不同劑量異丙酚在新生大鼠不同腦區的分布

王玉潔，韓彬，郭向陽，王軍

（北京大學第三醫院，北京 100191)

研究報告

不同劑量異丙酚在新生大鼠不同腦區的分布

王玉潔，韓彬，郭向陽，王軍*

（北京大學第三醫院，北京 100191)

目的探討新生大鼠異丙酚腹腔麻醉的理想劑量及異丙酚在新生大鼠不同腦區的分布。方法第一部分:將新生大鼠隨機分為5組，分別腹腔注射不同劑量的異丙酚，分別記錄麻醉狀態、維持時間、動脈血氣，比較得出新生大鼠腹腔麻醉的理想異丙酚劑量。第二部分:將新生大鼠隨機分為麻醉組（A組)和鎮靜組（S組)，根據第一部分實驗結果，腹腔注射鎮靜與麻醉劑量的異丙酚，在合適麻醉深度時斷頭法處死大鼠，高效液相色譜法測定大鼠不同腦區異丙酚的濃度。結果25 mg/kg異丙酚腹腔注射可使新生大鼠達到鎮靜狀態，而75 mg/kg則可達到外科滿意的麻醉狀態，并不引起內環境的異常。S組內，丘腦的異丙酚濃度明顯高于其他腦區（P＜0.05)，其余部位間無明顯差異。A組額葉、頂葉皮質異丙酚濃度明顯低于其他腦區，海馬、扣帶回的異丙酚濃度明顯高于其他腦區（P＜0.05)，其他腦區無明顯差異。結論腹腔注射異丙酚是適合新生大鼠的麻醉方法，且當異丙酚劑量不同時，其在不同腦區的分布存在差異。

丙泊酚；麻醉；腦濃度；區域分布；新生大鼠

出生7 d的大鼠處于神經元發育的高峰，是研究神經發育、細胞增殖等常用的實驗模型。實驗動物麻醉是動物實驗中一個重要的環節，在生物研究中，麻醉的安全性和可靠性越來越受到關注[1］。吸入麻醉作用時間短、可控性高，但其需要麻醉箱、麻醉藥物揮發罐、小動物呼吸機等專業的麻醉設施，并且不適合涉及口咽的實驗設計，其使用往往受到限制。注射麻醉（通常是腹腔給藥)與吸入麻醉相比，具有方便快捷、無環境污染等優點，而被廣泛使用。傳統的大鼠注射麻醉藥物是水合氯醛和戊巴比妥，但是二者的作用時間長，麻醉持續時間往往長達數小時[2］，而長時間麻醉會導致低體溫和缺氧的發生而顯著增加嚙齒動物在實驗過程中麻醉相關的死亡率。因此尋找更短效、更安全的動物麻醉藥物，對提高動物實驗結果的科學性與準確性，具有重要意義。本研究以出生7 d（postnatal day 7，P7)的新生大鼠為研究對象，探索異丙酚腹腔注射對新生大鼠麻醉的可行性，以及當注射劑量不同時異丙酚在新生腦的分布情況，為探索異丙酚對發育期腦的影響提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和設備

1.1.1 實驗動物

SPF級SD大鼠80只，7日齡，10～12 g，雌雄各半，購自北京大學實驗動物中心【SCXK（京)2011-0012】，所有無菌操作在北京大學實驗動物科學部屏障動物實驗設施進行【SYXK（京)2011-0039】。

1.1.2 設備

便攜血氣分析儀（OPTI Medical Systems，美國)、血糖儀（Life Scan Inc.，美國)、Cadwell Cascade Elite便攜電生理檢測儀及監測程序（美國Cadwell公司北京分公司)、BL-420生物機能實驗系統（成都泰盟科技公司)、Agilent1100高效液相色譜儀，熒光檢測器、Chemstatio色譜工作站、Agilent Eclipse XDB C18柱色譜柱（150 mm×4.6mm，5μm)，高速離心機（Eppendorf公司)、漩渦振蕩器（江蘇麒麟醫用儀器廠)、電子天平（上海精科)、-80℃冰箱（日本Sanyo公司)。

1.1.3 試劑

1%異丙酚（阿斯利康，意大利)、脂肪乳劑（江蘇華瑞)、異丙酚標準品（分析純，USP公司，美國)、麝香草酚（Sigma公司，美國)、甲醇（Fisher公司，美國)、乙腈（Fisher公司，美國)。

