冷馴化對(duì)中緬樹(shù)鼩褐色脂肪組織適應(yīng)性產(chǎn)熱的影響

高文榮，曹能，朱萬(wàn)龍，張浩，王政昆*，陳金龍

（1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2.云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；3.昆明市海口林場(chǎng)，昆明 650114)

研究報(bào)告

冷馴化對(duì)中緬樹(shù)鼩褐色脂肪組織適應(yīng)性產(chǎn)熱的影響

高文榮1，2△，曹能1，朱萬(wàn)龍1，張浩1，王政昆1*，陳金龍3△

（1.云南省高校西南山地生態(tài)系統(tǒng)動(dòng)植物生態(tài)適應(yīng)進(jìn)化及保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；2.云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，昆明 650500；3.昆明市海口林場(chǎng)，昆明 650114)

目的探討環(huán)境溫度對(duì)中緬樹(shù)鼩體重、褐色脂肪組織（BAT)產(chǎn)熱活性及解偶聯(lián)蛋白1含量的影響，為建立樹(shù)鼩肥胖模型提供理論依據(jù)。方法將40只體重相似的成年中緬樹(shù)鼩隨機(jī)分為5組（每組8只):對(duì)照組（0 d)，置于（25±1)℃，12 L/12 D條件下飼養(yǎng)；以及置于（5±1)℃，12 L/12 D條件下分別馴化7、14、21 d和28 d組。馴化結(jié)束后測(cè)定動(dòng)物的體重、非顫抖性產(chǎn)熱 （NST)、褐色脂肪組織重量以及解偶聯(lián)聯(lián)蛋白1（UCP1)的含量。結(jié)果與對(duì)照組（0 d)相比，冷馴化組中緬樹(shù)鼩的體重、NST、BAT重量以及UCP1含量都顯著增加，BAT顏色也明顯加深，冷馴化28 d后，體重增加了26.32%，NST增加了20.65%，BAT重量增加了53.85%，UCP1含量增加了43%。UCP1含量與BAT重量和NST顯著正相關(guān)。結(jié)論中緬樹(shù)鼩可能通過(guò)冷馴化誘導(dǎo)BAT組織增生和UCP1表達(dá)上調(diào)，從而增強(qiáng)BAT產(chǎn)熱活力以增加能量支出，推測(cè)BAT可能作為以能量學(xué)途徑治療肥胖的靶器官。

中緬樹(shù)鼩；冷馴化；非顫抖性產(chǎn)熱；褐色脂肪組織；解偶聯(lián)蛋白1；肥胖；產(chǎn)熱

肥胖是當(dāng)今世界人類身體健康所面臨的嚴(yán)重威脅，可導(dǎo)致一些危害人類身體健康的主要疾病風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，包括心血管疾病、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝、膽結(jié)石和某些癌癥[1］。肥胖主要是由于能量攝入與消耗之間不協(xié)調(diào)而出現(xiàn)大量白色脂肪組織（white adipose tissue，WAT)堆積的結(jié)果[2，3］。在人體中，由于過(guò)度飲食和很少鍛煉，出現(xiàn)肥胖是不可避免的。最近，美國(guó)FDA又取締了利莫那班和西布曲明，使得藥物治療受到很大的限制。因此，急需尋找治療肥胖的新方法[2，3］。以能量消耗，即生物能量學(xué)途徑治療肥胖是極富吸引力、也可能是最有效的途徑[4-6］。首先，就目前使用的各種藥物來(lái)看，幾乎沒(méi)有一種藥物能有效而無(wú)副作用地治療肥胖。第二，最近的研究結(jié)果證明了成年人體內(nèi)確實(shí)存在具有活性的褐色脂肪組織 （brown adipose tissue，BAT)，從而使得這種高能耗組織有可能成為治療肥胖的靶器官。第三，現(xiàn)在已經(jīng)證明增加能量消耗能夠非常有效地降低體重。例如，具有線粒體氧化作用的非特異性解偶聯(lián)劑2，4-二硝基苯酚（DNP)確實(shí)能在不產(chǎn)生耐藥性的情況下，顯著持續(xù)增加能量消耗，達(dá)到降低體重的目的[7］。但是，DNP會(huì)產(chǎn)生強(qiáng)烈的副作用，已經(jīng)被FDA禁止在臨床上使用。

