食蟹猴SPF種群建立過程中病毒抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

王宏，韋秋獎(jiǎng)

（1.云南中科靈長(zhǎng)類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650550；2.昆明亞靈生物科技有限公司，昆明 650550；3.昆明理工大學(xué)靈長(zhǎng)類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，昆明 650500)

研究報(bào)告

食蟹猴SPF種群建立過程中病毒抗體的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

王宏1，3，韋秋獎(jiǎng)1，2

（1.云南中科靈長(zhǎng)類生物醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，昆明 650550；2.昆明亞靈生物科技有限公司，昆明 650550；3.昆明理工大學(xué)靈長(zhǎng)類轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院，昆明 650500)

目的調(diào)查從老撾引種的食蟹猴BV、SRV、SIV和STLV-1四項(xiàng)病毒抗體陽(yáng)性、可疑的比例，并對(duì)SPF種群建立過程中四項(xiàng)病毒的動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)，進(jìn)而比較普通種群和SPF種群幼猴病毒抗體的陽(yáng)性率。方法采用專用試劑盒對(duì)四項(xiàng)病毒進(jìn)行連續(xù)監(jiān)測(cè)并進(jìn)行比較分析。結(jié)果引種的1998只食蟹猴，BV抗體陽(yáng)性比例高達(dá)52.35%，可疑比例為8.31%，抗體陰性的比例僅為39.34%；SRV和STLV-1抗體陽(yáng)性率分別為7.45%和8.56%；未檢測(cè)出SIV抗體陽(yáng)性或可疑的食蟹猴。經(jīng)過篩選后組建的SPF種群，2010年監(jiān)測(cè)的BV、SRV和STLV-1三項(xiàng)病毒抗體陽(yáng)性率分別為5.24%、1.01%和0.4%，經(jīng)過連續(xù)5年的不斷篩選和淘汰，截至2014年年底三種病毒抗體陽(yáng)性率分別下降至0.82%、0.27%和0.27%，未監(jiān)測(cè)出SIV抗體陽(yáng)性或可疑的食蟹猴。普通群繁殖幼猴B病毒抗體陽(yáng)性的比例為9.71%，可疑率為1.85%；而SPF繁殖種群B病毒抗體陽(yáng)性率僅為0.22%。結(jié)論連續(xù)監(jiān)測(cè)病毒抗體并不斷淘汰抗體陽(yáng)性和可疑的動(dòng)物對(duì)組建SPF食蟹猴種群具有重要的生產(chǎn)意義。

食蟹猴；SPF種群；BV抗體；SRV抗體；STLV-1抗體；SIV抗體；抗體監(jiān)測(cè)

非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物是人類的近親，與人的遺傳相似性極高，具有許多與人類類似的生物學(xué)和行為學(xué)特征，在組織結(jié)構(gòu)、生殖生理學(xué)、解剖學(xué)上與人類高度相似[1，2］。近年來，隨著生命科學(xué)的快速發(fā)展，對(duì)非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物的需求一直在持續(xù)增加，擴(kuò)大非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物種群數(shù)量，獲得高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化的非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物已成為我國(guó)科學(xué)研究進(jìn)一步發(fā)展的迫切需求。目前，國(guó)際上對(duì) SPF（specific pathogen free)級(jí)獼猴的定義主要是指動(dòng)物體內(nèi)不含猴B病毒（cercopithecine herpesvirus type I，BV)，猴免疫缺陷病毒（simian immunodeficiency virus，SIV)，猴T細(xì)胞趨向性病毒 I型（simian T lymphotropic virus type I，STLV-1)，猴逆轉(zhuǎn)D型病毒（simian retrovirus，SRV)和猴痘病毒（simian pox virus，SPV)等幾種特定病毒的獼猴。由于非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物可能會(huì)自然攜帶或感染多種病毒，因此在建立SPF種群的過程中對(duì)病毒抗體的監(jiān)測(cè)就顯得極其重要，并直接影響建群的成功率。本研究對(duì)昆明某猴場(chǎng)的食蟹猴進(jìn)行了長(zhǎng)期、大規(guī)模的病毒監(jiān)測(cè)，在此基礎(chǔ)上不斷地篩選和剔除病毒抗體陽(yáng)性和可疑的動(dòng)物，從而穩(wěn)定SPF種群的建立，進(jìn)一步促進(jìn)我國(guó)SPF級(jí)非人靈長(zhǎng)類實(shí)驗(yàn)動(dòng)物事業(yè)的發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及樣本收集