1.2 方法

1.2.1 新生大鼠腹腔麻醉的理想異丙酚劑量的測定

由于目前尚缺乏新生大鼠腹腔注射異丙酚的理想麻醉劑量的文獻報道，本研究首先進行新生大鼠腹腔麻醉的理想異丙酚劑量的探索。

60只P7大鼠隨機分為5組（n=12)，體重、性別無組間差異。實驗組的P1組、P2組、P3組、P4組分別腹腔單次注射不同劑量的1%異丙酚（25，50，75，100 mg/kg)，對照組（C組)則不注射異丙酚。腹腔注射穿刺點選擇下腹正中線臍旁，1 mL注射器、25G針頭，向頭傾斜45°方向給藥后旋轉拔出，每30 s做一次翻正反射實驗（大鼠無法自行翻正定義為翻正反射消失，此時認為大鼠達到鎮靜狀態)。藥物注射后，每1 min做一次退避反射實驗（針刺右下肢拇指、食指之間的足掌區域，無肢體收縮定義為退避反射消失，此時認為大鼠達到麻醉狀態)，直至反射恢復。將大鼠置于墊料鋪蓋、氧氣濃度50%的恒溫箱中。根據文獻報道，記錄麻醉狀態的各時間點[3］（表1)，其中腹腔注射異丙酚的時刻為T0，翻正反射消失時刻為T1，退避反射消失時刻為T2，退避反射恢復時刻為T3，翻正反射恢復時刻為T4。翻正反射消失所需時間定義為麻醉誘導時間，退避反射消失所需時間定義為獲得外科麻醉所需時間，退避反射消失至恢復的時間間隔定義為外科麻醉時間，大鼠翻正反射消失至恢復的時間間隔定義為麻醉總時間。如果在異丙酚腹腔注射30 min后，大鼠的翻正反射仍未消失，則將大鼠放回籠中，并由另一名不清楚注射劑量的研究者觀察動物2 h，判斷是否有其他異常行為出現。

大鼠麻醉后，將其頭側向一遍，以減少麻醉后舌根后墜引起的上呼吸道梗阻。觀察大鼠的皮膚顏色，如果出現皮膚蒼白、紫紺，則給予大鼠翻身刺激。每組隨機抽取5只大鼠在退避反射消失后，立刻剖胸，穿刺左心室取血2 mL，測量動脈血氣、血糖。能夠使新生大鼠達到外科麻醉狀態、不引起血氣異常、不導致死亡的異丙酚劑量即為理想的異丙酚劑量。

1.2.2 異丙酚在新生大鼠不同腦區的分布

20只P7大鼠，體重10～12 g，雌雄各半，隨機分為鎮靜組（S組)和麻醉組（A組)（n=10)，性別、體重無組間差異。

根據第一部分實驗，給予腹腔注射適合麻醉劑量的異丙酚。S組待翻正反射消失，A組待退避反射消失后，立刻斷頭取全腦組織。嚴格無菌條件下專人解剖鼠腦，取額葉、頂葉、顳葉、海馬、扣帶回、丘腦、中腦、橋腦和小腦組織。分別稱重后置于勻漿機中，加入乙腈500μL，充分勻漿5 min，10 000 r/min離心10 min，取上清液于EP管中4℃下保存備用。

表1 麻醉時間點評定Tab.1 Assessment of anesthetic intervals

采用高效液相法測量各腦區異丙酚的濃度[4］。外標物為異丙酚標準品（分析純，USP公司，美國)，內標為麝香草酚（Sigma，美國)。使用Agilent 1100高效液相色譜儀，熒光檢測器及Chemstation色譜工作站，色譜柱為Agilent Eclipse XDB C18柱（150 mm ×4.6 mm，5μm)。流動相為甲醇（Fisher，Lot No: 140400，美國)/水=72/28，自動進樣20μL，柱溫4℃，流速1.0 mL/min。吸收波長276 nm，發射波長310 nm。

1.3 統計學處理

采用SPSS 20.0統計軟件包，劑量資料以均數±標準差（±s)表示。不同標本異丙酚濃度采用完全隨機設計資料的方差分析（One-way ANOVA)。P＜0.05認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 新生大鼠異丙酚麻醉的理想劑量

