coilDB3.1感受態細胞，篩選陽性克隆接種LB液體培養基，取菌液經測序驗證得到融合標簽載體Gateway pET32a-MBP vector(簡稱“pET32a-MBP”)。

2.重組質粒的構建：在保證蛋白分子量大小平均分布的前提下，隨機選取46個結核分枝桿菌蛋白，其中4個可溶表達蛋白作為對照，其余42個蛋白均為不表達或包涵體表達(表2)。培養對應的entry克隆菌，提取entry克隆質粒，然后按entry克隆質粒∶LR反應酶∶融合標簽載體質粒=3∶1∶1的比例混合，25 ℃過夜，轉化E.coilDH5α感受態細胞，隨機挑選單克隆接種于1.2 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)的LB液體培養基，37 ℃振蕩培養24 h。小量提取質粒DNA，BsrGⅠ酶切驗證后測序驗證。

3.融合蛋白的誘導表達及可溶性分析：將經酶切測序驗證的重組質粒轉化Rosetta(表達菌)，挑選單克隆接種于含氨芐青霉素(100 μg/ml)和氯霉素(30 μg/ml)的LB液體培養基，37 ℃振蕩培養過夜。按5∶100的接種量轉接于5 ml含氨芐青霉素(100 μg/ml)和氯霉素(30 μg/ml)的LB液體培養基，37 ℃振蕩培養約1.5 h至A600值=0.6～0.8，加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.4 mmol/L，25 ℃誘導表達6 h。收集菌體采用BugBuster裂解，離心后沉淀用與1%+二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS)重懸制樣，上清取部分制樣，余下上清制取柱結合樣品。采用Amylose分離MBP融合蛋白，用10倍柱體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)(NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L)平衡Amylose樹脂，加入余下上清4 ℃結合2 h，然后用PBS緩沖液洗滌樹脂3次，最后加入一定量洗脫緩沖液(NaCl 137 mmol/L，KCl 2.7 mmol/L，Na2HPO410 mmol/L，KH2PO42 mmol/L，麥芽糖20 mmol/L)洗脫蛋白制樣。采用Ni-NTA樹脂純化His-tag融合蛋白，同上菌體裂解制樣后剩下的上清加入用裂解緩沖液(20 mmol/L三(羥甲基)氨基甲烷鹽酸鹽(Tris-HCl) ，500 mmol/L NaCl，10%甘油，pH 8.0)洗滌和平衡后的樹脂，4 ℃結合30 min，然后用洗滌緩沖液[20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,20 mmol/L 咪唑，10%甘油，pH 8.0]洗滌樹脂3次，最后加入一定量洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl,500 mmol/L NaCl,500 mmol/L 咪唑，10%甘油，pH 8.0)洗脫蛋白制樣。上清、沉淀、柱結合樣品通過10% N-三(羥甲基)甲基甘氨酸(Tricine)-SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis，PAGE)(10%Tricine-SDS-PAGE)進行分析。

表1 本研究所使用的寡核苷酸引物

注 酶切位點用下劃線表示

表2 本研究所選的結核分枝桿菌蛋白

注 表中蛋白信息來自TubercuList 網站 (http://tuberculist.epfl.ch/)。IB：包涵體表達；S：可溶表達；N：不表達

結 果

一、融合標簽載體的構建

以pDEST17為模板PCR擴增Gateway反應位點序列，PCR產物經1%凝膠電泳檢測與預期大小相符合。將連接產物轉化后，隨機挑取克隆測序驗證，測序結果表明Gateway反應位點序列全長1730 bp，完全正確。重組載體Gateway pET50b vector 用NdeⅠ、XhoⅠ雙酶切，酶切產物經1%凝膠電泳檢測與預期大小相符合。將連接產物轉化后，隨機挑取克隆測序驗證，測序結果表明NusA+Gateway反應位點序列全長3467 bp，完全正確；表明重組融合標簽載體pET32a-NusA構建成功。

