天津市城區肺結核患者對吡嗪酰胺耐藥的現狀及特征

張國欽 商健 張玉華 鐘達 陳盛玉 傅衍勇

?

·論著·

天津市城區肺結核患者對吡嗪酰胺耐藥的現狀及特征

張國欽 商健 張玉華 鐘達 陳盛玉 傅衍勇

目的 了解天津市城區肺結核患者對吡嗪酰胺(PZA)耐藥的現狀及特征。 方法 應用Bactec MGIT 960系統，對2011—2013年天津市結核病控制中心門診部確診的痰培養陽性肺結核患者進行一線抗結核藥物的藥敏試驗，以812例有藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)結果的患者為研究對象，分析PZA耐藥情況。 結果 初治肺結核患者PZA耐藥率為2.8%(20/706)，復治患者為7.5%(8/106)，差異有統計學意義(χ2=6.15，P=0.01)。MDR-TB患者的PZA耐藥率為32.0%(16/50)，高于非MDR-TB患者的1.6%(12/762)(χ2=130.46，P<0.01)。INH、RFP、EMB、Sm耐藥和敏感患者的PZA耐藥率分別為18.7%(26/139)、0.3%(2/673)、32.7%(17/52)、1.4%(11/760)和60.9%(14/23)、1.8%(14/789)、14.8%(18/122)、1.4%(10/690)，差異均有統計學意義(χ2值分別為117.25、142.71、234.40和55.12，P值均<0.01)。經多因素分析，外地人口(Waldχ2=6.31，P=0.01，OR=5.02，95%CI=1.43～17.68)、INH耐藥(Waldχ2=10.90，P<0.01，OR=18.25，95%CI=3.26～102.26)、RFP耐藥(Waldχ2=3.76，P=0.05，OR=3.28，95%CI=0.99～10.91)、EMB耐藥(Waldχ2=22.87，P<0.01，OR=24.60，95%CI=6.62～91.41)是PZA耐藥危險因素。結論 PZA耐藥與其他一線藥耐藥性有關聯，PZA耐藥率在MDR患者中較高，應重視對MDR-TB患者進行PZA藥敏試驗。

結核, 肺； 吡嗪酰胺； 抗藥性, 細菌； 天津市

肺結核千百年來一直威脅著人類健康。盡管20世紀以來，抗結核化療藥物的應用使得大部分肺結核患者可以被治愈，然而近年來耐藥結核分枝桿菌的流行加上抗結核新藥和疫苗研發的滯后，使得結核病控制面臨嚴峻挑戰[1]。2012年，全球肺結核發病860萬例，其中45萬例為耐多藥結核病(MDR-TB)；中國是世界第二大結核病高負擔國家，肺結核年發病約100萬例，其中MDR-TB 12萬例[2]。吡嗪酰胺(PZA)是5種一線抗結核藥物中的強殺菌藥，不僅是肺結核標準化治療方案的重要成分，也被歸為MDR-TB治療的第一組藥物，全程應用于MDR-TB和XDR-TB的24個月和30個月標準化治療方案中[3]。然而，由于PZA體外試驗對培養條件的特殊要求，改良羅氏培養(L-J)法尚不能檢測PZA的耐藥性[4]。因此，雖然其他4種一線抗結核藥物的耐藥性檢測已逐步開展，但是對PZA耐藥的情況少有報道，也未包含在全國抗結核藥物耐藥性監測中[5]。了解肺結核患者對PZA的耐藥情況及特征，對肺結核的臨床治療、耐藥肺結核的防治有重大意義。

對象和方法

一、資料來源

天津市結核病控制中心門診部代管城區(包括和平區、河北區、河東區、南開區、紅橋區，共5個區)結核病診療工作，自2011年開展基于Bactec MGIT 960液體培養的PZA藥物敏感性試驗(簡稱“藥敏試驗”)。2011—2013年間，在該門診部共確診活動性肺結核患者2193例，1083例(49.4%)痰培養陽性，其中，排除丟失、遷出或拒絕檢查等未做藥敏試驗的患者外，共812例(75.0%)有藥敏試驗結果的培養陽性患者作為研究對象，通過統一門診病歷獲取臨床和流行病學資料。肺結核診斷及分類依據《中國結核病防治規劃實施工作指南(2008年版)》[6]。

