低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩死亡后臟器中激素水平影響

俞發(fā)榮，張璟，郭麗蓉，俞文，連秀珍，謝明仁，李登樓，張?jiān)娝?/p>

（1.甘肅政法學(xué)院甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，蘭州 730000)

研究報(bào)告

低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩死亡后臟器中激素水平影響

俞發(fā)榮1，張璟2*，郭麗蓉1，俞文1，連秀珍1，謝明仁1，李登樓1，張?jiān)娝?

（1.甘肅政法學(xué)院甘肅省證據(jù)科學(xué)技術(shù)研究與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，蘭州 730070；2.甘肅省疾病預(yù)防控制中心，蘭州 730000)

目的探索低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩死亡后臟器中激素水平的影響。方法給予中國(guó)樹鼩低頻電刺激，分別于死亡后0、3、6、12、18、24、36 h和72 h取甲狀腺、肝、脾，用放射免疫法測(cè)定內(nèi)皮素（endothelin，ET)、心鈉素（atrial natriuretic factor，ANF)、血栓素（thromboxane，TX)水平；剝?nèi)∷篮? h中國(guó)樹鼩中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（ventral tegmental area，VTA)檢測(cè)c-fos表達(dá)。結(jié)果 電刺激后，中國(guó)樹鼩尸體臟器中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平比對(duì)照組顯著升高，其水平隨死亡后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低；VTA c-fos表達(dá)明顯增強(qiáng)。結(jié)論低頻電刺激能引起中國(guó)樹鼩臟器中激素的合成、釋放和腦組織c-fos表達(dá)。

中國(guó)樹鼩；尸體；臟器；激素；c-fos表達(dá)

中國(guó)樹鼩個(gè)體小，進(jìn)化程度高，新陳代謝比犬、鼠等動(dòng)物更接近于人，屬低等靈長(zhǎng)類動(dòng)物。中國(guó)樹鼩對(duì)外界環(huán)境刺激較其他動(dòng)物敏感，是研究外界環(huán)境因素與生物體間相互作用及其機(jī)制較理想的動(dòng)物[1］。社會(huì)環(huán)境壓力能引起機(jī)體激素水平的變化[2］，甚至導(dǎo)致組織器官損傷。猝死或暴力致死、或其他原因死亡的法醫(yī)病理學(xué)死亡時(shí)間的推斷是法醫(yī)病理鑒定實(shí)踐中的難點(diǎn)[3］。給予中國(guó)樹鼩低頻電刺激后，檢測(cè)臟器中激素含量和腦組織c-fos表達(dá)的變化，為進(jìn)一步研究外界環(huán)境因素與人們的社會(huì)行為和行為方式以及疾病（如不育癥、心、腦血管病猝發(fā)、抑郁癥、精神神經(jīng)病等)的產(chǎn)生與發(fā)展的關(guān)系以及法醫(yī)病理學(xué)推斷死亡時(shí)間提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

中國(guó)樹鼩（滇西亞種，Tupaia belangeri chinensis) 20只，雄性，體重120～125 g，購于中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所【SCXK（滇)K2013-0003】。飼養(yǎng)于甘肅政法學(xué)院SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室【SYXK（甘)2010-0002】。

1.1.2 試劑與儀器

放免診斷藥盒購于北京北方生物技術(shù)研究所；cfos免疫組化檢測(cè)試劑盒，購于武漢博士德生物有限公司。GC-1200γ計(jì)數(shù)放免儀（美國(guó)Picker公司)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物處理

選取中國(guó)樹鼩20只（雄性)，飼養(yǎng)適應(yīng)7 d，隨機(jī)分為2組，每組10只，在飼育籠（250 cm ×150 cm ×150 cm連接50 cm ×30 cm ×20 cm休息室)內(nèi)飼養(yǎng)，每籠5只。電刺激組:給予脈沖直流電刺激，電壓8 V，電流強(qiáng)度5 mA，頻率20 Hz，脈沖寬度0.3 ms，3次，每次3 s，刺激間隔時(shí)間1/3 s，連續(xù)刺激7 d。對(duì)照組:正常飼養(yǎng)。第8天，全部動(dòng)物用乙醚吸入麻醉，死亡后置于室外露天環(huán)境下。

1.2.2 取樣

在中國(guó)樹鼩死亡后0、3、6、12、18、24、36 h和72 h取各組動(dòng)物的甲狀腺、肝、脾各5 mg，分別放入研磨器，加0.5 mL生理鹽水研磨成勻漿，倒入離心管，再加0.5 mL生理鹽水沖洗研磨器，合并入離心管，用低速冷凍離心機(jī)3500 r/min，離心10 min，取上清液冷凍（-70℃)備用；剝?nèi)∷篮? h中國(guó)樹鼩腦干，用4%多聚甲醛-1.25%戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.4)固定，參考中緬樹鼩廣西獼猴腦立體定位圖譜，切取中腦腹側(cè)背蓋區(qū) （ventral tegmental area，VTA)，常規(guī)酒精梯度脫水，石蠟包埋、切片，片厚為5μm。將切片貼于經(jīng)粘附劑（鉻礬-明膠)處理過的干凈載玻片上，烤干后室溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 激素含量檢測(cè)