由2條寡核苷酸單鏈退火形成的his-tag編碼基因雙鏈用NdeⅠ、SacⅡ雙酶切，連接入同樣酶切的pET32a-NusA載體中，將連接產物轉化后，隨機挑取克隆測序驗證，測序結果表明重組載體pET32a無堿基缺失、插入等突變現象，表明重組載體pET32a構建成功。

PKMV-SUMO 質粒用NdeⅠ和SacⅡ雙酶切，酶切產物經1%凝膠電泳檢測與預期大小相符合。將連接產物轉化后，隨機挑取克隆測序驗證，測序結果表明SUMO 標簽全長376 bp，完全正確；表明重組融合標簽載體pET32a-SUMO構建成功。

pET32a通用質粒為模板PCR擴增TrxA片段、以pMAL-c2x質粒為模板PCR擴增MBP片段，PCR產物經1%凝膠電泳檢測與預期大小相符合。將連接產物轉化后，隨機挑取克隆測序驗證，測序結果表明TrxA標簽全長328 bp、MBP標簽全長1102 bp，完全正確；表明重組融合標簽載體pET32a-TrxA、 pET32a-MBP構建成功。

二、重組蛋白表達載體的構建

46個結核分枝桿菌重組蛋白對應entry克隆質粒經Gateway反應后，得到相應重組蛋白表達載體；經BsrGⅠ酶切，酶切產物經1%凝膠電泳檢測，表明均在對應目的基因大小位置有明顯的特異性條帶，酶切驗證正確；克隆測序驗證，測序結果表明結核分枝桿菌重組蛋白基因全長完全正確，46個結核分枝桿菌重組蛋白表達載體構建成功。

三、重組蛋白表達檢測

結核分枝桿菌重組蛋白表達載體構建成功后，轉化Rosetta，經0.4 mmol/L異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導，Tricine-SDS-PAGE分析結核分枝桿菌重組蛋白表達情況。與未融合標簽的菌株相比，5種蛋白融合標簽均可促進結核分枝桿菌重組蛋白在E.coli中的可溶表達，然而促溶效果卻有明顯差異(表3)。

從46個重組蛋白總體表達情況來看(表4)，重組蛋白可溶表達數量占總樣本數的比例均有所提高。其中NusA標簽融合蛋白可溶表達數量占總樣本數的比例最高[41%(24/46)，融合蛋白可溶表達數量/總樣本數]；MBP、TrxA標簽也有一定促溶效果，其融合蛋白數量占總樣本數的比例均為26%(12/46)融合蛋白可溶表達數量/總樣本數)；ACP、SUMO標簽促溶效果最差，但是融合蛋白可溶表達數量占總樣本數的比例也均達到22%(10/46,融合蛋白可溶表達數量/總樣本數)。

表3 融合不同標簽后各蛋白的表達情況

續表3

注 IB：包涵體表達；S：可溶表達；N：不表達

表4 各種表達情況在融合不同標簽后結核分枝桿菌重組蛋白中的表達(單位：個)

注 包涵體：只在沉淀樣品電泳圖中可看到目的蛋白特異性條帶；可溶表達：在上清樣品或者柱結合樣品電泳圖中可看到目的蛋白特異性條帶；不表達：在上清、沉淀和柱結合樣品電泳圖中均未看到目的蛋白特異性條帶

從促溶效果分析(表5)，NusA蛋白融合標簽促溶效果最好，無論是促進包涵體蛋白可溶表達，還是促進不表達蛋白可溶表達，NusA蛋白融合標簽都有明顯優于其他標簽的效果。雖然5種蛋白融合標簽均能促進某些結核分枝桿菌重組蛋白可溶表達，如圖1 A中Rv2299c五種標簽融合蛋白均有一定量的可溶表達；然而，有些蛋白只有融合了NusA蛋白融合標簽后才能可溶表達，如圖1 A中的Rv3509c及圖1 B中的Rv0851c、Rv0315 和 Rv0774c，融合其余4種標簽均未見明顯的可溶表達。此外，融合ACP、SUMO、MBP或TrxA標簽中任何一個后能可溶表達的蛋白在融合了NusA標簽后也能可溶表達，在融合了NusA標簽后不表達或者包涵體表達的蛋白在ACP、SUMO、MBP或TrxA標簽后依然不能可溶表達。