如表2、3，全部大鼠翻正反射均消失，即所有大鼠均達到鎮靜狀態。其中P1組大鼠未出現退避反射消失，維持鎮靜時間為（25±4.6)min，動脈血氣結果與對照組相比無統計學差異。P2組一半的大鼠退避反射消失，外科麻醉持續時間為（10±3.3) min，麻醉總時間為（34±3.8)min，動脈血氣結果與對照組相比無統計學差異。P3組全部大鼠退避反射消失，外科麻醉持續時間為（25±2.8)min，麻醉總時間為（57±5.2)min，動脈血氣pH值與對照組相比降低，但無大鼠死亡。P4組全部大鼠退避反射消失，外科麻醉持續時間為（40±2.9)min，麻醉總時間為（84±6.3)min，與對照組相比，pH值、氧分壓顯著降低，二氧化碳分壓、乳酸顯著增高，并有6只大鼠死亡。即，25 mg/kg異丙酚腹腔注射可使新生大鼠達到鎮靜狀態，而75 mg/kg則可達到外科滿意的麻醉效果。

2.2 不同劑量異丙酚在新生大鼠的腦區分布

根據第一部分實驗結果，S組大鼠腹腔注射鎮靜劑量異丙酚（25 mg/kg)，A組大鼠注射麻醉劑量異丙酚（75 mg/kg)。高效液相法測定結果顯示:S組內，丘腦的異丙酚濃度為（4.27±0.21)μg/g，明顯高于其他腦區（P＜0.05)，其余部位間無明顯差異。A組額葉、頂葉皮質異丙酚濃度明顯低于其他腦區，海馬、扣帶回的異丙酚濃度明顯高于其他腦區（P＜0.05)，其他腦區無明顯差異（表4)。

表2 新生大鼠腹腔注射不同劑量異丙酚的麻醉時間比較（±s，n=12)Tab.2 Anesthetic intervals of the neonatal rats at different dose of propofol injected intraperitoneally

表2 新生大鼠腹腔注射不同劑量異丙酚的麻醉時間比較（±s，n=12)Tab.2 Anesthetic intervals of the neonatal rats at different dose of propofol injected intraperitoneally

麻醉總時間/min T4-T1對照組C 0 0 - - - - -實驗組P1 0 0 7±2.2 - - - 25±4.6實驗組P2 6 0 5±1.8 2±0.9 10±3.3 10±3.5 34±3.8實驗組P3 12 0 3±1.1 1±0.5 25±2.8 18±3.7 57±5.2實驗組P4 12 6 1.2±0.3 0.4±0.2 40±2.9 30±4.2 84±6.3組別Groups退避反射消失數量Number of loss of PWR死亡只數Number of death麻醉誘導時間/min T1-T0獲得外科麻醉時間/min T2-T1外科麻醉持續時間/min T3-T2麻醉恢復時間/min T4-T3

表3 新生大鼠腹腔注射不同劑量異丙酚的血氣分析（±s，n=5)Tab.3 Blood gas analysis of the neonatal rats at different dose of propofol injected intraperitoneally

表3 新生大鼠腹腔注射不同劑量異丙酚的血氣分析（±s，n=5)Tab.3 Blood gas analysis of the neonatal rats at different dose of propofol injected intraperitoneally

注:*與CON組相比，P＜0.05。Note.*Compared with the control group.

組別Groups pH值pH二氧化碳分壓PCO2/mmHg氧分壓PO2/mmHg血糖Glucose /mmol/L乳酸Lactate /mmol/L碳酸氫根HCO3-/mmol/L對照組Group C 7.39±0.11 41±2.32 90.3±3.15 7.4±1.91 2.47±0.37 25±1.21 P1組Group P1 7.36±0.12 43±2.64 89±2.84 7.93±1.52 3.03±0.24 22.67±2.10 P2組Group P2 7.31±0.13 41±2.22 88.3±4.12 6.8±1.44 2.7±0.24 25±2.17 P3組Group P3 7.28±0.11*42.3±2.94 88.3±3.95 7.77±2.41 2.77±0.12 23.3±1.89 P4組Group P4 7.18±0.13*52.9±2.51*70.6±4.14*8.17±1.46 4.3±0.21*23±1.75

表4 異丙酚在新生大鼠腦區分布（±s，μg/g，n=10)Tab.4 Distribution of propofol in different regions of brain of the neonate rats

表4 異丙酚在新生大鼠腦區分布（±s，μg/g，n=10)Tab.4 Distribution of propofol in different regions of brain of the neonate rats

注:*組內比較，P＜0.05。Note.*Compared within the same group.

