結核病診斷中抗酸染色陽性對照芯片的制作及其應用

方偉建 龔偉 朱憶凌 毛衛波 黃淵 陳國榮

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·技術交流·

結核病診斷中抗酸染色陽性對照芯片的制作及其應用

方偉建 龔偉 朱憶凌 毛衛波 黃淵 陳國榮

近年來中國結核病發病率呈上升趨勢[1]。結核分枝桿菌富含脂質和分枝菌酸，可耐受酸和乙醇脫色，通常采用萋-尼(Ziehl-Neelsen，Z-N)染色。在臨床和流行病學中常用檢查抗酸桿菌作為結核病診斷的依據，其中菌種鑒定為結核分枝桿菌是診斷結核病的金標準[2-3]。目前，尚無其他有效方法可替代抗酸染色，由于抗酸染色的陽性菌沒有統一的判斷標準，抗酸染色結果具有主觀判讀的不穩定性。另外，抗酸染色過程中影響因素較多，設置適當的對照在結核病抗酸染色實驗中是質量控制的關鍵。組織芯片具有體積小、可操作性強、成本低和可比性強等特點，筆者利用組織芯片技術原理，改進芯片制作技術，在同一張切片上設立抗酸染色陽性對照，使得染色結果判斷更為客觀可靠，提高了抗酸桿菌的檢出率，且方法簡便可行，現介紹如下。

材料和方法

一、制作材料和試劑來源

從麗水市中心醫院病理科2010—2013年的檔案中篩選出經結核分枝桿菌DNA熒光探針檢測為陽性，結核分枝桿菌豐富[結核分枝桿菌>10條/高倍視野(high power field，HPF)]且分布均勻的病理標本1例。同時查找此例患者臨床治療結果，確認經抗結核治療有效，復查此例病理標本檔案，從中選出原抗酸染色切片，獲得抗酸染色呈強陽性(完全隨機選擇5個HPF，結核分枝桿菌均>10條/HPF)的組織蠟塊。自制采樣器(內徑1.8 mm的平頭穿刺套管一套)，載玻片(購自江蘇世泰實驗器材有限公司)，Z-N抗酸染色試劑盒(購自福州邁新生物技術開發有限公司)。本研究經麗水市中心醫院倫理委員會審核同意實施。已征得陽性對照病理標本患者同意。

二、陽性對照芯片的制作

復查蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining，HE)切片與抗酸染色切片，選擇最具代表性區域，畫圈標記，再在組織蠟塊上相應區域進行標記。用自制采樣器，從供體蠟塊中采集組織，取出1 cm×1 cm 包埋模具(日本櫻花組織包埋機Tissue-Tek TEC 5自帶模具)，先在模具底部加入少許石蠟，放置于加熱臺上使其熔化，待其完全熔化后放入所取組織芯，然后將模具移至冷卻臺稍冷卻，使組織包埋面平整后按常規操作完成包埋。將組織芯片進行連續切片，厚度為4 μm，裱貼于載玻片的一端。于60 ℃烤箱內烤片約12 h后取出，儲藏于干燥的切片盒內備用。

三、抗酸染色

當需要做抗酸染色時，從備用盒中取出1張對照芯片，將待檢患者的活檢病理組織蠟塊進行切片后，裱于對照片旁邊，用鉛筆在載玻片上注明病理號和抗酸染色，然后同時進行烤片，切片脫蠟至水，入石炭酸復紅染液，美藍復染，脫水，透明封固(圖1)。

圖1 采樣器、制成的蠟塊與對照芯片

四、染色結果的判斷

抗酸陽性桿菌為纖細，長約3 μm(變化幅度可以很大)、紅染、不折光、稍彎的微細桿狀物，或為稍彎的念珠樣微細桿狀物，與組織切片位于同一成像水平面上，位于巨噬細胞胞質內或位于細胞之外[4]。應用陽性對照芯片在行抗酸染色后，如果陽性對照芯片中抗酸桿菌清楚豐富(>10條/HPF)，說明抗酸結果可信。患者標本組織中如出現與陽性對照芯片中(>1條/HPF)一樣的染色結果，則可判斷該患者標本為抗酸染色陽性，如患者標本組織染色結果為陰性且陽性對照芯片中抗酸桿菌清楚豐富(>10條/HPF)，則可判斷該患者標本為抗酸染色陰性。如果陽性對照芯片未查見抗酸桿菌，則說明抗酸染色失敗，結果不可靠。如果陽性對照芯片中抗酸桿菌清楚、豐富，患者標本組織檢測結果為陰性，因為兩者的標本組織在同一切片上，染色處理過程相同，說明染色過程質量可信，患者標本組織檢測結果的陰性為真陰性，可避免以往抗酸染色可能因為染色失敗而導致的假陰性結果。