表5 包涵體表達或不表達蛋白在融合各標簽后的可溶表達的數量(單位：個)

注 包涵體：只在沉淀樣品電泳圖中可看到目的蛋白特異性條帶；可溶表達：在上清樣品或者柱結合樣品電泳圖中可看到目的蛋白特異性條帶；不表達：在上清、沉淀和柱結合樣品電泳圖中均未看到目的蛋白特異性條帶

討 論

融合標簽技術是近年來興起的一項重組DNA技術，在重組蛋白的純化、促進重組蛋白的表達、幫助重組蛋白正確折疊、提高重組蛋白的可溶性及穩定性等方面有很大的應用價值[2, 7-8]。然而雖然融合標簽已經廣泛應用于促進蛋白的可溶表達，但是目前還沒用將融合標簽用于結核分枝桿菌蛋白表達的報道。

結核分枝桿菌是結核病的致病菌，結核病是困擾全球的疾病。為有效地預防和治療這種疾病，我們需要對該病原體的基本生物學和發病機理做更進一步的研究。然而結核分枝桿菌的致病機理研究和關鍵藥物靶點的結構與功能研究都需要大量可溶的、有功能活性的蛋白。筆者前期研究中發現結核分枝桿菌蛋白能在釀酒酵母中可溶表達，但是表達量不足以滿足很多實驗的要求。結核分枝桿菌蛋白在E.coli中難以可溶表達的具體原因還不清楚，可能是因為結核分枝桿菌蛋白編碼基因的GC含量較高，其密碼子偏好性與E.coli有明顯差異[20]；此外某些結核分枝桿菌蛋白存在翻譯后修飾也可能是其在E.coli中難以可溶表達的原因之一。

通過本研究的比較分析，筆者可以推測出這5種常用促溶標簽中哪種標簽更適合用來促進結核分枝桿菌蛋白的可溶表達。雖然5種融合標簽均可促進結核分枝桿菌重組蛋白在E.coli中可溶表達，但是NusA融合標簽效果明顯優于其他融合標簽。其余4種標簽雖然也能在一定程度上促進結核分枝桿菌蛋白的表達，但是重組蛋白多數還是以包涵體形式表達。

本實驗結果顯示，融合標簽能促進結核分枝桿菌蛋白在E.coli中可溶表達，但是具體的促溶機制還不清楚。NusA標簽能促進蛋白可溶表達可能與NusA標簽本身溶解度和生物活性有關。NusA標簽本身表達量大且具有高度可溶性，可帶動融合的靶蛋白可溶表達；此外，NusA可以促進轉錄中止，從而減緩翻譯速度，為蛋白折疊提供更充足的時間[2]。

本研究中，常用的融合標簽MBP及SUMO、TrxA促溶效果均沒有NusA融合標簽好。一般來說MBP標簽無論是融合在靶蛋白N-末端還是C-末端，均可促進靶蛋白可溶表達；然而有研究顯示MBP標簽融合在靶蛋白N-末端會降低翻譯效率[15]，這可能是導致本實驗中MBP標簽促溶效果沒有NusA標簽好的原因。大多數情況下SUMO、TrxA融合標簽有很好的促溶效果，但有些蛋白還是以包涵體形式表達或不表達，其原因尚不清楚；有一部分可能是因為SUMO、TrxA融合標簽本身分子量小，靶蛋白mRNA與小標簽mRNA形成的二級結構會干擾核糖體的結合，從而阻礙翻譯的有效進行[8]。