腦區Brain regions麻醉組Group A額葉Frontal lobe 2.92±0.31 4.65±0.17*頂葉Parietal lobe 2.43±0.24 4.49±0.21*顳葉Temporal lobe 2.51±0.17 8.26±0.22海馬Hippocampus 2.85±0.14 10.61±0.18*扣帶回Cingulate 2.63±0.27 12.87±0.15*丘腦Thalamus 4.27±0.21*4.52±0.31*中腦Midbrain 2.44±0.28 8.03±0.25橋腦Pons 2.88±0.14 8.96±0.16小腦Cerebellum 2.74±0.23 8.94±0.12鎮靜組Group S

3 討論

異丙酚，化學名稱2，6二異丙基苯酚，是一種惰性的酚類衍生物，由于其具有起效快、時效短、無明顯蓄積、蘇醒迅速、蘇醒后意識清晰、惡心嘔吐等不良反應少等優點，是臨床上最常見的靜脈麻醉藥。已經有研究發現，成年大鼠腹腔注射異丙酚（100 mg/kg)、右美托咪定（0.1 mg/kg)、芬太尼（0.1 mg/ kg)可以產生25 min的外科可操作時間，并且麻醉蘇醒迅速，顯示出異丙酚麻醉的安全可靠性[3］。翻正反射及退避反射，是常用的評估實驗動物麻醉狀態的刺激方法。在本研究中，通過麻醉狀態評估，我們觀察到25 mg/kg的異丙酚腹腔注射，可使全部新生大鼠翻正反射消失，達到滿意的鎮靜效果；而75 mg/kg的異丙酚則能使大鼠對疼痛刺激無反應，達到外科滿意的麻醉效果。相比觀察大鼠的膚色、呼吸情況，動脈血氣分析可以更直接地反映實驗動物的氧和狀態及內環境情況。在本研究中，25 mg/kg的異丙酚腹腔注射后，大鼠的pH值、氧分壓、二氧化碳分壓、乳酸濃度及血糖濃度與對照組相比無明顯差異，表明該劑量異丙酚對內環境影響較??；而75 mg/kg的異丙酚腹腔注射后，大鼠的pH值降低，提示大鼠出現了輕微的酸中毒。麻醉狀態評估結合血氣分析結果，進一步表明當劑量合適時，異丙酚可以安全地用于新生大鼠的鎮靜及麻醉。

關于靜脈麻醉藥異丙酚腦攝取的研究主要采用質量平衡法則，通過對腦動、靜脈血異丙酚濃度的測定和計算，可間接了解異丙酚的全腦攝取。此方法對了解異丙酚全腦攝取概況有一定的幫助，但由于不能直接測定不同腦組織的實際異丙酚攝取量，也就不能反映異丙酚在腦內不同區域的攝取和分布。本實驗直接測定不同區域腦組織的異丙酚濃度，可以更直觀地反映異丙酚在不同腦區分布的實際情況。高效液相法的測定結果表明，當達到麻醉效應時，異丙酚在大鼠不同腦區的分布不同。Fisel等[5］比較了不同劑量的異丙酚麻醉下，患者各腦區血流量變化及相應的行為學改變，發現受試者的意識狀態與丘腦、中腦、基底前腦以及枕頂聯合皮質部位血流量的降低存在顯著的直線相關關系:低劑量時受試者對振動、觸覺的反應消退，但意識仍清醒，此時軀體感覺皮質血流量降低，皮層下結構丘腦和中腦的血流量無顯著性改變；而應用中等劑量的異丙酚時，振動刺激所引起的所有皮層上相關腦區的興奮被完全抑制；當劑量加大到受試者意識消失時，丘腦和中腦的血流降低?；谝陨涎芯?，我們推測，異丙酚腦區分布的差別，與異丙酚的麻醉機制有關。本實驗采用的25 mg/kg異丙酚相當于低劑量，此時皮層相關腦區的興奮受到抑制，而丘腦的血流量無顯著變化，血流量絕對值高于其他腦組織。75 mg/kg異丙酚相當于大劑量，此時丘腦、額頂葉的異丙酚含量最少，也與全腦的代謝均降低，尤其以丘腦皮層和額頂葉的網狀結構最為顯著，血流量相對最少[6］的生理變化相一致。