分別取上述凍存液，按放免診斷藥盒說明操作，用放射免疫γ-計(jì)數(shù)器測(cè)定。

1.2.4 c-fos表達(dá)檢測(cè)

將處理好的石蠟切片常規(guī)脫蠟，按c-fos檢測(cè)說明書操作，光鏡觀察，顯微拍照并進(jìn)行圖像分析。

1.2.5 圖像分析

用YA-G5000系列醫(yī)學(xué)細(xì)胞影像分析軟件進(jìn)行圖像拍照及其分析。從每組切片中各選5張形態(tài)典型對(duì)應(yīng)切面，測(cè)量積分吸光度（integral optical density，IOD)、平均吸光度（average optical density，AOD)。

1.2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

動(dòng)物死亡后不同時(shí)間激素含量變化的數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，死亡后不同時(shí)間與激素水平之間的依存關(guān)系用多項(xiàng)式回歸方程表示。

2 結(jié)果

2.1 低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩甲狀腺中激素含量的影響

低頻電刺激后0～72 h，中國(guó)樹鼩甲狀腺中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平比對(duì)照組顯著升高，差異有顯著性（P＜0.01)；致死后0 h，電刺激組甲狀腺中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平比對(duì)照組增加了82.76%、78.01%、58.78%；多項(xiàng)式回歸方程統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，甲狀腺組織中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平隨死亡后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。見圖1。

2.2 低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩肝中激素水平的影響

低頻電刺激后0～72 h，中國(guó)樹鼩肝中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平比對(duì)照組顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01)；致死后0 h，電刺激組肝臟中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素含量比對(duì)照組增加了87.05%、87.31%、80.38%；多項(xiàng)式回歸方程統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，肝組織中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平隨死亡后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。見圖2。

2.3 低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩脾中激素水平的影響

低頻電刺激后0～72 h，中國(guó)樹鼩脾中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平比對(duì)照組顯著升高，差異有顯著性（P＜0.01)；致死后0 h，電刺激組脾中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平比對(duì)照組增加了 73.86%、62.32%、45.11%；多項(xiàng)式回歸方程統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，脾組織中內(nèi)皮素、心鈉素、血栓素水平隨死亡后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。見圖3。

圖1 低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩甲狀腺中激素水平的影響（與對(duì)照組比:**P＜0.01)Fig.1 Effect of low frequency electrical stimulation on hormone levels in the thyroid of Chinese tree shrews（**P＜0.01 vs. the control group)

圖2 低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩肝中激素水平的影響（與對(duì)照組比:**P＜0.01)Fig.2 Effect of low frequency electrical stimulation on hormone levels in the liver of Chinese tree shrews（**P＜0.01 vs.the control group)

圖3 低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩脾中激素水平的影響（與對(duì)照組比:**P＜0.01)Fig.3 Effect of low frequency electrical stimulation on hormone levels in the spleen of Chinese tree shrews（**P＜0.01 vs. the control group)

2.4 低頻電刺激對(duì)中腦腹側(cè)背蓋區(qū)c-fos表達(dá)的影響

光鏡發(fā)現(xiàn):低頻電刺激后，中腦腹側(cè)背蓋區(qū)（VTA)細(xì)胞中c-fos表達(dá)陽性細(xì)胞吸光度比對(duì)照組顯著升高（P＜0.05，P＜0.01)。見表1，圖4。

表1 低頻電刺激對(duì)中腦腹側(cè)背蓋區(qū)c-fos表達(dá)的影響（±s，n=10)Tab.1 Effect of low-frequency electrical stimulation on cfos expression in the ventral tegmentalarea of Chinese tree shrew

表1 低頻電刺激對(duì)中腦腹側(cè)背蓋區(qū)c-fos表達(dá)的影響（±s，n=10)Tab.1 Effect of low-frequency electrical stimulation on cfos expression in the ventral tegmentalarea of Chinese tree shrew

注:與對(duì)照組比:*P＜0.05，**P＜0.01。Note.*P＜0.05，**P＜0.01 vs.the control group.