二、實驗室檢查

采用美國BD公司生產的Bactec MGIT 960全自動分析儀，通過連續檢測接種標本培養管的熒光強度判斷是否有分枝桿菌生長。培養陽性的菌液進行異煙肼(INH)、利福平(RFP)、乙胺丁醇(EMB)、鏈霉素(Sm)和吡嗪酰胺(PZA)的藥敏試驗。操作步驟如下。

1. 痰標本處理：5 ml痰液以等量的N-乙酰-L半胱氨酸+2%NaOH消化液處理，震蕩靜置后加入磷酸鹽緩沖液(PBS)(pH值=6.8)，以3000×g離心15 min，倒去上清液后再加入1～3 ml PBS，中和pH值至6.8。

2. 液體培養：采用BactecTMMGITTM960 Growth Supplement(生長添加劑)、BactecTMMGITTM960 PANTA(雜菌抑制劑)和BBL MGITTM7 ml tube(7 ml培養管)。在7 ml培養管中加入0.8 ml生長添加劑溶解后的雜菌抑制劑，接種0.5 ml處理過的標本，另接種1滴標本至分枝桿菌固體培養基和血平板培養基以檢測是否污染。

3. 藥敏試驗：采用比例法，使用SIRE和PZA兩種藥敏試驗試劑盒，藥敏試驗判斷的臨界度為1%。SIRE 試劑盒(Sm：332 μg；INH：33.2 μg；RFP：332 μg；EMB：1660 μg)用4 ml無菌蒸餾水溶解；PZA 試劑盒(PZA：20 000 μg)用2.5 ml無菌蒸餾水溶解。在標記的相應MGIT管中加入0.8 ml BactecTMMGITTM960 SIRE、PZA 100 μl，每種藥物及未稀釋的菌液0.5 ml，以0.5 ml 1∶100稀釋后的菌液接種于生長控制管。

三、質量控制

用Middlebrook 7H9液體培養基配制的美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)標準質控菌株的菌懸液檢驗每批產品的質量，MGIT培養管應在規定范圍內報出陽性結果，如超出預期則不用該批次產品。

四、分析方法

應用χ2檢驗比較PZA耐藥與敏感患者的一般情況、臨床特征差異，分析PZA耐藥與其他一線抗結核藥物耐藥的關系，采用單因素及logistic回歸的多因素分析。應用SAS 9.13統計軟件，α=0.05(美國SAS軟件研究所)。

結 果

一、一般情況

研究對象中男551例(67.9%)，女261例(32.1%)；本地戶籍618例(76.1%)，外地戶籍194例(23.9%)；涂陽360例(44.3%)，涂陰452例(55.7%)；初治706例(87.0%)，復治106例(13.0%)；年齡呈非正態分布(P<0.01，偏度=0.63)，中位年齡33歲(24，54)。

二、PZA耐藥概況

5種一線抗結核藥物中，初復治患者均以INH和Sm的耐藥率最高(表1)，PZA耐藥率僅稍高于EMB，低于其他藥物耐藥率及耐多藥率。在所有研究對象中，PZA耐藥率為3.4%(28/812)，其中初治患者為2.8%(20/706)，復治患者為7.5%(8/106)，初復治患者的PZA耐藥率差異有統計學意義(χ2=6.15，P=0.01)。

表1 2011—2013年天津市城區肺結核患者一線抗結核藥物耐藥結果(Bactec MGIT 960法)

注a：二項分布法獲得的可信區間

三、PZA耐藥與其他藥物耐藥的關系

在28例PZA耐藥患者中，單耐PZA占3.6%(1/28)，其余患者同時對其他一線抗結核藥物耐藥(圖1)。PZA耐藥患者同時耐INH、RFP、EMB和Sm的比率分別為92.9%(26/28)、60.7%(17/28)、50.0%(14/28)、64.3%(18/28)，其中57.1%(16/28)為耐多藥患者。

圖1 PZA耐藥患者對其他一線抗結核藥物耐藥情況

INH耐藥和敏感患者對PZA的耐藥率分別為18.7%(26/139)和0.3%(2/673)，差異有統計學意義(χ2=117.25，P<0.01)；RFP耐藥和敏感患者對PZA耐藥率分別為32.7%(17/52)和1.4%(11/760)，差異有統計學意義(χ2=142.71，P<0.01)；EMB耐藥和敏感患者對PZA耐藥率分別為60.9%(14/23)和1.8%(14/789)，差異有統計學意義(χ2=234.40，P<0.01)；Sm耐藥和敏感患者對PZA耐藥率分別為14.8%(18/122)和1.4%(10/690)，差異有統計學意義(χ2=55.12，P<0.01)。耐多藥患者的PZA耐藥率為32.0%(16/50)，非耐多藥患者的PZA的耐藥率為1.6%(12/762)，兩組差異有統計學意義(χ2=130.46，P<0.01)。對其余4種藥物耐藥患者同時耐PZA的情況見圖2所示。