哺乳動(dòng)物的脂肪組織主要分為兩種類型:白色脂肪組織（WAT)和褐色脂肪組織（BAT)[8，9］。WAT的主要功能是以甘油三酯的形式儲(chǔ)存多余的能量及分泌一些激素和細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)動(dòng)物的能量代謝。而B(niǎo)AT是非常特化的產(chǎn)熱組織，其主要功能是參與非顫抖性產(chǎn)熱（nonshivering thermogenesis，NST)和食物誘導(dǎo)性產(chǎn)熱 （diet-induced thermogenesis，DIT)，主要通過(guò)冷暴露或食物誘導(dǎo)而大量產(chǎn)熱消耗能量[10，11］。其產(chǎn)熱的機(jī)制是通過(guò)線粒體內(nèi)膜上的解偶聯(lián)蛋白-l（uncoupling protein-1，UCPl)將脂肪酸氧化與ATP產(chǎn)生解偶聯(lián)，把能量直接以熱量的形式散失而不生成ATP，即通過(guò)解偶聯(lián)作用消耗脂肪產(chǎn)生的熱量。長(zhǎng)期以來(lái)，盡管BAT在嚙齒動(dòng)物中終生存在，而一直認(rèn)為在人類中BAT只存在于新生兒中，并在1歲時(shí)就基本消失，在成人體中不存在或數(shù)量甚微而沒(méi)有明顯的生理意義[8］。然而最近采用監(jiān)測(cè)癌癥及癌癥轉(zhuǎn)移的氟化脫氧葡萄糖-正電子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層顯像技術(shù)（18F-fluorodeoxyglucose-positron emission tomographycomputed tomography，18F-FDG-PET/CT)并結(jié)合定位組織取樣進(jìn)行分子鑒定發(fā)現(xiàn)在成年人體內(nèi)的確存在有功能活性的BAT[12-14］，而且人體BAT的活性隨肥胖癥癥狀加重而顯著降低[12］。最近，研究證明了人體BAT確實(shí)具有NST能力[13，15］。從臨床內(nèi)分泌學(xué)的角度來(lái)看，如果能找出讓人體內(nèi)BAT大量增生的方法或顯著增強(qiáng)其活性，就很可能成為治療肥胖癥的有效途徑[4-6，16］。

中緬樹(shù)鼩（Tupaia belangeri)屬于攀鼩目（Scadentia)樹(shù)鼩科 （Tupaiidae)動(dòng)物，主要分布于南亞和東南亞，為東洋界特有的小型哺乳動(dòng)物，現(xiàn)生攀鼩目只有一個(gè)科，即樹(shù)鼩科，國(guó)內(nèi)僅有一種，即中緬樹(shù)鼩，主要分布于云南、廣西、貴州、四川及海南島等地，其中云南是其主要分布區(qū)[17］。樹(shù)鼩由于具有特殊的進(jìn)化地位，可以作為人類代謝性疾病動(dòng)物模型，因此在生物醫(yī)學(xué)上被廣泛采用為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。本文以中緬樹(shù)鼩為研究對(duì)象，測(cè)定了冷馴化條件下中緬樹(shù)鼩體重、NST、BAT重量以及UCP1含量的變化，并對(duì)UCP1含量與BAT重量和NST的關(guān)系進(jìn)行了研究。希望有助于深入理解動(dòng)物對(duì)環(huán)境溫度的適應(yīng)對(duì)策，同時(shí)也為基于BAT的生物能學(xué)途徑治療肥胖癥提供一些理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用人工繁育的F1代成年樹(shù)鼩40只，均為中緬樹(shù)鼩滇西亞種（Tupaia belangeri Chineses)，雄20只，雌20只，體重90～110 g，來(lái)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所醫(yī)學(xué)靈長(zhǎng)類中心【SCXK（滇) 2010-0003】，動(dòng)物飼養(yǎng)于不銹鋼籠具內(nèi)，自由攝食飲水，光照條件12L/12D，實(shí)驗(yàn)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所內(nèi)進(jìn)行【SYXK（滇)2010-0007】。按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則給予人道的關(guān)懷。

將40只中緬樹(shù)鼩隨機(jī)分成5組（每組8只):對(duì)照組（0 d)，置于（25±1)℃，12L/12D條件下飼養(yǎng)；以及置于（5±1)℃，12L/12D條件下分別馴化7、14、21、28 d組。馴化結(jié)束后測(cè)定動(dòng)物的體重和NST，之后斷頸處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，分離BAT，測(cè)定其重量及UCP1含量。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為成年非繁殖期個(gè)體。