供試食蟹猴于2009年均從老撾引種至昆明亞靈生物科技有限公司【SCXK（滇)2010-0001】。其中雄性食蟹猴998只，雌性食蟹猴1000只，年齡均在3～5歲之間。2009年SPF食蟹猴初始種群建立時(shí)，對(duì)BV、SRV、SIV和STLV-1 4種病毒進(jìn)行連續(xù)4次的病毒抗體檢測(cè)，每次間隔時(shí)間2個(gè)月。從2010年、2011年、2012年、2013年和2014年，每年兩次對(duì)動(dòng)物檢測(cè)BV、SRV、SIV和STLV-1 4種病毒，間隔時(shí)間為每6個(gè)月一次【SYXK（滇)2010-0001】。食蟹猴飼養(yǎng)的設(shè)施及管理規(guī)范已通過國(guó)際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物評(píng)估和認(rèn)可委員會(huì)（AAALAC International)的完全認(rèn)證。

1.2 被檢血清

靜脈采集全血2 mL，靜置30 min后離心（3000 r/min×15 min，室溫)，分離血清靜置于4℃待檢，若長(zhǎng)期保存，需置于-40℃冰箱冷凍保存。

1.3 檢測(cè)試劑盒

猴5項(xiàng)病毒斑點(diǎn)免疫檢測(cè)試劑盒均從VRL Laboratories（USA)購(gòu)買，實(shí)驗(yàn)操作步驟按照試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 結(jié)果判定

根據(jù)試劑盒說明判斷病毒抗體陽(yáng)性、可疑和陰性，可疑結(jié)果經(jīng)過1個(gè)月后重新采樣復(fù)檢予以確認(rèn)。

2 結(jié)果

2.1 引進(jìn)初始種群時(shí)病毒抗體檢測(cè)結(jié)果

對(duì)2009年從老撾引種的食蟹猴，經(jīng)連續(xù)進(jìn)行4次病毒抗體檢測(cè)后，結(jié)果顯示，在1998只動(dòng)物中，BV抗體陽(yáng)性食蟹猴總比例高達(dá)52.35%，其中僅B病毒抗體陽(yáng)性的食蟹猴比例為48.95%，同時(shí)檢測(cè)出BV和SRV抗體陽(yáng)性的比例為1.30%，BV和STLV-1抗體同時(shí)表現(xiàn)陽(yáng)性的比例為1.50%，同時(shí)檢測(cè)出BV、SRV和STLV-1 3種病毒抗體均為陽(yáng)性的食蟹猴比例為 0.60%；BV抗體可疑的比例為8.31%，而在引進(jìn)的1998只食蟹猴中，BV抗體檢測(cè)為陰性的比例僅為39.34%。在檢測(cè)的血清樣本中，SRV和 STLV-1抗體陽(yáng)性率分別為7.45%和8.56%。通過血清樣本檢測(cè)，未檢測(cè)出SIV抗體陽(yáng)性或可疑的動(dòng)物，具體檢測(cè)結(jié)果見表1和圖1。

2.2 BV抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，BV抗體陽(yáng)性食蟹猴數(shù)量每年呈逐漸下降的趨勢(shì)，2010年BV抗體陽(yáng)性率和可疑率分別為5.24%和1.61%，截至2014年年底，BV抗體陽(yáng)性率僅為0.82%，BV抗體可疑動(dòng)物比例僅為0.55%，具體檢測(cè)結(jié)果見表2。

