構建基于熒光多重cPCR的小鼠基因拷貝數檢測方法

晁天柱，李鵬翔，徐福意，李凱，周宇荀，肖君華

（東華大學生物科學與技術研究所，上海 201620)

研究報告

構建基于熒光多重cPCR的小鼠基因拷貝數檢測方法

晁天柱，李鵬翔，徐福意，李凱，周宇荀，肖君華*

（東華大學生物科學與技術研究所，上海 201620)

目的建立基于競爭性聚合酶鏈式反應（competitive polymerase chain reaction，cPCR)小鼠基因拷貝數變異（copy number variations，CNVs)的檢測方法，用于檢測野生小家鼠來源一號染色體替換系群體（population of specific chromosome 1 substitution strains，PCSSs)的CNVs。方法選取小鼠一號染色體上11個CNVs位點，及7、9和X染色體上各1個內對照位點，分別構建克隆質粒為競爭性粒模板，應用cPCR技術，建立熒光通用引物多重cPCR檢測方法。結果多重cPCR方案適用于小鼠一號染色體上11個CNV位點的拷貝數檢測，且能準確檢測X染色體的拷貝數。結論實現小鼠快速、高通量的CNVs檢測，可準確檢測小鼠1號染色體中11個CNV位點的拷貝數變異。

拷貝數變異；競爭性模板；通用熒光引物；cPCR；小鼠

小鼠是多基因復雜性狀研究的重要模式動物，但利用遺傳多樣性缺乏的近交系小鼠只鑒定出小部分基因[1-3］。以具有豐富遺傳多樣性野生小家鼠[4］為供體建立的PCSSs群體，是QTL精確定位、基因鑒定的新策略[5］，是近交系品系的有益補充。但迄今，野生小家鼠和PCSSs群體的CNVs遺傳多態性研究甚少。拷貝數變異 （CNVs)是人[6］和小鼠[7］基因組中一種豐富、重要的的遺傳多態性[8-10］。廣泛研究發現，CNV不僅影響哺乳動物表型差異[11］，同時與許多人類疾病相關[12，13］。在41個近交系小鼠中，已鑒定2096個CNVs，共發現53個與人類疾病相關的基因[14］。且通過解析CNVs多樣性，能揭示近交系小鼠種群歷史，基因功能，指導建立人類疾病模型，并理解CNV發生機制和其潛在的生物功能[14］。

以芯片技術為基礎的CNV檢測方法，雖適用于CNVs的高通量檢測，但其費用高，敏感性、操作性和重復性上存在較大問題[15］。簡單多重熒光PCR方法成功檢測FCGR3A和FCGR3B的拷貝數，卻需要與靶基因相似的內源 DNA重復序列為內對照[16］。結合外源競爭模板的cPCR技術，能夠精確定量DNA，檢測DNA拷貝數[17，18］。質譜與cPCR技術相結合成功定量mRNA，具有極佳的準確性和重復性[19］。而單堿基延伸與cPCR結合的方法，適用于所有序列和基因及基因內相似CNVs，甚至是微小缺失和重復的檢測，但操作繁瑣[15，20］。因此，廉價、簡單的cPCR技術是檢測PCSSs群體CNV多樣性的合適選擇。

本研究以“野生小家鼠來源一號染色體替換系”群體構建過程中的N7代染色體工程小鼠為樣本，利用cPCR技術，根據aCGH檢測結果選擇11個CNVs位點，構建克隆質粒競爭模板及熒光多重cPCR檢測方案，以期實現野生小家鼠來源1號染色體上CNVs的高通量檢測。

1 材料與方法

8周齡SPF級C57BL6/J（B6)小鼠（雌、雄各10只)，體重18～26g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司[SCXK（滬)2012-0002］。動物實驗遵守1988年動物管理條例。實驗在東華大學生物科學與技術研究所屏障動物實驗設施進行[SYXK（滬) 2014-0022］。收集14個PCSSs品系構建過程中的F1和N7代鼠尾組織，-20℃保存備用。

1.2 DNA提取和酶切

DNA提取采用Axygen（愛思進生物技術有限公司)基因組DNA抽提試劑盒。以0.8%瓊脂糖凝膠電泳，全自動紫外與可見光分析儀FR-200A（上海復日科技實驗技術研究所)和NanoDrop 2000c超微量分光光度計（Thermo Fisher Scientific，美國)確定DNA質量和濃度。基因組DNA經限制性內切酶BamHⅠ（NEB)酶切。

1.3 引物設計

利用棋盤法設計通用熒光引物:上游 FAMTTCATCCGTTCGTCCTAC； 下 游: ACAGCGTCAATCTCGTTC。14個位點的DNA序列信息來源于NCBI。所有引物用Oligo6設計，并由上海生物工程技術有限公司合成。圖1A示意引物設計原則，所有cPCR特異引物和質粒構建用特異引物的序列信息，分別見表1和表2。