蛋白融合標簽可顯著提高結核分枝桿菌重組蛋白在E.coli中可溶表達，為結核分枝桿菌重組蛋白的分離純化提供了更多選擇。然而蛋白融合標簽并不能完全解決結核桿菌蛋白可溶表達的難題，在融合了這些標簽后還是有一定比例的蛋白不表達或者不可溶，但是融合標簽只是促進重組蛋白可溶表達的方法之一。在另一項研究中(未發表數據)，筆者發現密碼子偏好性也會影響結核分枝桿菌蛋白的表達；密碼子優化可以明顯促進結核分枝桿菌蛋白的表達，但是價格昂貴不適合通量操作。mRNA穩定性和培養條件等也會影響重組蛋白的表達[21]，在后續工作中還可以嘗試更多方法提高結核分枝桿菌重組蛋白的可溶表達量，為結核分枝桿菌蛋白的研究提供方便，促進研究的深入開展。

志謝 美國克雷格·文特爾研究所病原體功能基因組學資源中心給本研究免費提供了entry克隆菌，中國科學院生物物理研究所Joy Fleming博士和侯劍博士對文稿進行了編輯整理

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(本文編輯：薛愛華)

Construction and application of a high throughput screening platform for soluble expression ofMycobacteriumtuberculosisproteins

XUJing*,RENBai-guang,CHENGHai-li,LIUHuai-yu,WEIWen-feng,DENGLang-ping,FENGSheng-xue,BILi-jun.

*SchoolofLaboratoryMedicineandLifeScience,WenzhouMedicalUniversity,Wenzhou325005,China

Correspondingauthor:BILi-jun，Email：blj@ibp.ac.cn

Objective To solve the problem that the progress in the study ofMycobacteriumtuberculosisprotein structure and function is slow asM.tuberculosisproteins are difficult to express and purify in soluble form. Methods We developed a high-throughput screening platform for the soluble expression ofM.tuberculosisproteins in Escherichia coli by combining high-throughput Gateway cloning with the use of multiple fusion tags. We randomly selected 46 genes forM.tuberculosisproteins of different molecular weights which have been difficult to purify as they are either not expressed or are expressed in inclusion bodies and fused them to the C-terminals of the N utilization substance A (NusA), small ubiquitin-like modifier-1 (SUMO), maltose-binding protein (MBP), thioredoxin A (TrxA), and acyl carrier protein (ACP) tags. These constructs were then expressed inE.coliand evaluated for expression and solubility. Results As expected, the fusion tags varied in their ability to produce solubleM.tuberculosisproteins. NusA fusion enhanced expression and solubility of recombinant proteins most dramatically; 19 proteins (41%，19/46) fused with the NusA tag were expressed in soluble form, while 22%(10/46), 26%(12/46), 26%(12/46) and 22%(10/46)of proteins fused with the SUMO, MBP, TrxA, and ACP tags, respectively, were solubly expressed. Conclusion The development of high-throughput screening platform for the soluble expression ofM.tuberculosisproteins provides a screening platform for the rapid high-throughput soluble expression ofM.tuberculosisrecombinant proteins and will facilitate the structural and functional studies ofM.tuberculosisproteins, especially the proteins targeted by the important drugs.

Mycobacteriumtuberculosis； Recombinant fusion proteins； High-throughput screening assays

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.05.004

中國科學院科技網絡服務計劃(STS計劃) (KFJ-EW-STS-028)； 廣東省引進創新創業團隊項目 (2013S024)；佛山市科技創新基金(2013HT100103)

325005 溫州醫科大學檢驗學院、生命科學院 [許靜(研究生)、畢利軍(兼職教授)]；中國科學院生物物理研究所(畢利軍)；佛山市廣東體必康生物科技有限公司(任百光、 程海麗、劉懷鈺、魏文豐、鄧朗萍、封勝雪)

畢利軍， Email：blj@ibp.ac.cn

2015-03-30)