2.3 SRV抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，SRV抗體陽(yáng)性動(dòng)物數(shù)量從2010～2014年每年呈逐漸下降的趨勢(shì)，2010年SRV抗體陽(yáng)性的食蟹猴為5只，陽(yáng)性率為1.01%，SRV抗體可疑的食蟹猴為3只，可疑率為0.60%，截至2014年年底，SRV抗體陽(yáng)性的食蟹猴僅為1只，SRV抗體可疑食蟹猴也僅有1只，具體檢測(cè)結(jié)果見表3。

2.4 STLV-1抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果

結(jié)果顯示，STLV-1抗體陽(yáng)性動(dòng)物數(shù)量從2010～2014年的變化趨勢(shì)不明顯，2010年STLV-1抗體陽(yáng)性的食蟹猴有2只，而2014年STLV-1抗體陽(yáng)性的食蟹猴仍然有1只。具體檢測(cè)結(jié)果見表4。

表1 引進(jìn)初始種群時(shí)病毒抗體檢測(cè)結(jié)果Tab.1 Results of virus antibody test of the introduced initialmonkey population

圖1 引進(jìn)初始種群時(shí)病毒抗體陽(yáng)性與可疑率Fig.1 Positive and suspicion rate of virus antibody of the introduced initialmonkey population

表2 BV抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab.2 Results of dynamic monitoring of BV antibody

表3 SRV抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab.3 Results of dynamic monitoring of SRV antibody

表4 STLV-1抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab.4 Results of dynamicmonitoring of STLV-1 antibody

2.5 SIV抗體動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)結(jié)果

從2009年引種至2014年年底，每年均按程序?qū)κ承泛镞M(jìn)行SIV抗體監(jiān)測(cè)，結(jié)果顯示，均未檢測(cè)出SIV抗體陽(yáng)性或可疑的食蟹猴。

2.6 SPF種群與普通種群自繁幼猴病毒抗體比較

從2009年初步建立SPF種群后，于2012年開始配種繁殖，根據(jù)2012年、2013年和2014年的繁殖情況分析，普通種群共繁殖865只幼猴，SPF種群共繁殖462只幼猴，幼猴斷奶時(shí)間為5～8個(gè)月，幼猴斷奶時(shí)采集血樣并對(duì)病毒抗體進(jìn)行檢測(cè)。病毒抗體檢測(cè)結(jié)果表明，普通種群繁殖的幼猴中，BV抗體陽(yáng)性的幼年食蟹猴共84只，陽(yáng)性率為9.71%，BV抗體可疑動(dòng)物16只，可疑率為1.85%；而檢測(cè)SPF繁殖種群的462只幼猴發(fā)現(xiàn)只有1只幼猴檢測(cè)BV抗體表現(xiàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率僅為0.22%，未發(fā)現(xiàn)BV抗體可疑的動(dòng)物。同時(shí)對(duì)SPF種群與普通種群自繁幼猴病毒檢測(cè)中均未發(fā)現(xiàn)SRV、SIV、STLV-1抗體陽(yáng)性或可疑的動(dòng)物，結(jié)果見表5。

表5 SPF種群與普通種群幼猴病毒抗體比較Tab.5 Comparison of virus antibody in the babymonkeys of the common and SPF populations

3 討論

本研究涉及食蟹猴數(shù)量較多，時(shí)間跨度大，年齡段較為集中，從最初組建SPF種群的檢測(cè)結(jié)果來看，BV抗體陰性的食蟹猴比例僅為39.34%，抗體可疑的比例為 8.31%，而 BV抗體陽(yáng)性率高達(dá)52.35%，略高于趙國(guó)明等[3］調(diào)查顯示來自廣西各野生動(dòng)物保護(hù)區(qū)食蟹猴B病毒相關(guān)抗體陽(yáng)性率49.8%，但低于韋毅等[4］報(bào)道的野外捕獲混養(yǎng)食蟹猴B病毒83.4%的陽(yáng)性率，數(shù)據(jù)表明BV在食蟹猴養(yǎng)殖中普遍存在且病毒抗體陽(yáng)性率高。