1.2 NST

采用皮下注射去甲腎上腺素 （norepinephrine，NE)的方法誘導(dǎo) NST，并采用澳大利亞生產(chǎn)的ADML870型開(kāi)放式呼吸儀測(cè)定NST，用ADML206型氣體分析儀進(jìn)行氣體分析，用上海博迅醫(yī)療設(shè)備廠生產(chǎn)的SPX-300型人工氣候箱控制呼吸室溫度為熱中性區(qū)，溫差控制在 ±0.5℃以內(nèi)。呼吸室容積為760 mL，進(jìn)入呼吸室的氣體流量為200 mL/min。NE注射劑量的確定用濃度梯度法進(jìn)行預(yù)備實(shí)驗(yàn)，最終NE注射劑量經(jīng)預(yù)備實(shí)驗(yàn)確定為0.8 mg/kg BW。NST測(cè)定30 min，選取最大持續(xù)耗氧量作為動(dòng)物的NST[18］。

1.3 BAT重量及UCP1含量

將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物斷頸處死，迅速分離肩胛間及頸部?jī)蓚?cè)的BAT，稱重。UCP1含量采用Western blot技術(shù)測(cè)定，聚丙烯酰胺凝膠電泳中濃縮膠和分離膠的濃度分別為3%和12.5%。上樣量10μL（包含20 μg線粒體蛋白)。電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，將麗春紅檢測(cè)后的膜用封閉液1封閉（4℃過(guò)夜)，加入一抗 （兔抗倉(cāng)鼠UCP1，稀釋5000倍)，室溫2 h，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔Ig C，稀釋5000倍)，室溫1 h，采用ECL熒光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)UCP1蛋白的熒光帶[19］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)處理。體重和BAT重量采用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)或單因素方差（One-way ANOVA)分析；NST和UCP1含量采用單因素協(xié)方差 （One-way ANCOVA)分析 （體重為協(xié)變量)；組間差異性用多組比較（Duncan)分析；UCP1含量與BAT重量和NST的關(guān)系采用Pearson相關(guān)分析。結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示（±s)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 體重

如圖1所示，實(shí)驗(yàn)前兩組動(dòng)物體重差異無(wú)顯著性（t=-4.33，P＞0.05)，隨著冷馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，中緬樹(shù)鼩體重逐漸增加，與對(duì)照組 （0 d)相比，冷馴化14 d時(shí)體重變化達(dá)到顯著水平（P＜0.05)，21 d時(shí)差異有顯著性（F=12.414，P＜0.01)，28 d時(shí)，體重增加了26.32%；對(duì)照組體重沒(méi)有顯著的變化（P＞0.05)。

圖1 中緬樹(shù)鼩冷馴化過(guò)程中體重的變化Fig.1 Changes of body mass in the Tupaia belangeri during cold acclimation

2.2 非顫抖性產(chǎn)熱（NST）

實(shí)驗(yàn)前兩組動(dòng)物的NST差異無(wú)顯著性 （t= 0.356，P＞0.05)，隨著冷馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，中緬樹(shù)鼩的NST逐漸增加，與對(duì)照組（0 d)相比差異有顯著性（F=5.248，P＜0.01)，14 d時(shí)達(dá)到顯著水平（P＜0.05)，21 d時(shí)達(dá)到極顯著水平 （P＜0.01)，28 d時(shí)，NST比對(duì)照組（0 d)增加了20.65%（圖2)。

圖2 冷馴化對(duì)中緬樹(shù)鼩非顫抖性產(chǎn)熱（NST)的影響Fig.2 The effects of cold acclimation on NST in the Tupaia belangeri

2.3 BAT重量

中緬樹(shù)鼩BAT重量隨著冷馴化時(shí)間的延長(zhǎng)而顯著增加，14 d時(shí)達(dá)到顯著水平 （P＜0.05)，21 d時(shí)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01)，28 d時(shí)，BAT重量比對(duì)照組（0 d)增加了53.85% （表1)；同時(shí)其顏色明顯加深（圖3)；冷馴化過(guò)程中BAT相對(duì)重量無(wú)顯著變化（P＞0.05)（表1)。

圖3 冷馴化對(duì)中緬樹(shù)鼩褐色脂肪組織（BAT)形態(tài)的影響Fig.3 Effects of cold acclimation on themorphology of BAT in the Tupaia belangeri