圖1 檢測位點側翼引物和cPCR原理示意圖Fig.1 Schematic diagram of the primers and cPCR principle

1.4 制備競爭性模板

將嵌合體引物的 PCR產物連接到pMD18-T Vector載體[寶生物工程（大連)有限公司］并轉化到大腸埃希菌。質粒抽提采用SanPrep柱式質粒小量抽提試劑盒（上海生工生物工程技術服務有限公司)。提取的質粒經限制性內切酶HindIII和EcoR I [寶生物工程（大連)有限公司］酶切為線性DNA，以1%的瓊脂糖凝膠電泳和FR-200A確定質量。采用Tiagen（天根生化科技有限公司)質粒小提試劑盒純化酶切質粒，使用NanoDrop 2000c確定酶切質粒的質量和濃度。

表1 11個CNV位點和3個內對照位點的cPCR特異引物Tab.1 The specific primers of 11 CNVs and 3 internal control loci for cPCR

表2 構建競爭性質粒模板的特異引物Tab.2 The primers for the constrution of cloned plasmid competitors

1.5 aCGH分析

周媽的遺像擺在矮柜上，前面還放著一個玻璃瓶，周澤贍（小）踮起腳尖正要把鮮花插在玻璃瓶里，手不小心擋了一下瓶子，瓶子啪的一聲，連同鮮花掉在了地上。

選用SurePrint G3 Bovine CGH Microarray（Agilent)芯片，對樣本進行CNV檢測。用 Agilent Genomic Workbench軟件采集并分析數據。所有微陣列比較基因組雜交（Array-CGH)檢測反應由復旦大學生命科學學院張峰課題組完成。

1.6 兩步法cPCR

特異引物PCR體系（20μL)包括10×PCR buffer（30 mmol/L Mg2+)2μL，dNTP mix（2.5 mmol/L)3μL，上下游引物0.05μm/L，BSA（10 mg/mL)0.28μL，競爭性質粒模板，DNA模板10 ng/μL，Taq DNA Polymerase 0.5 unit。反應條件: 95℃ 2 min；94℃ 30 s，57℃ 90 s，65℃ 60 s，28個循環；68℃ 2 min（圖1B-Step1)。

通用熒光引物PCR體系（5μL)包括10×PCR buffer（30 mmol/L Mg2+)0.5μL，dNTP mix（2.5 mmol/L)0.75μL，上下游引物 0.05μm/L，BSA（10 mg/mL)0.07μL，Taq DNA polymerase 0.5 unit。反應條件:94℃ 30 s，57℃ 90 s，65℃ 60 s，5個循環；68℃ 20 min（圖1B-Step2)。

1.7 毛細管電泳

PCR產物1μL，加入8.6μL的Hi-Di和0.4 μL的DNA分子標準，振蕩混勻變性。通過ABI測序儀3730（Applied Biosystems)分析樣本。用GeneScan Analysis?3.0和 GeneMapper?ID software v3.2軟件分析數據（圖1C)。

1.8 CNV位點拷貝數

每個CNV位點的R值（樣本峰/質粒峰)，通過內對照（7號和19號染色體上的檢測位點)和質控樣本（B6)糾正，最終反映每個CNV位點的拷貝數變異。例圖1C，C位點為內對照，M為檢測位點，相對拷貝數[RR=（SC/NC)/（SM/NM)］，所有值均為3730電泳峰高。質控樣本RR=1.0，檢測樣本RR=1.5。

2 結果

2.1 CNV位點驗證

aCGH檢測結果表明，11個CNV位點全部存在于染色體工程小鼠中。例如，1qE2.1-1qE2.位點，在大新和三門峽 F1代中為重復（圖2A和 B)，1qH2.3-1qH4位點在大新樣本是缺失（圖2C)。cPCR結果顯示，重復為樣本峰高于質粒峰（圖2D)，缺失為樣本峰低于質粒峰（圖2E)。

2.2 多重cPCR檢測方案

11個CNV位點的通用熒光引物多重cPCR檢測方案結果表明，相對質控樣本B6小鼠DNA在目標區段位置cPCR產物樣本峰和質粒峰高度比值，能檢測樣本拷貝數變異。例如圖3中1qE2.1-1qE2.3和1qH2.3-1qH4位點（N1和N2)RR為1，在大新F1樣本中RR分別為0.5和1.5（圖2)。

圖2 aCGH和cPCR結果Fig.2 The results of aCGH and cPCR assays

圖3 通用cPCR方案的分離膠電泳Fig.3 Electrophoretogram of POP-6 products of the versatile cPCR