對(duì)2009年引種的食蟹猴進(jìn)行連續(xù)4次檢測(cè)統(tǒng)計(jì)，SRV和STLV-1抗體陽(yáng)性率分別為7.45%和8.56%，SRV和STLV-1抗體陽(yáng)性率分別高于楊凈思等[5］報(bào)道的恒河猴SRV和STLV-1的抗體陽(yáng)性率（分別為5.36%和5.95%)，也高于饒軍華等[6］報(bào)道食蟹猴的STLV-1抗體5.4%的陽(yáng)性率，但低于周亞敏等[7］報(bào)道食蟹猴STLV-1抗體14.9%的陽(yáng)性率及SRV抗體18.1%的陽(yáng)性率，經(jīng)過篩選后組建的SPF種群，在2010年檢測(cè)的BV、SRV和STLV-1抗體陽(yáng)性率分別為5.24%、1.01%和0.4%，經(jīng)過連續(xù)5年的不斷篩選和淘汰，BV、SRV和STLV-1抗體陽(yáng)性率在2014年年底分別下降至0.82%、0.27%和0.27%，說明連續(xù)監(jiān)測(cè)病毒抗體并不斷淘汰抗體陽(yáng)性和可疑的動(dòng)物對(duì)組建SPF食蟹猴種群具有重要意義。

通過對(duì)SPF種群與普通種群自繁幼猴病毒抗體比較分析發(fā)現(xiàn)，普通種群繁殖的幼猴中，BV抗體陽(yáng)性的幼年食蟹猴共84只，陽(yáng)性率為9.71%，可疑率為1.85%，其中原因可能與幼猴從出生到離乳期間，生存的環(huán)境中都是BV抗體陽(yáng)性或可疑猴，增加了感染機(jī)率；而檢測(cè)SPF繁殖種群的462只幼猴發(fā)現(xiàn)只有1只幼猴檢測(cè)BV抗體表現(xiàn)陽(yáng)性，陽(yáng)性率僅為0.22%，未發(fā)現(xiàn)BV抗體可疑的動(dòng)物，說明了在SPF食蟹猴種群的建立過程中，定期對(duì)動(dòng)物病毒進(jìn)行監(jiān)測(cè)，隔離陽(yáng)性和可疑的動(dòng)物，對(duì)提高食蟹猴的質(zhì)量具有重要意義，同時(shí)也表明了SPF種群建立對(duì)生產(chǎn)SPF幼猴具有顯著的意義。

李常挺等[8］報(bào)道過野生獼猴SIV抗體全部呈陰性，本文通過對(duì)食蟹猴SIV抗體的連續(xù)監(jiān)測(cè)，也均未發(fā)現(xiàn)SIV抗體陽(yáng)性或可疑的食蟹猴，提示從老撾引種的食蟹猴不攜帶SIV。

通過對(duì)老撾引種的食蟹猴病毒抗體的監(jiān)測(cè)結(jié)果提示，我國(guó)在引進(jìn)食蟹猴時(shí)，應(yīng)該注意:（1)重視加強(qiáng)對(duì)食蟹猴BV、SRV、STLV-1抗體的監(jiān)測(cè)；（2)通過數(shù)據(jù)顯示，應(yīng)盡量引進(jìn)年幼的動(dòng)物，這與劉歡等[9］的研究結(jié)果一致。