表1 冷馴化時(shí)間對(duì)中緬樹(shù)鼩褐色脂肪組織（BAT)重量的影響Tab.1 Effects of cold acclimation on body mass of BAT in the Tupaia belangeri

2.4 解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）含量

冷馴化極顯著影響中緬樹(shù)鼩BAT中UCP1的含量（F=6.705，P＜0.01)，隨著冷馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，UCP1含量逐漸增加，14 d時(shí)達(dá)到顯著水平 （P＜0.05)，21 d時(shí)達(dá)到極顯著水平（P＜0.01)，28 d時(shí)比對(duì)照組（0 d)增加了43% （圖4)。

2.5 UCP1含量與BAT重量和NST的關(guān)系

UCP1含量與BAT重量 （圖5A)和 NST（圖5B)顯著正相關(guān)（BAT:r=0.518，P＜0.001；NST:r =0.564，P＜0.001)。

3 討論

3.1 體重的變化

圖4 冷馴化對(duì)中緬樹(shù)鼩褐色脂肪組織（BAT)中解偶聯(lián)蛋白1（UCP1)含量的影響Fig.4 Effects of cold acclimation on UCP1 content of BAT in the Tupaia belangeri

在冷馴化過(guò)程中，中緬樹(shù)鼩的體重不能維持恒定:隨著馴化時(shí)間的延長(zhǎng)，中緬樹(shù)鼩的體重呈現(xiàn)逐漸增加的趨勢(shì)（圖1)。冷馴化14 d時(shí)，與對(duì)照組 （0 d)相比差異顯著，28 d后體重比對(duì)照組增加了26.32%。這種變化趨勢(shì)與同地區(qū)的嚙齒類動(dòng)物大絨鼠 （Eothenomys miletus)和高山姬鼠 （Apodemus chevrieri)不同，后兩種嚙齒類動(dòng)物在冷馴化28 d后體重比對(duì)照組 （0 d)分別減少16.05%和11.01%[20］，而且與黑線毛足鼠 （Phodopus sungorus)、鼩鼱屬（Sorex)的大多數(shù)種類等典型北方小型哺乳動(dòng)物在冬季或冷馴化條件下體重降低[21］的趨勢(shì)也不同，但與環(huán)頸旅鼠 （Dicrostonyx groenlandicus)和金色倉(cāng)鼠 （Mesocricetus auratus)在低溫脅迫下體重的變化一致[22］。

圖5 冷馴化過(guò)程中中緬樹(shù)鼩UCP1含量與BAT重量（A)和NST（B)的關(guān)系Fig.5 The relationship between UCP1 content and BAT mass（A)and NST（B)in the Tupaia belangeri during cold acclimation

在低溫脅迫下，中緬樹(shù)鼩體重增加可減少相對(duì)體表面積，降低熱傳導(dǎo)，進(jìn)一步增強(qiáng)低溫適應(yīng)能力。由于中緬樹(shù)鼩散熱能力比產(chǎn)熱能力強(qiáng)[23］，通過(guò)增加體重、使其在增加產(chǎn)熱相對(duì)不多的條件下，減少散熱，這對(duì)其生存具有重要的適應(yīng)意義。體重變化取決于能量攝入和能量消耗的平衡[24］，動(dòng)物體重的增加與攝食量的增加也密切有關(guān)。

3.2 NST、BAT重量和UCP1含量的變化

冷脅迫情況下，NST在提高小型哺乳動(dòng)物產(chǎn)熱能力方面具有重要作用[25］。許多小型哺乳動(dòng)物受到低溫刺激時(shí)，NST都迅速增加[26］。如根田鼠（Microtus oeconomus)在5℃馴化21 d后，NST比對(duì)照組（23℃)增加32%[25］。在冷馴化過(guò)程中，中緬樹(shù)鼩NST隨著冷馴化時(shí)間的延長(zhǎng)也顯著增加，14 d達(dá)到顯著水平，21 d達(dá)到極顯著水平，馴化28 d后，NST比對(duì)照組增加20.65%，比根田鼠冷馴化下增加的NST要小。我們發(fā)現(xiàn)，中緬樹(shù)鼩BAT重量和UCP1含量均受冷馴化的影響。與對(duì)照組 （0 d)相比，冷馴化28 d后，BAT重量增加了53.85%，UCP1含量增加了43%。BAT是NST的主要發(fā)生部位，產(chǎn)熱能力的增加，伴隨著B(niǎo)AT結(jié)構(gòu)的改變和氧化能力的增強(qiáng)[27］。而B(niǎo)AT的產(chǎn)熱能力主要依賴于其線粒體內(nèi)膜上的UCP1，UCP1表達(dá)增加是BAT產(chǎn)熱能力增強(qiáng)的主要分子機(jī)制[10，28］。UCP1基因水平的調(diào)節(jié)在UCP1含量和 BAT產(chǎn)熱調(diào)節(jié)中起著決定作用，是BAT產(chǎn)熱生理調(diào)節(jié)的中心[29］。此外，UCP1含量與BAT重量和NST的能力存在著顯著的正相關(guān)，說(shuō)明UCP1是中緬樹(shù)鼩NST能力的分子基礎(chǔ)，故UCP1在產(chǎn)熱過(guò)程中很可能經(jīng)歷正向選擇，抵抗肥胖。