圖2 對其余4種一線抗結核藥物耐藥患者的PZA耐藥情況

四、PZA耐藥相關因素

比較PZA敏感和耐藥患者的流行病學和臨床特征，見表2所示。兩組患者的初復治分類的差異有統計學意義(χ2=6.15，P<0.05)，復治對PZA耐藥的OR值為2.8(95%CI：1.2～6.5)，而兩組患者性別、年齡、戶籍、學歷、痰涂片、有無空洞、是否合并肺外結核和糖尿病的差異均無統計學意義(P值均>0.05)。

以PZA是否耐藥為因變量，將可能與PZA耐藥相關的因素引入多因素logistic回歸分析，變量及賦值見表3所示，分析結果見表4所示。最終戶籍類型及INH、RFP、EMB耐藥與PZA耐藥的關聯有統計學意義，對PZA耐藥的調整OR值分別為5.02(95%CI：1.43～17.68)、18.25(95%CI：3.26～102.26)、3.28(95%CI：0.99～10.91)、24.60(95%CI：6.62～91.41)。

討 論

Bactec MGIT 960為世界衛生組織推薦的液體藥敏系統。與傳統L-J法相比，Bactec MGIT 960法雖然價格高，但對結核分枝桿菌培養的敏感度更高、時間更短，對一線抗結核藥物敏感性檢測結果與傳統方法具有很好的一致性[7-8]。本研究對象中，初復治肺結核患者對除PZA以外其余4種一線抗結核藥物的耐藥率低于2007年全國調查的耐藥水平，其中初復治患者耐多藥率分別為4.7%和16.0%，低于全國水平的5.7%和25.6%[5]。較低的耐藥水平與天津市肺結核總體疫情處于全國較低水平相一致[9]。但由于全國耐藥基線調查采用L-J法，無法比較PZA耐藥情況[5]。該研究對象結果顯示，初復治肺結核患者PZA耐藥率分別為2.8%和7.6%，初治患者的PZA耐藥率與1999—2009年美國肺結核患者PZA總體耐藥率2.7%、非耐多藥患者耐藥率2.2%相近[10]。現有Meta分析顯示，非耐多藥肺結核患者的PZA耐藥率的中位數為5%(0～9%)，高于本次結果[11]。國內梁慶福等[12]報道，福建省2008—2011年收集的218株菌株中，源于初復治患者菌株的PZA耐藥率分別為14.1%(23/163)和29.1%(16/55)，遠高于本研究的結果，但其研究的菌株中耐多藥比例高達41.7%(91/218)，而單獨對非耐多藥的菌株進行分析，PZA耐藥率為2.4%，與該研究中非耐多藥患者的PZA耐藥率1.6%接近。