結 果

在抗酸染色時需要對對照陽性芯片進行測試，以確保對照陽性芯片無皺褶與脫片。對照陽性芯片(圖2)與待檢組織相鄰，界限清晰，易于閱片。并且不影響待檢組織染色，對照陽性芯片中抗酸桿菌染色陽性清楚，抗酸桿菌豐富。顯微鏡下觀察，對照陽性芯片排列規整，閱片者很容易相互參照查待檢組織內的染色狀況，可以根據陽性對照片的染色狀況判定待檢組織是否進行了正確的染色過程，并且可以參照已知的陽性對照片染色結果，給予待檢組織內是否為抗酸桿菌較為客觀的判讀。麗水市中心醫院病理科自2014年1月至2014年12月的186例患者抗酸染色均采用此方法，發現抗酸桿菌21例，陽性率為11.3%(21/186)。

左側為陽性對照芯片，右側為待檢組織圖2 抗酸染色結果模式圖 (Z-N抗酸染色 ×400)

討 論

我國是全球結核病高負擔國家，2000年第四次全國結核病流行病學抽樣調查顯示：我國有5.5億人感染結核分枝桿菌，活動性肺結核患者451萬例(患病率367/10萬)；菌陽肺結核患者196萬例；每年死亡患者約15萬例，是其他各種傳染病與寄生蟲病死亡總和的2倍[5]。正確及時診斷結核病可指導臨床后期用藥治療，而在組織中找到抗酸染色陽性菌是確診結核病的有力證據。在組織切片中抗酸染色檢出陽性菌的比率較低，對抗酸染色呈陰性的患者，其他補充檢測方法較少[6]。因此結核病診斷中抗酸染色的質量控制顯得十分重要。

結核病診斷中進行抗酸染色時，為了確保染色片的質量和判讀結果的準確性及可重復性，必須設立合理的對照，避免假陽性、假陰性結果，以及主觀判讀的不穩定性。而通常的抗酸染色一般沒有設立對照實驗，實驗過程中操作步驟的時間差異、試劑是否過期、試劑的用量或其他人為因素等存在差異，均可能影響結果的準確性，使得抗酸染色結果的判讀缺乏可靠性。因此，結核病診斷中設立抗酸染色陽性對照十分必要。

筆者運用組織芯片技術在結核病診斷抗酸染色時設立陽性對照具備以下優點：(1)待檢組織和對照芯片在同一張載玻片上，在相同條件下進行抗酸染色，保證了實驗條件的一致性，使結果更具可比性。(2)對照芯片面積很小，供體蠟塊被破壞程度小。同時抗酸染色切片歸檔保存時不需要另外單獨保存陽性對照切片，更有利于病理檔案管理。(3)對照芯片陽性對照結果有利于對染色過程的質量控制。(4)對照芯片排列規整，與待檢組織相鄰，界限清楚，方便診斷醫師閱片和查對。

總之，結核病診斷中抗酸染色設立陽性對照十分必要，手工自制對照陽性芯片方法簡單，花費成本低，實用性強，值得臨床推廣應用。

[1] 吳龍章,劉燕文,鐘炳棠.分枝桿菌的實驗室檢查與質量控制.中國防癆雜志，2014，36(4):286-289.

[2] 馬玙，朱莉貞，潘毓萱. 結核病. 北京：人民衛生出版社，2006：100-104．

[3] 周新華. 重視結核病的影像學分析與影像技術. 中國防癆雜志，2014，36(3):145-148.

[4] 趙天如，徐東明，楊晶，等. 抗酸染色陽性菌的辨認與假陽性異物的識別. 診斷病理學雜志，2003，10(2):121.

[5] 全國第五次結核病流行病學抽樣調查技術指導組,全國第五次結核病流行病學抽樣調查辦公室．2010年全國第五次結核病流行病學抽樣調查報告.中國防癆雜志,2012,34(8): 485-508.

[6] 胥維勇.氧化劑和表面活性劑在抗酸染色中的應用.臨床與實驗病理學雜志，2013，29(1)：103-104.

(本文編輯：郭萌)

《中國防癆雜志》協辦單位名單(名單順序按照協議簽署時間排列)

1.北京金之路醫藥科技有限公司

2.北京結核病控制研究所

3.山東省胸科醫院

4.武漢市結核病防治所

5.沈陽雙鼎制藥有限公司

6.西安市結核病胸部腫瘤醫院

7.深圳市龍華新區慢性病防治中心(精神衛生中心)

本刊編輯部

10.3969/j.issn.1000-6621.2015.05.017

323000 溫州醫科大學附屬第五醫院暨麗水市中心醫院病理科(方偉建、龔偉、朱憶凌、毛衛波、黃淵)；溫州醫科大學附屬第一醫院病理科(陳國榮)

陳國榮，Email：chengr1978@aliyun.com

2015-01-15)