綜上所述，BAT是消耗能量的組織，激活BAT可增加能量支出，具有潛在抵抗肥胖的作用。且近年來(lái)，樹(shù)鼩因它在生理生化及解剖學(xué)等生物學(xué)特性方面與人類有著相似之處，正日益受到國(guó)內(nèi)外的關(guān)注，成為一種新型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物[30，31］。從臨床內(nèi)分泌學(xué)的角度來(lái)看，如果能找出讓人體內(nèi)BAT大量增生的方法或顯著增強(qiáng)其活性，就很可能成為治療肥胖癥的有效途徑，因此BAT可能作為能量學(xué)途徑治療肥胖的靶器官。

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Adaptive thermogenesis of the brown adipose tissue in tree shrews（Tupaia belangeri)during cold acclimation

GAOWen-rong1，2Δ，CAO Neng1，ZHUWan-long1，ZHANG Hao1，WANG Zheng-kun1*，CHEN Jin-long3Δ
（1.Key Laboratory of Ecological Adaptive Evolution and Conservation of Animals-Plants in SouthwestMountain Ecosystem of University in Yunnan Province，School of Life Science，Yunnan Normal University，Kunming 650500，China；2.School of Energy and Environmental Science，Yunnan Normal University，Kunming 650500；3.Haikou Forest Farm of Kunming，Kunming 650114)

ObjectiveTo investigate the effectof ambient temperature on bodymass，thermogenic activity and uncoupling protein-1（UCP1)content of brown adipose tissue（BAT)in tree shrews（Tupaia belangeri)，and to provide theoretical basis for establishing tree shrewsmodel of obesity.M ethodsForty healthy adult tree shrews with similar body masswere uesd in our experiment.The tree shrews were divided into five groups（n=8):control group（0 d)，the animals weremaintained under 25±1℃ and 12L:12D（light:dark，lights on 08:00)photoperiod；and the animals were maintained under 5±1℃ and 12L:12D photoperiod for 7 d，14 d，21 d and 28 d groups，respectively.At the end of experiment，the changes of bodymass，nonshivering thermogenesis（NST)，BATmass and uncoupling protein 1（UCP1)contentwere determined.ResultsCompared with the control group（0 d)，the bodymass，NST，BATmass and UCP1 content of the cold acclimation groupswere improved significantly，the BAT color also obviously deepened，and after cold acclimation for 28 d，the bodymass，NST，BATmass and UCP1 contentwere increased by 26.32%，20.65，53.85%and 43%，respectively.Apparently，the UCP1 content was significantly positively correlated with BAT mass and NST.ConclusionsBAT proliferation may be induced and UCP1 expression upregulated by cold acclimation in Tupaia belangeri，therefore，en-hancing the thermogenic activity of brown adipose tissue to increase energy expenditure.We would speculate that BAT might be used as a target organ for treatment of obesity by energetic approach in the future.

Tupaia belangeri chinensis；Cold acclimation；Nonshivering thermogenesis（NST)；Brown adipose tissue（BAT)；Uncoupling protein 1（UCP1)；Obesity；Thermogenesis

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0567-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.004

2015-07-03

國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目子課題（編號(hào):2014BAI01B01-06)；國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)項(xiàng)目 （編號(hào):2014DFR31040)；國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào):No.31360096)；云南省博士研究生學(xué)術(shù)新人獎(jiǎng)資助。

高文榮（1987-)，男，博士研究生，研究方向:動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)。E-mail:gaowenrong2012@163.com。△陳金龍為并列第一作者。

王政昆（1959-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向:動(dòng)物生理生態(tài)學(xué)。E-mail:wang_123@163.com。