指標(biāo)Index對(duì)照組Control group積分吸光度 12.31±1.4**7.54±1.1平均吸光度 0.21±0.01*0.17±0.02低頻電刺激組Low-frequency stimulation group

圖4 低頻電刺激對(duì)中國(guó)樹鼩中腦腹側(cè)背蓋區(qū)c-fos表達(dá)的影響（×400)Fig.4 Effectof low frequency electrical stimulation on c-fos expression in the ventral tegmental area of Chinese tree shrew（×400)

注:a.對(duì)照組；b.電刺激組。

3 討論

外界環(huán)境刺激能引起中國(guó)樹鼩血象[4］和激素水平[5］的變化，較高濃度的去甲腎上腺素促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞合成并釋放內(nèi)皮素（ET)，ET不僅本身有強(qiáng)烈的縮血管作用，而且增強(qiáng)去甲腎上腺素的縮血管作用[6］，同時(shí)加劇血小板的激活并釋放血栓素（TX)，引起心、腦血管痙攣和血栓形成，造成機(jī)體損傷、發(fā)病甚至猝死。心鈉素（atrial natriuretic factor，ANF)具有強(qiáng)大的利鈉、利尿、舒張血管、降低血壓和對(duì)抗腎素-血管緊張素系統(tǒng)和抗利尿激素作用[7］。心鈉素能對(duì)抗去甲腎上腺素、血管緊張素、5-羥色胺、組織胺和鉀離子所引起的血管收縮反應(yīng)，激活Ca2+-K+離子通道[8］，增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞通透性[9］，使組織和血漿中的cGMP含量增加。運(yùn)動(dòng)可以促進(jìn)心鈉素顆粒的形成和分泌[10］，對(duì)于心血管的穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)起著至關(guān)重要的作用[11］。在急性腦梗死患者中，血清中的心鈉素和血管緊張素II均顯著升高[12］，說明去甲腎上腺素、內(nèi)皮素、血栓素和心鈉素均參與組織器官損傷或猝死過程。社會(huì)環(huán)境壓力在引起縮血管激素釋放的同時(shí)又促進(jìn)心鈉素的形成和分泌，以對(duì)抗或減弱縮血管激素作用，起到保護(hù)機(jī)體的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給予中國(guó)樹鼩電刺激后，臟器中ET、ANF、TX水平均顯著升高（P＜0.01)，中腦腹側(cè)背蓋區(qū)c-fos表達(dá)顯著增強(qiáng)，臟器中激素含量變化與動(dòng)物死亡后時(shí)間具有明顯的時(shí)效關(guān)系，其含量隨死亡后時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。甲狀腺、肝、脾受外界環(huán)境影響較少，便于采樣，適應(yīng)于法醫(yī)病理學(xué)檢測(cè)，其激素含量變化趨勢(shì)可作為法醫(yī)病理學(xué)推斷死亡時(shí)間的參考依據(jù)。

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Effect of low frequencj electrical stimulation on hormone levels in the organs of Chinese tree shrew cadavers

YU Fa-rong1，ZHANG Jing2*，GUO li-rong1，YUWen1，LIAN Xiu-zhen1，XIE Ming-ren1，LIDeng-lou1，ZHANG Shi-shuang1
（1.Key Laboratory of Evidence of Science and Technology Research and Application，Gansu Province（Gansu Institute of Political Science and Law)，Lanzhou 730070，China；2.Gansu Province Disease Control and Prevention Center，Lanzhou 730000，China)

ObjectiveTo study the effect of low frequency electrical stimulation on hormone levels in organs of Chinese tree shrews after death.M ethodsGiving Chinese tree shrews low frequency electrical stimulation.At0 h，3 h，6 h，12 h，18 h，24 h，36 h and 72 h after death，the thyroid，liver，spleen were taken，and the levels of endothelin（ET)，atrial natriuretic factor（ANF)，thromboxane（TX)were determined by RIA method.At 0 h after death，midbrain ventral tegmental area（VTA)of Chinese tree shrews was taken to detect the c-fos expression.ResultsAfter electrical stimulation，ET，ANF，TX levels in the cadaver organs and VTA c-fos expression of Chinese tree shrews were significantly increased than in the control group.The contentswere decreasing with the time after death.ConclusionsLow frequency electrical stimulation can induce the synthesis and release of hormones in organs and c-fos expression in brain tissue of Chinese tree shrews.

Chinese tree shrews；Cadaver；Visceral organs；Hormone；C-fos expression；Electrical stimulation

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0578-04

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.006

2015-08-24

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào):31060283)；國(guó)家社會(huì)科學(xué)基金項(xiàng)目（編號(hào):07BSH054)；甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項(xiàng)目（編號(hào): 145RJIA333)；甘肅省科技支撐計(jì)劃-社會(huì)發(fā)展類項(xiàng)目（編號(hào):1304FKCA082)；甘肅政法學(xué)院重點(diǎn)項(xiàng)目（編號(hào):GZF2014XZDLW18)。

俞發(fā)榮（1959-)，男，博士，研究員。研究方向:法醫(yī)生物學(xué)、社會(huì)環(huán)境壓力對(duì)人類健康的影響、藥理學(xué)和毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)。E-mail:tim9898@163.com.

張璟（1980-)，女，主管技師，研究方向:細(xì)胞生物學(xué)。E-mail:zjxlxmr@126.com.