表2 812例PZA敏感與耐藥患者一般特征、臨床特征比較

注a：學歷一項分類中，部分患者信息不全，故總例數少于812例

表3 多因素分析變量賦值

表4 PZA耐藥相關因素多因素logistic回歸分析結果

復治是肺結核耐藥的主要危險因素。此外，特定年齡段、流動人口等流行病學因素，臨床表現也與抗結核藥物耐藥具有相關性[13-16]。1999—2009年美國肺結核患者PZA耐藥還與0～24歲年齡、HIV感染和合并肺外結核等因素有統計學關聯[10]。但在該研究中，PZA耐藥除了外地人口具有更高風險外，與INH、RFP、EMB耐藥相關性更為突出，其調整OR值分別為18.3、3.3和24.6，而單耐PZA少見。單耐PZA而對其他藥物敏感的患者很可能感染的為牛分枝桿菌，美國1999—2009年在625例單耐PZA的菌株中，68.3%為牛分枝桿菌[10]。但本研究對象的菌株并未進行菌株分型，因而無法獲知牛分枝桿菌感染情況。但PZA與其他3種抗結核藥物有強的關聯性，提示PZA與這些藥物存在交叉耐藥的可能性。本次分析顯示，在耐多藥患者中PZA耐藥率為32.0%，遠高于非耐多藥患者1.6%的PZA耐藥率，與其他報道的結果相近[10-11,17-19]。美國的監測顯示，耐多藥患者的PZA耐藥率為38.0%，高于非耐多藥患者的2.2%。南非一項研究發現，PZA在耐多藥患者和其他一線藥物全敏感患者中的耐藥率分別為52.1%和10.2%[17]。日本一項報道也顯示耐多藥患者的PZA耐藥率為53%[18]。國內福建省218例菌株的檢測結果顯示，耐多藥患者的PZA耐藥率為39.6%，而非耐多藥患者的PZA耐藥率為2.4%[12]。另一項對95例耐多藥患者進行pncA法和Bactec MGIT 960法進行PZA檢測也顯示，耐多藥患者的PZA耐藥率為54.7%[19]。現有研究的Meta分析顯示，耐多藥患者中PZA的耐藥率中位數為51%(31%～89%)，高于非耐多藥患者的5%(0～9%)[11]。因此，盡管總體上PZA耐藥率相對較低，但在其他一線藥物耐藥的患者及耐多藥患者中PZA耐藥率較高。一方面，說明在普通肺結核標準化治療方案中，PZA作為強殺菌藥仍然具有很重要的作用；另一方面，對于耐藥肺結核患者，尤其是耐多藥和廣泛耐藥患者的治療中，至少應包括4種有效抗結核藥物，PZA耐藥高發將對其治療產生不利影響[20]。因此，制定耐多藥結核病和廣泛耐藥結核病患者化療方案時，應該重視推行對PZA進行藥敏試驗。

本研究的局限性：研究對象為天津市城區結核病定點醫療機構確診肺結核患者，而非抽樣調查獲得，獲得PZA耐藥率在外推時受到限制；研究對象多數為門診患者，未包含重癥住院患者，因此PZA耐藥率可能被低估。

[1] L?nnroth K, Castro KG, Chakaya JM, et al. Tuberculosis control and elimination 2010-50: cure, care, and social deve-lopment. Lancet, 375(9728): 1814-1829.

[2] World Health Organization. Global TB report, 2013. Geneva: World Health Organization, 2013.

[3] 王宇. 耐多藥肺結核防治管理工作方案. 北京: 軍事醫學科學出版社, 2012.

[4] Zhang Y, Mitchison D. The curious characteristics of pyrazinamide: a review. Int J Tuberc Lung Dis, 2003, 7(1):6-21.

[5] 中華人民共和國衛生部. 全國結核病耐藥性基線調查報告(2007—2008年). 北京: 人民衛生出版社, 2010.

[6] 中華人民共和國衛生部疾病預防控制局, 中華人民共和國衛生部醫政司, 中國疾病預防控制中心. 中國結核病防治規劃實施工作指南(2008年版). 北京: 中國協和醫科大學出版社, 2009: 38-40.

[7] 王巍, 李洪敏, 王安生, 等. BACTEC-MGIT 960快速培養藥敏對肺結核診治的應用和評價. 中國防癆雜志, 2003, 25(6): 379-381.

[8] 趙麗麗, 夏強, 劉志廣, 等. MGIT 960和比例法對結核分枝桿菌藥物敏感性試驗的對比研究. 醫學研究雜志, 2011, 40(5): 40-43.

[9] 肖東樓. 全國結核病防治規劃(2001—2010年)終期評估報告. 北京: 軍事科學出版社, 2011：110-130.

[10] Kurbatova EV, Cavanaugh JS, Dalton T, et al. Epidemiology of pyrazinamide-resistant tuberculosis in the United States, 1999—2009. Clin Infect Dis, 2013, 57(8): 1081-1093.

[11] Chang KC, Yew WW, Zhang Y. Pyrazinamide susceptibility testing inMycobacteriumtuberculosis: a systematic review with meta-analyses. Antimicrob Agents Chemother, 2011, 55(10):4499-4505.

[12] 梁慶福, 鄭金鳳, 陳求揚, 等. 218例涂陽肺結核吡嗪酰胺耐藥情況分析. 中國人獸共患病學報, 2012, 28(10): 1000-1002.

[13] Shen X, DeRiemer K, Yuan ZA, et al. Drug-resistant tuberculosis in Shanghai, China, 2000-2006: prevalence, trends and risk factors. Int J Tuberc Lung Dis, 2009, 13(2):253-259.