現(xiàn)有的研究結(jié)果普遍認(rèn)為靈長(zhǎng)類動(dòng)物病毒的主要傳播途徑包括打斗、撕咬、性交等，母猴垂直傳播給仔猴幾率極低[10，11］，同時(shí)韋秋獎(jiǎng)[12］對(duì)137份 B病毒陰性群自繁1歲以上的幼猴血清進(jìn)行檢測(cè)，沒有發(fā)現(xiàn)B病毒抗體呈陽(yáng)性。因此在靈長(zhǎng)類動(dòng)物日常飼養(yǎng)過程中，除了加大對(duì)陽(yáng)性和可疑動(dòng)物監(jiān)測(cè)和淘汰力度外，必須加強(qiáng)防御措施，包括飼養(yǎng)環(huán)境的標(biāo)準(zhǔn)化、不斷完善檢疫制度以及人員的管理等。首先，引進(jìn)靈長(zhǎng)類動(dòng)物時(shí)，必須隔離檢疫，檢測(cè)合格后方可進(jìn)入飼養(yǎng)區(qū)；其次，按飼養(yǎng)目的的不同，采取分群飼養(yǎng)管理，加強(qiáng)對(duì)食物和飼養(yǎng)環(huán)境的消毒，發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性和可疑動(dòng)物嚴(yán)格隔離處理。第三，建立完善的檢疫制度，定期對(duì)整個(gè)猴群進(jìn)行病毒抗體的檢測(cè)，嚴(yán)格淘汰陽(yáng)性和可疑動(dòng)物，逐漸建立SPF種群。

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Djnam ic monitoring of virus antibodj during the establishment of SPF cjnomolgusmonkej population

WANG Hong1，3，WEIQiu-jiang1，2
（1.Yunnan Key Laboratory of Primate Biomedical Research，Kunming 650550，China；2.Kunming Biomed International，Kunming 650550；3.Institute of Primate Translational Medicine，Kunming University of Science and Technology，Kunming 650500)

ObjectiveTo investigate the positive and suspicious rates of BV，SRV，SIV and STLV-1 antibody of the cynomolgusmonkeys introduced from Laos，dynamicmonitoring of virus antibody during the establishmentof SPF cynomolgusmonkey population，and then comparing the positive rate of virus antibody in the babymonkeys between the common with SPF populations.MethodsContinuousmonitoring four kinds of virus in themonkeys was carried out using special reagent kits and analyzed the data.ResultsIn the introduced cynomolgusmonkeys（n=1998)，the positive rate of BV antibody was 52.35%，suspicious rate of BV antibody was 8.31%，and negative rate of BV antibody was only 39.34%，the positive rates of SRV and STLV-1 antibody were 7.45%and 8.56%，respectively，and positive or suspicious SIV antibody in the cynomolgusmonkeyswas not detected.After screening and establishment of the SPF population，the positive rates of BV，SRV and STLV-1 antibody were 5.24%，1.01%and 0.4%，respectively，in the year 2010.Then after five years of screening and elimination，by the end of 2014，the positive rates of BV，SRV and STLV-1 antibodies were 0.82%，0.27%and 0.27%，respectively，and positive or suspicious SIV antibody in the cynomolgusmonkeyswas notdetected.The BV antibody positive rate of the babymonkeyswas 9.71%and the suspicious rate was 1.85%in the commonpopulation，but only 0.22%of the baby monkeys in the SPF population.ConclusionsContinuousmonitoring virus antibodies and eliminating positive and suspicious animals have important significance in the establishmentofa SPF cynomolgus monkey population.

Cynomolgusmonkey；SPF population；BV antibody；SRV antibody；STLV-1 antibody；SIV antibody；Antibodymonitoring

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0573-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.005

2015-07-23

云南省技術(shù)創(chuàng)新人才項(xiàng)目（編號(hào):2014HB090)；昆明市科技計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào):2014-04-A-S-02-3074)；云南省技術(shù)創(chuàng)新項(xiàng)目（編號(hào):2015XA33)。

王宏（1975-)，男，碩士，副研究員，研究方向:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)與人類疾病動(dòng)物模型研究。Email:wangh@kbimed.com