2.3 N7代樣本檢測

13個品系的N7代樣本檢測結果顯示，有5個CNV位點在60%以上野生小家鼠中具有拷貝數差異，4個 CNV位點具有拷貝數變異的比例小于46%，1個CNV位點和2個內對照位點無拷貝數變異。在44個樣本的 cPCR檢測結果中，Chr.X: 103039160-103039780位點拷貝數差異能準確反映樣本性別。

3 討論

模式動物小鼠是研究遺傳致病因素CNV的重要資源。且在近交系小鼠中，已發現與精神病[21，22］、焦慮[23］等多種復雜疾病相關的 CNVs，促進了小鼠基因組的CNV變異情況的研究。目前CNV檢測方法包括芯片技術、測序技術和PCR技術[24-26］。CGH和SNP芯片技術具有快速、高通量和自動化的優點，但CGH技術難以檢測平衡相互異位及倒位，aCGH技術的敏感性和操作性亟待提高，SNP芯片技術不適用于重復序列和復雜CNV區域。基于測序技術的CNV檢測方法，其速度快、分辨率高、重復性高等優點，但費用高昂。以PCR為基礎的CNV檢測方法中:實時熒光定量PCR技術，通量低，穩定性和準確性不高；多重連接探針擴增技術（multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)，靈敏度和特異性較高，重復性強，檢測不到平衡異位和倒位突變。針對染色體工程小鼠一號染色體上少量CNV位點的檢測，需要一簡便、準確的技術方法。

本研究結果揭示，利用根據低TM值，二級結構的自由能數值△G（單位kcal/mol)＞ -4等原則獲得的通用熒光引物，成功構建的基于熒光通用引物多重cPCR方案，適用于染色體工程小鼠一號染色體11個CNVs的拷貝數檢測工作。染色體工程小鼠在2個位點Chr.19:27915739-27916361和Chr.7:99758205-99758827無拷貝數變異，是合適的內對照位點。

相比于近交系C57BL/6J小鼠，N7代染色體工程小鼠的一號染色體在10個CNV位點具有拷貝數變異，如CNV位點Chr 1:141896999-141897619在13個品系中具有較大拷貝數差異（1-4個重復)，CNV位點Chr 1:175354538-175355160在群體中無拷貝數變異。單一親本起源，導致染色體工程小鼠群體中CNV位點的突變類型一致。而因親本來源不同，致使Chr.1:173496351-173496972和Chr. 1:168146833-168147454位點分別在棗莊1品系N7代群體內和三門峽的F1代與N7代樣本間存在拷貝數差異。三門峽F1代和N7代個體間其余10個CNV位點拷貝數一致無突變發生，說明一般性傳代并不會改變CNV拷貝數。

總之，利用競爭性質粒模板結合通用熒光引物的多重cPCR方法是一種廉價、準確的CNV檢測方案。能準確檢測小家鼠一號染色體上11個CNV位點的拷貝數變異，適用于少量小家鼠樣本的快速、高效的CNV檢測工作。

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Establishment of a universal fluorescentmultiplex cPCR method for detection of copj number variations in m ice

CHAO Tian-zhu，LIPeng-xiang，XU Fu-yi，LIKai，ZHOU Yu-xun，XIAO Jun-hua*
（Institute of Biological Sciences and Biotechnology，Donghua University，Shanghai201620，China)

ObjectiveTo establish a high throughput general multiple competitive polymerase chain reaction（cPCR)detectingmethod of copy number variations（CNVs)for the population of chromosome 1 substitution strains from wild mice.MethodThe selected 14 loci，including 11 CNVs on chromosome 1 and internal control loci on other three chromosmes（Chr 7，Chr19 and Chr X)，were detected based on the universal fluorescentprimermultiple competitive polymerase chain reaction.All specific cloned plasmidswere constructed as competitors.ResultsAltogether 11 CNVswere designed in one panel，and the copy of Chr X accurately reflects the gender.ConclusionsA rapid and high-throughput fluorescentmultiplex cPCR assay is established which can be used for detection of copy number variations on chromosome 1 in mice.

Copy number variations，CNVs；Competitive template；Universal fluorescence primers；cPCR；Mice

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0591-06

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.009

2015-06-19

國家自然科學基金面上項目（編號:31371257)；上海市科委關鍵項目（編號:12140900404)。

晁天柱（1982-)，男，博士研究生，研究方向:醫學分子遺傳學，E-mail:chaotianzhu@126.com

肖君華（1968-)，男，教授，研究方向:醫學分子遺傳學，E-mail:xiaojunhua@dhu.edu.cn