[14] Espinal MA, Laserson K, Camacho M, et al. Determinants of drug-resistant tuberculosis: analysis of 11 countries. Int J Tuberc Lung Dis, 2001, 5(10):887-893.

[15] Lomtadze N, Aspindzelashvili R, Janjgava M, et al. Prevalence and risk factors for multidrug-resistant tuberculosis in the Republic of Georgia: a population-based study. Int J Tuberc Lung Dis, 2009, 13(1):68-73.

[16] Dalton T, Cegielski P, Akksilp S, et al. Prevalence of and risk factors for resistance to second-line drugs in people with multidrug-resistant tuberculosis in eight countries: a prospective cohort study. Lancet, 2012, 380(9851): 1406-1417.

[17] Mphahlele M, Syre H, Valvatne H, et al. Pyrazinamide resistance among South African multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates. J Clin Microbiol, 2008, 46(10):3459-3464.

[18] Ando H, Mitarai S, Kondo Y, et al. Pyrazinamide resistance in multidrug-resistantMycobacteriumtuberculosisisolates in Japan. Clin Microbiol Infect, 2010, 16(8):1164-1168.

[19] 孫冰梅, 朱婕, 高靜. 耐多藥結核分枝桿菌臨床分離株吡嗪酰胺耐藥基因pncA的檢測. 山西醫藥雜志, 2007, 36(7): 665-666.

[20] Hoek KG, Schaaf HS, Gey van Pittius NC, et al. Resistance to pyrazinamide and ethambutol compromises MDR/XDR-TB treatment. S Afr Med J, 2009, 99(11):785-787.

(本文編輯：郭萌)

Prevalence and characteristic of Pyrazinamide resistance among pulmonary tuberculosis patients in urban area in Tianjin

ZHANGGuo-qin,SHANGJian,ZHANGYu-hua,ZHONGDa,CHENSheng-yu,FUYan-yong.

TianjinCenterforTuberculosisControl,Tianjin300041,China

Correspondingauthor:ZHONGDa,Email:zhongdada321@163.com

Objective To understand the prevalence and characteristics of Pyrazinamide (PZA) resistance among pulmonary tuberculosis (PTB) patients in urban area in Tianjin. Methods Bactec MGIT 960 system was used to test the susceptibility of first line anti-TB drugs for culture positive PTB patients diagnosed in clinic department of Tianjin Center for TB Control during 2011 to 2013. Eight hundred and twelve patients with drug susceptibility test results were enrolled to analyze the prevalence and characteristics of PZA resistance. Results Among new patients 2.8% (20/706) were resistant to PZA compared to 7.5% (8/106) among previously treated patients (χ2=6.15,P<0.05), and the difference was statistically significant (χ2=6.15,P=0.01). Among MDR-TB patients 32.0% (16/50) were resistant to PZA, which was significantly higher than 1.6% (12/762) among non MDR-TB patients (χ2=130.46,P<0.01). Among patients with and without INH resistance, RFP resistance, EMB resistance and Sm resistance, the proportions of PZA resistance were respectively 18.7% (26/139) vs 0.3% (2/673), 32.7% (17/52) vs 1.4% (11/760), 60.9%(14/23)vs 1.8% (14/789) and 14.8% (18/122) vs 1.4% (10/690), and the differences were statistically significant (χ2were respectively 117.25, 142.71, 234.40 and 55.12,P<0.01). In multivariate analysis, migrants (Waldχ2=6.31,P=0.01,OR=5.02，95%CI=1.43—17.68), resistances to INH(Waldχ2=10.90,P<0.01,OR=18.25, 95%CI=3.26—102.26), resistance to RFP(Waldχ2=3.76,P=0.05,OR=3.28, 95%CI=0.99—10.91) and resistance to EMB (Waldχ2=22.87,P<0.01,OR=24.60, 95%CI=6.62—91.41) were risk factors to PZA resistance. Conclusion PZA resistance has relation to resistance to other first line anti-TB drugs, and proportion of PZA resistance was significant higher among MDR-TB patients, which emphasizes the importance to test susceptibility of PZA among MDR-TB patients.

Tuberculosis, pulmonary； Pyrazinamide； Drug resistance, bacterial； Tianjin city

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.05.009

300041 天津市結核病控制中心

鐘達，Email：zhongdada321@163.com

2014-12-12)