由于異丙酚其具有起效快、持續時間短、可控性強、無環境污染等優點，在成人麻醉中應用十分廣泛。許多臨床試驗和動物研究都表明，在成年動物中，異丙酚可以通過減輕氧化應激反應、阻斷線粒體凋亡途徑、減輕鈣離子內流等作用，具有一定的神經保護作用[7］；然而在新生兒中，異丙酚卻表現出明顯的神經毒性，其可能導致術后認知功能障礙、神經干細胞的凋亡，甚至是長期的記憶力損傷[8］。但由于缺乏大規模的多中心臨床研究，異丙酚在小兒麻醉中使用的安全性，尚存在較多爭議。另外，異丙酚對神經系統這種與年齡相關的藥效差異，除了可用新生神經細胞較脆弱，更容易受到外界的影響和傷害解釋外，是否與異丙酚在發育期腦的分布不同于成年腦，比如在神經干細胞分布較多的側腦室的室管膜下層和海馬齒狀回的顆粒下層分布更多有關，從而對海馬產生更強毒性，最終導致神經認知功能障礙，目前尚不清楚，也缺乏相關報道。已經有研究發現，給予成年大鼠腹腔注射異丙酚達到麻醉狀態后，異丙酚在海馬的分布最少[9］。而本研究發現，異丙酚在新生大鼠海馬中的含量也較高。造成這種差異的原因可能為:異丙酚的藥代動力學與年齡相關、海馬的異丙酚受體數量或親和性與年齡相關。Larsson等[10］采用異丙酚麻醉20只幼年大鼠和老年大鼠，解剖得到其皮質、海馬、腦干、中腦、血漿、肌肉、脂肪組織，采用高效液各組織內異丙酚的含量，發現異丙酚在大鼠體內呈指數下降，下降速率幼年大鼠慢于老年大鼠。隨后，Larsson[11］又增加了大鼠數量及年齡跨度，發現異丙酚的誘導劑量與年齡相關，幼年大鼠誘導劑量較大，老年大鼠對異丙酚敏感性增加，所需誘導劑量較小，兩者的差別是由于藥代動學的差別而不是藥效動力學的差別造成的。也有研究表明，側腦室的室管膜下層和海馬齒狀回的神經干細胞分布較多[12］。根據這些結論，我們推測，由于新生大鼠的海馬所含異丙酚受體更多或者對異丙酚的親和力更強，導致異丙酚更多地聚集于海馬，而對發育期大腦產生了神經毒性。但這種推測仍需要進一步的研究提供證據。

綜上所述，腹腔注射異丙酚是新生大鼠理想的麻醉方法，尤其適用于需要較短時間麻醉的實驗操作，在不同麻醉深度下不同腦區對異丙酚的攝取不同。25 mg/kg可以達到滿意的鎮靜效果，此時丘腦和腦干攝取最多；75 mg/kg可以達到滿意的麻醉效果，此時丘腦、額頂葉皮質含量較少，海馬相對較多，與異丙酚在成年大鼠的腦區分布存在較大差異。這些結果為探索異丙酚對發育期腦的影響提供了一定的參考依據。

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Regional distribution of propofol at different doses in the brain during propofol anesthesia in neonatal rats

WANG Yu-jie，HAN Bin，GUO Xiang-yang，WANG Jun*
（Peking University Third Hospital，Beijing，100191，China)

ObjectiveTo investigate the proper dose of propofol injected intraperitoneally（i.p.)in neonatal rats and to study the regional distribution of propofol at different doses in the neonatal brain.M ethodsPart I:Sixty postnatal 7-day-old ratswere randomly divided into 5 groups，which received different doses of propofol injected i.p.The behavior，anesthetic intervals and arterial blood gas were recorded.Part II:Twenty neonatal rats were random ly divided into 2 groups:anesthesia group（group A)and sedation group（group S)，and were injected propofol i.p.at the proper dose according to the results of Part I.Rats were decapitated when they reached the ideal anesthesia depth.The regional concentration of propofol in different regions of the brain was examined by high performance liquid chromatography.Results25 mg/kg propofol i.p.was the sedate dose for neonatal rats，while 75 mg/kg i.p.was the anesthetic dose.In the group S，the concentration of propofol in the thalamus was significantly higher than in other regions（P＜0.05)，while in the group A，the concentrations of propofol in the frontal and parietal cortex were obviously lower，and the concentrations of propofol in the hippocampus and cingulate gyruswere obviously higher than that in other regions（P＜0.05).ConclusionsPropofol is a suitable anesthetic for neonatal rats and its distribution in the brain is quite differentwhen given at different doses.

Propofol；Anesthesia；Brain concentration；Regional distribution；Neonatal rats

Q95-33

A

1005-4847（2015)06-0602-05

10.3969/j.issn.1005-4847.2015.06.011

2015-07-05

國家自然科學基金資助項目（編號:21342016)。

王玉潔（1987-)，女，博士研究生，研究方向:麻醉藥藥理，圍術期器官保護，E-mail:liuer510@163.com。

王軍（1965-)，男，碩士生導師，研究方向:麻醉藥理，脊髓保護，E-mail:luckyoldhorse@sina.com。